Un possibile modello Zebrafish della malattia del rene policistico: Knockdown di Wnt5a Provoca cisti in Zebrafish Reni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare un possibile modello di zebrafish di malattia del rene policistico. Ciò si ottiene iniettando morph contro Wind five A in embrioni transgenici di pesce zebra WT uno BGFP allo stadio di una cellula. Successivamente, viene eseguito un esperimento di salvataggio mediante microiniezione di topo Wint five A Mr.Nna, con il Wint five a morpho.

Quindi gli embrioni iniettati vengono anestetizzati e incorporati a 48 e 72 ore dopo la fecondazione per monitorare la struttura renale e la formazione di cisti. Dopo il knockdown del vento cinque A, i risultati mostrano che il knockdown del vento cinque A provoca la formazione di cisti renali prone nel pesce zebra transgenico WT one BG FP sulla base della microscopia a fluorescenza delle strutture renali prone. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la costruzione di un modello di malattia renale perché la trasparenza dell'embolo di pesce coperto con l'uso di proteine fluorescenti specifiche per i reni transgeniche consentono una visione diretta delle strutture renali in un organismo AL.

Questo metodo può fornire informazioni su win five a knockdown che causa la formazione di cisti renali di pesce zebra. Può anche essere applicato per testare molti altri geni che si sospetta causino la formazione di cisti renali. Questo protocollo è semplice e richiede meno tempo.

Dopo aver progettato e sintetizzato morphos secondo le istruzioni del produttore, aggiungere acqua sterile di alta qualità alle bottiglie di vetro per risospendere completamente fino a una concentrazione finale di 25 microgrammi per microlitro. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la concentrazione e conservare la soluzione madre a temperatura ambiente il giorno dell'iniezione, utilizzare acqua sterile di alta qualità per diluire il morphos alla concentrazione desiderata e allo 0,5% di rosso fenolo a una concentrazione finale dello 0,05%Quindi accendere il compressore d'aria e regolare l'impostazione della pressione su 50 si. Quindi accendere la sorgente luminosa del microscopio da dissezione e la pompa di microiniezione pico e regolare le impostazioni come segue.

Utilizzare cinque microlitri di soluzione iniettabile per caricare un ago di vetro pre-estratto e posizionare l'ago in posizione verticale con la punta rivolta verso il basso quando non ci sono bolle d'aria visibili, inserire l'ago nel supporto. Regolare l'angolo di iniezione a 45 gradi. Portare la punta dell'ago in vista al microscopio, in alto rispetto al tavolino, e mettere a fuoco la regione più sottile della punta.

Quindi usa una pinzetta a punta fine per rompere l'ago. Punta, posizionare un tubo capillare con un diametro interno di 0,15 millimetri sotto il microscopio. Iniettare la soluzione in un'estremità.

Regolazione del tempo di espulsione sulla pompa di microiniezione pico fino a quando 17 gocce formano una colonna di liquido, lunga un millimetro. Questo rende il volume di ogni goccia pari a un nanolitro. Impostare coppie di riproduzione di pesci zebra transgenici WT one BG FP secondo i protocolli pubblicati per l'allevamento e il mantenimento standard del pesce zebra.

Dopo una deposizione naturale, raccogli gli embrioni e trasferiscili in una capsula di Petri con acqua E tre. Utilizzando gli embrioni tra lo stadio da una a quattro cellule, trasferirli in una capsula di Petri di 10 centimetri con trogole a forma di cuneo. Dopo aver aspirato il terreno, premere delicatamente gli embrioni nelle mangiatoie Sotto il microscopio da dissezione, orientare gli embrioni per visualizzare la cellula.

Quindi con l'ago da iniezione penetrare il Corian e poi il tuorlo per iniettare una o due gocce di morpho nel tuorlo. Trasferire gli embrioni iniettati in una capsula di Petri di 10 centimetri con acqua E tre e incubare a 28,5 gradi Celsius. Registra il numero di embrioni iniettati vitali per eseguire un esperimento di salvataggio del fenotipo.

Seleziona un log ortopedico da un gene di un'altra specie che ha una diversa struttura di coppia di basi primarie che è quindi resistente al morfo. In questo esempio, il mouse è andato cinque A è stato scelto. Progetta un set di primer con il primer diretto a partire dal sito di inizio della traduzione e il primer inverso vicino alla fine della regione del codice MR NA.

