Un ibrido metodo di estrazione del DNA per la valutazione delle comunità batteriche qualitativa e quantitativa di pollame campioni di produzione

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di sviluppare una nuova tecnica di estrazione del DNA che combini l'omogeneizzazione meccanica del DNA con la rimozione degli inibitori della PCR e il metodo di estrazione somatica e gold standard su campioni ambientali lungo il continuum di produzione avicola. Ciò si ottiene dividendo prima un campione ambientale in provette da microcentrifuga contenenti una miscela di perle per omogeneizzare efficacemente i campioni ambientali complessi. Il secondo passo consiste nel posizionare le provette in un omogeneizzatore ad alta potenza per rilasciare in modo efficiente gli acidi nucleici dalle cellule batteriche e dalla matrice ambientale.

Successivamente, l'omogenato viene utilizzato come materiale di partenza per il metodo di estrazione enzimatica del DNA gold standard attraverso la fase di legame con inibizione PCR. Il passaggio finale consiste nel posizionare i campioni in una stazione di lavoro robotica per l'estrazione del DNA per fornire all'utente campioni di DNA estratti suscettibili di una serie di applicazioni a valle, in ultima analisi, la PCR quantitativa e l'analisi del microbioma utilizzando la piattaforma MiSeq in alluminio, sono stati utilizzati per dimostrare che questo nuovo metodo ibrido fornisce la migliore combinazione di valutazioni qualitative e quantitative delle comunità batteriche totali rispetto all'elaborazione dei campioni con il metodo di estrazione meccanica o enzimatica solo. Questo metodo fornisce informazioni sull'analisi delle comunità microbiche lungo il continuum di produzione avicola, ma può essere applicato anche ad altri sistemi agricoli come i bovini suini o la produzione di colture che contengono campioni ambientali altrettanto complessi.

A dimostrare questa procedura oggi sarà Kaitlyn Griffin, una studentessa del mio laboratorio. Per iniziare l'esperimento, impostare un bagno d'acqua a 95 gradi Celsius. Successivamente, pesare tre repliche da 0,33 grammi per analizzare un totale di un grammo di temperatura ambiente, terreno o materiale fecale in una matrice di lisi da due millilitri di guanti per la sostituzione della provetta ET tra i campioni.

Aggiungere 825 microlitri di tampone fosfato di sodio e 275 microlitri di soluzione di prelisi o PLS in una provetta per campioni. Quindi agitare i campioni per 15 secondi dopo la miscelazione, centrifugare le provette a 14.000 Gs per cinque minuti. Decantare il surnatante e aggiungere 700 microlitri di tampone A SL. Quindi agitare il tubo per cinque secondi.

Aprire un tubo alla volta per evitare contaminazioni. Quindi, assicurarsi che vi sia uno spazio di testa del 10% del volume totale nella provetta conica prima di inserire i campioni nello strumento Fast Prep 24. Omogeneizzare i campioni a una velocità di sei metri al secondo per 40 secondi.

Si noti la differenza tra la preparazione rapida 24 e il vortice dopo l'omogeneizzazione. Centrifugare il campione a 14.000 g per cinque minuti. Trasferire il surnatante in una provetta sterile da microcentrifuga da due millilitri al campione rimanente nella provetta ET della matrice di lisi con ulteriori 700 microlitri di tampone SL, omogeneizzare e centrifugare.

Utilizzando le impostazioni precedenti, posizionare clip di bloccaggio in plastica sulle provette del campione per assicurarsi che non si aprano e incubare i surnatanti in un bagno d'acqua a 95 gradi Celsius per cinque minuti. Quindi, aprire ogni provetta per microcentrifuga per rilasciare la pressione, richiudere le provette e farle vorticare per 15 secondi. Centrifugare i campioni a 14.000 GS per un minuto.

Dopo la centrifugazione, trasferire 1,2 millilitri di surnatante in una provetta sterile da microcentrifuga da due millilitri. Quindi posizionare il blister contenente la linguetta direttamente sopra la provetta aperta della microcentrifuga e spingere delicatamente la linguetta fuori dal blister nella provetta. Per evitare il contatto tra la linguetta di inibizione X e la provetta, aggiungere una linguetta di inibizione X a ciascun campione.

Quindi, agitare le provette fino a quando i campioni non si trasformano in un liquido uniformemente biancastro. Incubare i campioni per un minuto a temperatura ambiente e centrifugarli a 14.000 formaggi per cinque minuti, evitando le particelle residue sul fondo delle provette. Trasferire tutto il liquido in una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Quindi centrifugare le provette alla massima velocità per cinque minuti. Prima di iniziare la purificazione automatizzata del DNA, assicurarsi che la stazione di lavoro contenga la quantità appropriata di puntali e tamponi filtranti. Quindi, aggiungere le provette elliane e le provette filtranti agli adattatori del rotore e aggiungere 400 microlitri di ciascun campione nella fessura centrale dell'adattatore del rotore.

Posizionare gli adattatori del rotore nella centrifuga della workstation e assicurarsi che tutti i coperchi delle provette della microcentrifuga siano fissati correttamente all'interno dell'adattatore del rotore. Aggiungere la soluzione di proteinasi K a una provetta sterile da microcentrifuga da 1,5 millilitri e posizionarla nella fessura A della stazione di lavoro. Aggiungere due provette per microcentrifuga con blocco di sicurezza da un millilitro alla sezione dell'agitatore della postazione di lavoro e assicurarsi che i coperchi delle provette del campione siano posizionati in modo sicuro.

Utilizzando il touch screen sulla workstation, selezionare il protocollo di rilevamento dei patogeni delle feci umane delle feci del DNA e leggere le schermate successive per assicurarsi che la workstation sia stata caricata correttamente. Una volta superate tutte le schermate di controllo, selezionare Avvia per eseguire il protocollo. Quindi rimuovere i campioni dagli adattatori del rotore.

Combinare le tre purificazioni replicate per un singolo campione utilizzando un sistema basato su centrifugazione ed evaporazione. Eluire nuovamente il campione fino a un volume finale di 100 microlitri con tampone tris EDTA. Infine, tappare i campioni e posizionarli a meno 20 gradi Celsius fino a quando non sono necessari per l'analisi a valle.

Questo grafico dimostra che il metodo meccanico ha costantemente fornito le stime di abbondanza genica normalizzata batterica totale più alte per campioni fecali e di figliata. Il metodo enzimatico aveva le stime più basse in tutti i casi. Il nuovo metodo di estrazione ibrida ha prodotto la migliore combinazione di stime qualitative e quantitative della comunità batterica totale.

Dei tre metodi di estrazione testati. Ora dovresti avere una migliore comprensione di come eseguire questo nuovo metodo di estrazione del DNA ibrido semi-automatizzato e vedere la sua utilità nella valutazione qualitativa e quantitativa delle comunità microbiche da campioni ambientali complessi.