Name: Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Scopri un metodo per misurare la risposta alimentare indotta dal glutatione in Hydra. Questo saggio quantifica la distanza tra tentacolo e bocca per studiare i meccanismi di chemosensazione nel sistema nervoso semplice di questo organismo.

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Gli autori sono grati a K. P. Madhu, Nita Beliappa e allo staff del Media Centre dell'Indian Institute of Science Education and Research, Pune per il loro aiuto nella produzione del video. Il lavoro è stato sostenuto da finanziamenti nell'ambito del programma Centre of Excellence del Dipartimento di Biotecnologia, Governo dell'India a SG e da borse di studio post-dottorato da parte del Dipartimento di Scienza e Tecnologia, Governo dell'India a RK.

1. Hydra Cultura e misura della risposta alimentazione <ol><li> Mantenere polipi idra in coltura somministrando loro giornalmente con artemia e tenerli in un mezzo (buffer 1 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 0.1 mM KCl, e 0,1 mM MgSO4) contenuta in un ciotola di vetro a 18 ° C in 12 hr luce-12 hr cicli scuri come descritto in precedenza 12. </li><li> Per misurare la risposta di alimentazione, trasferire matura polipo Hydra avere da 5 a 6 tentacoli di un unico pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Rimuovere la quantità residua dal pozzo inclinandolo, e quindi aggiungere immediatamente 500 ml di terreno fresco. </li><li> Preparare la soluzione glutatione 9 micron di media idra. Poiché la soluzione glutatione è incline all'ossidazione, utilizzare sempre soluzione glutatione appena preparata per ciascun esperimento. </li><li> Trasferire la piastra alla piattaforma di imaging di un microscopio avente disposizioni per la registrazione di immagini. Utilizzare uno sfondo scuro in modo tale che il comportamento of polipo Hydra è chiaramente ripreso sullo sfondo contrastante. </li><li> La sala utilizzata per l'osservazione e l'imaging del comportamento di idra privo di luci di intensità fluttuante, correnti d'aria e rumore. Tali disturbi possono anche causare il polipo idra per mostrare la contrazione dei tentacoli - anche in assenza di glutatione. </li><li> Lasciare che il polipo per rilassarsi per 5 minuti. </li><li> Assicurarsi che il polipo si trova lungo la regione centrale del pozzo in modo che il comportamento può essere ripreso in modo chiaro. Se il polipo è al bordo del pozzo, portarlo al centro irrigando il mezzo con una pipetta e ancora permettergli di rilassarsi. </li><li> Scattare una foto di idra nello stato di rilassamento. Questo sarà il punto di osservazione zero tempo. </li><li> Aggiungere rapidamente 9 mM soluzione glutatione per raggiungere una concentrazione finale di 3 micron nel pozzo. A seconda dello scopo dell'esperimento e la risposta dimostrato da idra, testare una gamma di diverse concentrazioni di glutatione e chooSE la concentrazione appropriata richiesta. </li><li> Avviare il timer immediatamente dopo l'aggiunta di soluzione di glutatione e catturare immagini dopo ogni 15-30 secondi per 4-5 min. Non modificare le impostazioni di ingrandimento durante il time-lapse imaging. </li><li> Aggiungere la soluzione glutatione delicatamente e con un flusso uniforme tale che la posizione dell'animale nel pozzo sarebbe minimamente disturbato nel campo visivo del microscopio. Tuttavia, se il polipo muove ampiamente dopo l'aggiunta di soluzione di glutatione, spostare la piastra delicatamente per portare il polipo nel campo di vista per la cattura delle immagini. </li><li> Nell'esperimento di controllo, utilizzare mezzo privo glutatione mantenendo tutti gli altri parametri identici. </li><li> Assicurarsi di eseguire tutte le fasi sperimentali di cui sopra durante la prima metà della giornata - prima di 1:00 per evitare il possibile effetto del ritmo circadiano del grado di risposta di alimentazione. </li><li> Aprire ciascuna delle immagini acquisite utilizzando il GNU Image Manipulation Program (GIMP). </li> Utilizzare lo strumento "Misura" disponibile dal Menu&gt; Strumenti&gt; Misura per determinare la distanza tra l'estremità apicale di ciascuno dei tentacoli e ipostoma. Se l'apertura della bocca è osservata in qualsiasi delle immagini, determinare la distanza tra il centro della bocca aperta e l'estremità apicale del tentacolo. Fare riferimento a questa distanza come la diffusione tentacolo. <li> Calcolare lo spread medio tentacolo per ogni polipo prima e dopo l'esposizione glutatione. Calcolare il rapporto di spread medio tentacolo al punto zero tempo a quella in ciascuno dei successivi punti temporali. Questo rapporto si chiamerà relativa diffusione tentacolo. </li><li> Ripetere le misurazioni per almeno 20 polipi. </li></ol><img alt="Equazione 1" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq1.jpg" width="400"> <img alt="Equazione 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52178/52178eq2.jpg" width="450"> 2. Metodo di convalida utilizzando ilLa fame Modello <ol><li> Per fame, trasferire alcuni polipi Hydra in una ciotola di vetro separata e non dar loro da mangiare per 5 giorni. Inserire il gruppo di controllo di alcuni polipi al giorno con Artemia in una ciotola di dimensioni simili. Modificare il supporto sia sperimentale ciotole giorno per evitare la crescita di funghi nel mezzo. </li><li> Il giorno dell'esperimento, alimentare il gruppo di controllo di idra con artemia per 1 ora e utilizzare questi hydra per gli esperimenti successivi dopo aver rimosso tutti artemia non consumati e morti dal mezzo. </li><li> Misurare la risposta alimentazione del idra fame in confronto con l'idra dal gruppo di controllo con il metodo descritto in precedenza al punto 1. Per evitare qualsiasi distorsione dovuta al tempo di osservazione, alternare le misurazioni di ciascuno degli fame e controllare polipi idra. </li></ol>