Aggiungere una sequenza di promotori T sette all'estremità dei cinque primi della sequenza di primer in avanti con i primer e un microgrammo di DNA stampo contenente il vento del topo. Cinque sequenze A-C-D-N-A. Impostare una reazione PCR da 50 microlitri ed eseguirla utilizzando il programma mostrato qui.

Dopo aver verificato le dimensioni del prodotto PCR, averlo purificato e controllato la concentrazione, utilizzare un kit di sintesi di RNA con cappuccio per sintetizzare l'mRNA con cappuccio in vitro. Secondo le istruzioni del produttore, utilizzare 20 microlitri di acqua libera da RNA per diluire l'MR NA e determinare l'aliquota di concentrazione e conservare l'RNA a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius il giorno dell'iniezione. Preparare una soluzione funzionante di MR NA che fornisca una dose di 40 picogrammi o inferiore per evitare effetti aspecifici o tossici per l'embrione.

Mantenendo la soluzione di MNA sul ghiaccio, iniettare morfosi e poi mRNA negli embrioni o co-iniettare le soluzioni. Il giorno successivo, rimuovi gli embrioni morti e controlla che gli embrioni abbiano subito gas. Quindi aggiungere lo 0,003% di fenil THREA o PTU all'acqua E tre per prevenire il melone a 48 ore dopo la fecondazione.

Utilizzare una pinzetta sottile per rivestire manualmente gli embrioni prima di utilizzare un microscopio da dissezione per scattare immagini immediatamente e a 72 ore dopo la fecondazione circa 10 minuti prima dell'imaging con un microscopio a fluorescenza, anestetizzare gli embrioni mettendoli in una piastra di Petri da 10 centimetri contenente 160 microgrammi per microlitro di trica tamponata. Utilizzare il 3% di metilcellulosa per montare gli embrioni e, al microscopio da dissezione, orientarli in posizione prona. Quindi utilizzando un'immagine con ingrandimento 10 volte e 20 volte.

Gli embrioni al microscopio a fluorescenza avvolgono cinque Un knockdown è stato ottenuto introducendo un morfo che blocca la traduzione, chiamato anche morfo UG o morfo di splicing del bordo introduttivo dell'esone, chiamato anche morfo di splicing agli embrioni di zebrafish. Allo stadio di una cellula, il morfo A UG prende di mira il codone iniziale e quindi inibisce sia l'espressione materna che quella zigotica di win five a. Il morph di splicing si rivolge al terzo sito donatore di splicing e inibisce solo la trascrizione zigotica di win five A Come dimostrato qui, il fenotipo A UG e le morfine di splicing si sono copiate a vicenda con molteplici difetti tra cui la coda riccia, l'asse del corpo verso il basso e l'edema pericardico.

Questa figura mostra che il topo è andato cinque un mRNA salva parzialmente il fenotipo morph, dimostrando che non è dovuto agli effetti fuori bersaglio mostrati qui. Il pesce transgenico WT one BGFP esprime la GFP guidata dal promotore WT one B e ne delinea la struttura profica. Il pesce ha mostrato la formazione di cisti glomerulari dopo il vento cinque un abbattimento a 48 ore dopo la fecondazione.

Il pesce di controllo iniettato solo con rosso fenolo ha mostrato un normale sviluppo frico prono formando glomerulari fusi a forma di U con tubuli che si estendono lateralmente a 72 ore dopo la fecondazione. Le strutture glomerulari si sono ulteriormente sviluppate con anse vascolari e sia l'A UG che gli embrioni iniettati con morfo di splicing hanno sviluppato cisti nei glomeruli e nelle tube prossimali, come si vede in questa figura Colorazione HNE delle sezioni istologiche trasversali di 72 ore dopo la fecondazione, gli embrioni morant hanno rivelato la formazione di cisti, strutture glomerulari interrotte e tubi renali dilatati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare un possibile modello di fase gery della malattia renale cistica abbattendo l'invecchiamento del vento e osservare la formazione del sistema con la linea del viso del rapporto sull'influenza.

Una volta dimostrato che la mutazione genetica provoca la formazione di cisti renali nel pesce zebra, possono essere condotti ulteriori esperimenti per studiare i meccanismi dettagliati della formazione di cisti renali.