Microscopia a forza atomica di Red-Light Fotorecettori Uso della mappatura PeakForce Quantitative nanomeccanico Proprietà

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere immagini ad alta risoluzione delle proteine dei fotorecettori utilizzando la microscopia a forza atomica. Ciò si ottiene prelevando prima un campione del fotorecettore e diluindolo. Il secondo passo consiste nell'applicare il campione di proteine su una superficie di mica appena tagliata e pulita per circa 30 secondi.

Quindi la MICA viene risciacquata con un tampone per rimuovere le molecole non legate e attaccate liberamente. Successivamente, il campione viene collegato a una cella liquida dotata di una sonda appropriata. Questo gruppo viene caricato sullo scanner.

Dopo aver riempito la cella liquida con la soluzione tampone, agganciare la punta con il campione e iniziare la scansione. In definitiva, la microscopia a forza atomica incorpora la forza di picco. La mappatura quantitativa delle proprietà nanomeccaniche viene utilizzata per raccogliere immagini di singole proteine fotorecettrici sulla superficie del campione.

La microscopia a forza atomica che incorpora la forza di picco q e m può rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare, come ad esempio quali sono le importanti caratteristiche strutturali e chimiche che determinano la funzione delle macromolecole biologicamente attive. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi attuali come la risonanza magnetica mobile e la cristallografia a raggi X è che le immagini ad alta risoluzione di proteine intatte e altre macromolecole biologiche possono essere ottenute in un ambiente biologicamente rilevante. In generale, le persone che sono nuove a questo metodo hanno difficoltà perché la messa a punto della sonda e della soluzione richiede più passaggi, alcuni dei quali sono piuttosto complessi.

Con il picco di forza q e m e il software automatizzato, molti di questi passaggi sono resi più semplici, rendendo così il processo molto più semplice per i nuovi utenti e gli studenti universitari. A dimostrare questa procedura saranno tre studenti universitari del mio laboratorio di ricerca, Marie Kroger, Blair Sorenson e Jessica Thomas. Questi studenti proseguiranno gli studi universitari nei campi della microbiologia, dell'ingegneria chimica e della chimica il prossimo anno.

Questi elementi devono essere attivati in un ordine specifico. In primo luogo, il computer, poi il controller e, infine, la luce in fibra ottica. Il microscopio deve leggere un FM e un LF fm.

La telecamera deve essere centrata sulla testa ottica FM del software. È necessario selezionare le opzioni seguenti. La categoria dell'esperimento è quella delle proprietà meccaniche.

Il gruppo di esperimenti è la mappatura nanomeccanica quantitativa e l'esperimento è la forza di picco q e m nel fluido. Con le impostazioni selezionate correttamente, l'esperimento può essere caricato e configurato. La messa a fuoco della telecamera deve essere impostata utilizzando prima l'obiettivo Z, quindi utilizzando i controlli del percorso per posizionare il palco, l'obiettivo è posizionare l'apertura della testa A FM un millimetro prima della superficie del palco per manipolare i dischi campione con mica appena tagliata con pinzette a pinza per dischi circolari.

Inizia con l'assemblaggio della cella del fluido da parti perfettamente pulite. Innanzitutto, collegare l'adattatore del tubo flessibile alla porta sulle celle del fluido pulito. Quindi, utilizzando una pinzetta a testa piatta molto delicatamente, premere l'O-ring nella sua rientranza sulla cella del fluido.

Quindi, sulla clip di fissaggio della sonda, premere leggermente la molla e allontanarla dalla scanalatura. Usando le stesse pinzette, afferrare la sonda e farla scorrere nella scanalatura, in modo che la punta sia rivolta verso il centro della cella. Quindi fissare la sonda utilizzando la clip.

Il passaggio successivo consiste nel controllare che il morsetto sul FM.It A sia completamente retratto. Posizionare l'assemblaggio rivolto verso il basso sopra il campione. Montare il gruppo sui perni dell'A FM per la stabilizzazione.

Abbassare il morsetto. Per ispezionare l'O-ring, premere l'interruttore verso il basso sul microscopio finché non si vede l'O-ring. Deve essere saldamente compresso tra il disco di supporto e la cella del fluido.

La cella del fluido può essere messa a fuoco utilizzando la manopola di regolazione grossolana. Quindi, utilizzando la regolazione XY, mettere a fuoco la punta della sonda. Sembra un triangolo dorato metallico.

Ora, utilizzando la leva pizo verso il basso, spostare la punta vicino alla superficie del campione, regolare la messa a fuoco sulle punte, la riflessione e monitorare la posizione dei cantilever in relazione a questa riflessione. Attualmente, dovrebbero essere strettamente allineati ma non completamente sovrapposti. Ora, prepara la siringa.

Riempirlo con un millilitro di soluzione tampone e collegare l'adattatore. Quindi collegare la siringa al tubo di espulsione ed estendere completamente lo stantuffo. Quindi, collegare il tubo alla cella del fluido utilizzando un adattatore per riempire la camera, premere delicatamente lo stantuffo fino a riempire il centro della camera.

Non devono esserci bolle d'aria o fuoriuscite dalla cella del fluido sul microscopio. Quindi posizionare la siringa in una posizione ben supportata sopra la camera. Quindi, utilizzare il feed della telecamera e le manopole di traslazione XY.

Per localizzare il laser sullo schermo, dovrebbe apparire come un punto rosso diffuso. Una volta individuato, utilizzare i controlli laser per spostarlo sulla sonda. Infine, regolare i controlli del laser e dello specchio fino a quando il segnale di somma sul microscopio non è massimizzato tra quattro e sei, regolare il diodo a quadrante.