<ol><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+control+of+the+specific+feeding+reactions+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Ny.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Glutathione control of the specific feeding reactions of hydra.</a> Ann. Ny. Acad. Sci. 62, 209-228 (1955).</li>
<li>Beckmann, A., Ozbek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nematocyst%3A+a+molecular+map+of+the+Cnidarian+stinging+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nematocyst: a molecular map of the Cnidarian stinging organelle.</a> Int. J. Dev. Biol. 56, 577-582 (2012).</li>
<li>Venturini, G., Carolei, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+receptors+in+Hydra.+Pharmacological+and+biochemical+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic receptors in Hydra. Pharmacological and biochemical observations.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 102, 39-43 (1992).</li>
<li>Kass-Simon, G., Scappaticci, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+and+GABAnergic+control+in+the+tentacle+effector+systems+of+Hydra+vulgaris%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiologia%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic and GABAnergic control in the tentacle effector systems of Hydra vulgaris.</a> Hydrobiologia. 530-531, 67-71 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Tino, A., Minei, R., Marino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+roles+of+GABA+and+glycine+in+the+modulation+of+chemosensory+responses+in+Hydra+vulgaris+%28Cnidaria%2C+Hydrozoa%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hydrobiology%22%5BJournal%5D)">Different roles of GABA and glycine in the modulation of chemosensory responses in Hydra vulgaris (Cnidaria, Hydrozoa).</a> Hydrobiology. 178, 59-66 (2004).</li>
<li>Pierobon, P., Sogliano, C., Minei, R., Tino, A., Porcu, P., Marino, G., Tortiglione, C., Concas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+NMDA+receptors+in+Hydra%3A+a+biochemical+and+functional+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Putative NMDA receptors in Hydra: a biochemical and functional study.</a> Eur. J. Neurosci. 20, 2598-2604 (2004).</li>
<li>Alzugaray, M. E., Adami, M. L., Diambra, L. A., Hernandez-Martinez, S., Damborenea, C., Noriega, F. G., Ronderos, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allatotropin%3A+An+ancestral+myotropic+neuropeptide+involved+in+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Allatotropin: An ancestral myotropic neuropeptide involved in feeding.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Bellis, S. L., Laux, D. C., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+Hydra+glutathione+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of Hydra glutathione binding proteins.</a> FEBS Lett. 354, 320-324 (1994).</li>
<li>Lenhoff, H. M. The discovery of the GSH receptor in Hydra and its evolutionary significance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLenhoff%2C+HM+%22Glutathione+in+the+Nervous+System%22">Glutathione in the Nervous System</a>. Shaw, C. A. , Taylor&Francis. Bristol. 25-43 (1998).</li>
<li>Venturini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hydra+GSH+receptor.+Pharmacological+and+radioligand+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">The hydra GSH receptor. Pharmacological and radioligand binding studies.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 87, 321-324 (1987).</li>
<li>Reddy, P. C., Barve, A., Ghaskadbi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+and+phylogenetic+characterization+of+common+hydra+from+India%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Sci%22%5BJournal%5D)">Description and phylogenetic characterization of common hydra from India.</a> Curr. Sci. 101, 736-738 (2011).</li>
<li>Horibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+catabolic+pathway+of+glycosphingolipids+in+a+hydrozoan%2C+Hydra+magnipapillata.+Involving+endoglycoceramidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Unique catabolic pathway of glycosphingolipids in a hydrozoan, Hydra magnipapillata. Involving endoglycoceramidase.</a> J. Biol. Chem. 279, 33379-33389 (2004).</li>
<li>Koizumi, O., Maeda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rise+of+feeding+threshold+in+satiated+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rise of feeding threshold in satiated Hydra.</a> J. Comp. Physiol. 142, 75-80 (1981).</li>
<li>Bellis, S. L., Kass-Simon, G., Rhoads, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+characterization+and+detergent+solubilization+of+the+putative+glutathione+chemoreceptor+from+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Partial characterization and detergent solubilization of the putative glutathione chemoreceptor from hydra.</a> Biochemistry. 31, 9838-9843 (1992).</li>
<li>Morita, H., Hanai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+receptor+proteins+in+invertebrates+-+with+special+reference+to+glutathione+receptor+of+hydra%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">Taste receptor proteins in invertebrates - with special reference to glutathione receptor of hydra.</a> Chem. Senses. 12, 245-250 (1987).</li>
<li>Colasanti, M., Venturini, G., Merante, A., Musci, G., Lauro, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+involvement+in+Hydra+vulgaris+very+primitive+olfactory-+like+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide involvement in Hydra vulgaris very primitive olfactory- like system.</a> Journal of Neurosci. 17, 493-499 (1997).</li>
<li>Kuhn, A., Tsiairis, C. D., Williamson, M., Kalbacher, H., Grimmelikhuijzen, C. J., Holstein, T. W., Gründer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+homologous+subunits+form+a+high+affinity+peptide-gated+ion+channel+in+Hydra%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Three homologous subunits form a high affinity peptide-gated ion channel in Hydra.</a> J. Biol. Chem. 285, 11958-11965 (2010).</li>
<li>Wang, M., Yao, Y., Kuang, D., Hampson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+family+C+G-protein-coupled+receptors+by+the+tripeptide+glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of family C G-protein-coupled receptors by the tripeptide glutathione.</a> J. Biol. Chem. 281, 8864-8870 (2006).</li>
<li>Ruggieri, R. D., Pierobon, P., Kass-Simon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pacemaker+activity+in+hydra+is+modulated+by+glycine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Phys.+C%22%5BJournal%5D)">Pacemaker activity in hydra is modulated by glycine receptor ligands.</a> Comp. Biochem. Phys. C. 138, 193-202 (2004).</li>
<li>Ramazani, R. B., Krishnan, H. R., Bergeson, S. E., Atkinson, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+automated+movement+detection+for+the+analysis+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Computer automated movement detection for the analysis of behavior.</a> J. Neurosci. Meth. 162, 171-179 (2007).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Comportamento alimentare in idra rappresenta uno dei sistemi chemosensoriali più ancestrali dei metazoi. Sebbene la presenza di GSH nel fluido crostaceo rilasciato dopo la cattura la preda nematocisti-assistita è stato rilevato da tempo 1, né la proteina GSHR né le putativo gene codifica / s sono stati caratterizzati da idra ad oggi. Alcuni tentativi sono stati fatti per caratterizzare GSH proteine ​​leganti in idra 8, 14, 15. Tuttavia, l&#39;identità di queste proteine ​​recettori putativi rimane ...

Hydra è l'organismo più primitivo che possiede un sistema nervoso e una chemiosensazione per rilevare il glutatione ridotto (GSH) per catturare la preda1. Si nutre di una varietà di animali come nematodi, crostacei, larve di insetti, girini e pesci appena nati1. Il movimento di questi organismi preda provoca la scarica meccanosensoriale delle capsule urticanti chiamate nematocisti da idra, che vengono inserite nella preda2. Il GSH presente nel fluido rilasciato dalla preda ferita attiva successivamente la risposta alimentare in idra che comprende l'arricciamento dei tentacoli per portare la preda verso la bocca, l'apertura della bocca e il conseguente inghiottimento della preda. È stato dimostrato che diverse molecole, come la dopamina3, il glutammato4, il GABA, la glicina5, i recettori NMDA6 e l'allatotropina7, sono coinvolte nella risposta alimentare nell'idra. È stato anche dimostrato che la risposta chemiosensoriale indotta dal GSH è modulata dallo stato alimentare dell'animale in modo tale che l'idra affamata ha mostrato una risposta alimentare migliorata1. Un tale aumento della sensibilità al GSH è biologicamente rilevante poiché in condizioni di fame le idre hanno bisogno di trovare la loro preda a una sensibilità più elevata. 
Sebbene la risposta alimentare indotta dal GSH possa essere chiaramente osservata al microscopio, i metodi tipicamente utilizzati per misurare le osservazioni della risposta alimentare non sono quantitativi. Nella maggior parte dei casi, il tempo durante il quale la bocca dell'idra rimane aperta è stato preso come misura della risposta alimentare8,9; mentre in un altro caso, la quantificazione si basava sul numero di idre su una popolazione che mostrava la risposta alimentare10. Tuttavia, osservare il tempo di apertura della bocca dei polipi dell'idra è macchinoso e soggetto a variazioni indotte da parametri incontrollabili come la direzione dell'orientamento della bocca durante le osservazioni. Allo stesso modo, poiché la risposta alimentare è un parametro quantitativo, gli approcci basati sulla popolazione sono soggetti a variazioni/errori causati dall'opinione o dal pregiudizio osservativo del singolo osservatore. Per aggirare questi problemi abbiamo sviluppato un metodo per la quantificazione relativa della risposta alimentare nell'idra (Hydra vulgaris Ind-Pune11) basata sulla distanza dell'estremità apicale del tentacolo dalla bocca del polipo dell'idra.