Quindi, utilizzare le manopole sulla testina di scansione per regolare le deflessioni verticali e orizzontali fino a quando i valori sul microscopio non tornano il più vicino possibile allo zero. Assicurarsi di selezionare le opzioni di acquisizione appropriate prima di procedere. Impostare la velocità di scansione su circa un hertz nella finestra dei campioni per linea.

Entra 256. Per il controllo automatico della scansione assistita. Selezionare individuale per la scansione assistita auto Z limit selezionare disattivato.

Il limite Z dovrebbe essere di 500 nanometri e la dimensione della scansione dovrebbe essere di un micron. Con le impostazioni impostate correttamente, calibrare la sonda. Osservare la variazione di tensione Z pazo quando la punta della sonda si avvicina alla superficie.

Se la punta esce dal raggio d'azione, si ritira e si riavvicina, potrebbe essere necessario sostituire la punta della sonda. Se questo non funziona, quando la punta è attivata, dovrebbero apparire delle linee su ciascuna delle finestre di acquisizione, e queste linee costruiranno un'immagine. Iniziare l'acquisizione continua delle immagini della mica.

Ingrandisci lentamente per assicurarti che la superficie della MICA sia piana e pulita. Preparare una capsula di Petri a quattro camere con una soluzione tampone di imaging refrigerata. Ogni camera ha bisogno di almeno cinque millilitri.

Prima di prelevare un'aliquota di proteina diluita, mescolarla delicatamente con la micropipetta. Quindi prelevare un'aliquota da 200 microlitri e applicare la proteina diluita sulla superficie della MICA. Attendere circa 30 secondi affinché la soluzione risieda sulla superficie.

Quindi, utilizzando le pinze a disco, sollevare il disco senza inclinarlo e immergerlo immediatamente nella prima pozza di soluzione tampone. Per un secondo, assicurarsi che il disco rimanga parallelo al banco. È molto importante mantenere il campione parallelo alla piastra di Petri durante la fase di risciacquo.

Queste molecole morbide e flessibili possono essere distorte sulla superficie da forti correnti di soluzione acquosa. Quindi, immergere brevemente il disco in ciascuna delle altre tre piscine per un secondo per piscina. Quindi trasferire il disco su un panno asciutto e privo di polvere.

Lascia che l'umidità in eccesso si trasferisca al panno, ma non lasciare che il disco si asciughi completamente. Non lasciare che il panno tocchi il campione Rimuovere con cautela il campione dal panno con le pinze a disco e posizionare il campione sullo scanner A FM. Posizionare la cella fluida sopra il campione e procedere con la configurazione e l'imaging.

Dopo aver impostato correttamente tutti i parametri per la sonda, la dimensione della molla e il raggio della punta. Misurare la sonda come durante l'imaging. Micah, osserva l'azo ZP mentre la punta si avvicina alla superficie.

Quando si acquisiscono immagini, lasciare che lo scanner immagini la stessa area per almeno due passaggi consecutivi. Utilizzare l'acquisizione continua per salvare ogni immagine. Regolare le dimensioni e la posizione dell'immagine come desiderato.

Una volta che il software automatizzato ha terminato la regolazione dei parametri di scansione per una particolare dimensione dell'immagine. Disattiva il software su fine. Regolare manualmente la messa a fuoco dell'immagine, regolare la velocità di scansione, il limite Z, il numero di linee e il set point.

Se l'immagine diventa troppo sfocata, riaccendere il software per tornare alla posizione iniziale originale. Durante lo zoom su una proteina, diminuire la velocità di scansione e aumentare il numero di linee in modo proporzionale per aumentare la risoluzione dell'immagine. Dopo. Quando analizzi le immagini, per prima cosa, appiattisci l'immagine facendo clic sull'icona di appiattimento.

Selezionare l'ordine zero ed eseguire l'operazione. A volte è necessario utilizzare un adattamento semplice per ottenere immagini adeguatamente piatte. Selezionare l'icona di adattamento semplice e utilizzare il cursore per disegnare un piano su un'area piana dell'immagine.

Eseguire l'accoppiamento liscio e ripetere l'operazione se necessario. Quindi, seleziona la scheda della sezione trasversale per misurare le dimensioni della proteina. Tracciare una linea con il cursore sulla molecola o sull'area da analizzare.

Ripeti questo processo in più aree. Se si desidera un overlay, un numero qualsiasi di molecole biologiche può essere studiato utilizzando un FM per una proteina fotorecettrice nel suo stato adattato alla luce, un substrato di miche appena tagliato è una superficie piana adatta per l'assorbimento delle proteine. I dimeri proteici dei singoli fotorecettori erano osservabili utilizzando la modalità QNM della forza di picco.

Le frecce indicano i singoli dimeri e l'asterisco indica un aggregato proteico utilizzando un software di analisi delle immagini. Le sezioni trasversali delle proteine possono essere misurate dopo che l'immagine è stata appiattita. I dati XY sono correlati alle misurazioni dell'altezza.

Questi possono essere utilizzati per una varietà di calcoli. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di impostare un esperimento A FM per raccogliere immagini ad alta risoluzione di proteine su una superficie in un ambiente biologicamente rilevante. Usando la forza di picco q e m Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa tre o quattro ore.

Pertanto, la forza di picco q e m è una forma appropriata di microscopia a forza atomica da introdurre agli studenti universitari iscritti a corsi di laboratorio come analisi strumentale, biochimica e fisica moderna. Dopo il suo sviluppo, questo metodo apre la strada ai ricercatori nel campo della microscopia a scansione di sonda per esplorare molecole biologiche come proteine, acidi nucleici e persino cellule vive in mezzi biologicamente rilevanti.