<table><tbody><tr><td>Incubatore raffreddato</td><td>Panasonic</td><td>Microscopio MIR-254-PE</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>S8AP0&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera per il microscopio</td><td>Leica&nbsp;</td><td>EC3</td><td></td></tr><tr><td>Glutatione ridotto</td><td>Sigma</td><td>G4251</td><td>Conservato a 4 °C. Portare il flacone a temperatura ambiente prima di aprirlo per evitare l'ossidazione</td></tr><tr><td>Programma di modifica delle immagini</td><td>GIMP</td><td>Versione 2.8</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a hydra

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra è tra gli organismi più primitivi che possiedono un sistema nervoso e una chemiosensazione per rilevare il glutatione ridotto (GSH) per catturare la preda. Il movimento degli organismi preda provoca la scarica meccanosensoriale delle cellule urticanti chiamate nematocisti dall'idra, che vengono inserite nella preda. La risposta alimentare in idra, che comprende l'arricciamento dei tentacoli per portare la preda verso la bocca, l'apertura della bocca e il conseguente inghiottimento della preda, è innescata dal GSH presente nel fluido rilasciato dalla preda ferita. Per essere in grado di identificare il meccanismo molecolare della risposta alimentare nell'idra che è finora sconosciuto, è necessario stabilire un test per misurare la risposta alimentare. Qui, descriviamo un metodo semplice per la quantificazione della risposta alimentare in cui viene misurata la distanza tra l'estremità apicale del tentacolo e la bocca dell'idra e viene determinato il rapporto di tale distanza prima e dopo l'aggiunta di GSH. Si è scoperto che il rapporto, chiamato diffusione relativa dei tentacoli, fornisce una misura della risposta alimentare. Questo test è stato convalidato utilizzando un modello di fame in cui l'idra affamata mostra una risposta alimentare migliorata rispetto all'idra alimentata quotidianamente.

Glutatione provoca idra esporre arricciamento dei tentacoli verso la bocca al fine di inghiotte la preda. Tale arricciatura di tentacoli porta estremità apicale dei tentacoli più vicino alla ipostoma. Ciò comporta la riduzione dello spread tentacolo, o la distanza lineare tra l'estremità apicale del tentacolo e ipostoma (Figura 1). La diffusione tentacolo relativa, o il rapporto tra tentacolo media si sviluppa prima e dopo l'aggiunta di glutatione, la media su più polipi riduce nel tempo. La diffusione ...

Qui descriviamo un semplice test per la quantificazione della risposta alimentare nell'idra indotta dalla forma ridotta di glutatione. Questo test si basa sulla misurazione della distanza tra l'estremità apicale del tentacolo e la bocca dell'idra.

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

In questo video, descriviamo un metodo per misurare il comportamento alimentare in Hydra. In risposta alla forma ridotta di glutatione, Hydra si nutre di una varietà di animali, nematodi, crusta e pesci appena nati. Sullo strato esterno di questo animale a due strati cellulari, ci sono cellule specializzate chiamate nematocisti.Le nematocisti hanno dei fattori scatenanti che, se attivati dal movimento della preda nel fluido circostante, provocano lo scarico dei fili di incordatura. I fili urticanti vengono inseriti nella preda. La preda ferita rilascia glucosio in eccesso.L'idro ionico ha una sensazione chemioterapica per rilevare il glutatione nel liquido circostante. Questo innesca un comportamento alimentare che coinvolge il suo sistema nervoso. Il comportamento alimentare in Hydra include l'arricciamento dei tentacoli per portare la preda verso un'apertura iperscopica della bocca e l'inghiottimento della preda.Infatti, l'aggiunta di ione gluta nell'ambiente circostante provoca la reazione di alimentazione in idra, anche in assenza di preda. Per comprendere l'interazione tra la sensazione chemioterapica e il sistema nervoso, dobbiamo quantizzare il comportamento e creare misure accurate e affidabili. In alcuni rapporti precedenti, il tempo per il quale la bocca rimane aperta è preso come misura della risposta alimentare, ma osservare la durata dell'apertura della bocca nei polipi idro è noioso ed è soggetto a variazioni indotte da parametri incontrollabili come l'orientamento della bocca dovuto alle osservazioni.Un altro metodo di quantificazione del comportamento si basa sul numero di idre in una popolazione che mostra la risposta alimentare. Tuttavia, poiché la risposta alimentare è un parametro quantitativo individuale, gli approcci basati sulla popolazione sono variazioni soggettive causate dall'opinione del singolo osservatore. I principali vantaggi del metodo alternativo che descriviamo qui è che è molto facile da eseguire e altamente riproducibile.Mantenere l'idra a 18 gradi Celsius sotto 12 ore di luce. Cicli di buio di 12 ore in un mezzo contenuto in una ciotola di vetro e nutrirli quotidianamente con emia per misurare la risposta alimentare. Trasferire un polipo idro maturo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, rimuovere il terreno residuo dal pozzetto utilizzando un perno.Ciò è facilitato inclinando la piastra, scartando il terreno in eccesso, quindi aggiungere immediatamente 500 microlitri di terreno fresco Preparazione della soluzione di glutatione. Una soluzione di nove micromolari di glutatione viene preparata utilizzando il mezzo idro. Ricorda, la soluzione di glutatione è soggetta all'ossidazione, quindi usa sempre una soluzione di glutatione appena preparata.Per ogni esperimento, trasferire la lastra sulla piattaforma di imaging di un microscopio. Avendo la disposizione per la registrazione delle immagini, utilizzare uno sfondo scuro in modo tale che il comportamento dell'idropolipo possa essere chiaramente ripreso sullo sfondo contrastante. Assicurati che il polipo si trovi lungo la parte centrale del pozzo catturato un'immagine dell'idra nello stato rilassato.Questa sarà un'osservazione a punto temporale zero. Aggiungere rapidamente nove micromolari di glutatione per raggiungere una concentrazione finale di tre micromolari nel, pozzetto. Avvia il timer subito dopo aver aggiunto la soluzione di glutatione e acquisisci immagini ogni 15 o 30 secondi per quattro o cinque minuti senza modificare le impostazioni di ingrandimento.Per le misure, usiamo gim versione due, gim. Un programma GNU per la manipolazione delle immagini è un software scaricabile gratuitamente da Internet. Apri ciascuna delle immagini catturate in gim.Questo programma dispone di uno strumento di misurazione disponibile dal menu strumenti. Misurare la distanza tra iper, stomia, estremità apicale di ciascuno dei tentacoli può essere misurata utilizzando questo strumento. Questa distanza è chiamata diffusione dei tentacoli.Calcola la diffusione media dei tentacoli per ogni polipo prima e dopo il glutatione. Calcola il rapporto tra la diffusione media dei tentacoli al tempo zero. Puntate su quello in ciascuno dei punti temporali successivi.Chiamiamo questa diffusione relativa dei tentacoli. Eseguire tali misurazioni per almeno 20 polipi per fame. Trasferisci alcuni idropolipi in una ciotola di vetro separata e non dar loro da mangiare per cinque giorni.Alimentare i polipi di controllo ogni giorno con artia il giorno dell'esperimento. Nutri il gruppo di controllo dell'Idra con l'arte per una R e usa questa idra per gli esperimenti successivi. Misurare la risposta alimentare dell'idra affamata rispetto all'idra del gruppo di controllo con il metodo descritto in precedenza in questo video per evitare qualsiasi distorsione dovuta al tempo di alternanza delle misurazioni di ciascuno degli idropolipi affamati e controllati.Il glutatione fa sì che l'idra mostri l'arricciamento dei tentacoli verso la bocca. Tale arricciatura avvicina le estremità apicali dei tentacoli all'ipotempesta. Ciò si traduce nella riduzione della distanza lineare tra le estremità apicali del tentacolo e l'ipertempesta o la diffusione dei tentacoli.Il relativo tentacolo si allarga dopo l'aggiunta del mezzo. La mancanza di glutatione si riduce solo transitoriamente. Rimbalza a uno in circa un minuto.È noto che la fame provoca un miglioramento del comportamento alimentare indotto dal glutatione. La diffusione del tentacolo un minuto dopo l'aggiunta di glutatione era significativamente inferiore per il gruppo del personale rispetto al gruppo sazio. Tutti gli animali usano la chemioterapia per rilevare il cibo.Hydra utilizza un segnale chimico sotto forma di glutatione rilasciato dalla preda ferita, ha un sistema nervoso semplice senza alcuna struttura simile al cervello, quindi è probabile che anche il meccanismo molecolare della sensazione di chemio e la sua modulazione dipendente dallo stato di alimentazione siano semplici. La comprensione di questo meccanismo può far luce sull'evoluzione di una regolazione dell'alimentazione negli animali superiori. Tuttavia, né il recettore che può legare il glutatione né altri componenti della cascata di segnalazione a valle sono stati riportati in Haida fino ad oggi.Gli inibitori farmacologici delle comuni vie di segnalazione sensoriale della chemios e l'uso di tecniche di biologia molecolare avanzate per alterare l'espressione di tali proteine di segnalazione e del recettore del glutatione possono rivelarsi potenti strumenti per comprendere il meccanismo molecolare dell'alimentazione. In Hydra, tuttavia, è necessaria una misura affidabile del comportamento alimentare alterato per comprendere l'entità di eventuali modifiche causate da tali indagini sperimentali. Qui abbiamo presentato un metodo che non è solo affidabile, ma anche facile da eseguire ed è altamente riproducibile.

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Questo manoscritto descrive l'uso di reporters fluorogenic geneticamente codificati in un'applicazione di imaging di cellule vive per l'esame dello stress ossidativo indotto da xenobiotici. Questo approccio sperimentale offre ineguagliabile risoluzione spazio-temporale, sensibilità e specificità, evitando molte delle lacune dei metodi convenzionali utilizzati per la rilevazione dello sforzo ossidativo tossicologico.

Approcci alla valutazione dello Stress ossidativo tossicologici utilizzando geneticamente codificato Fluorogenic sensori di imaging

Questo articolo presenta un metodo per studiare il recettore del glutammato (GluR) nel traffico di cellule ippocampali primarie dissociate. Utilizzando un approccio anticorpale-alimentazione per etichettare i recettori endogeni o sovraespressi in combinazione con approcci farmacologici, questo metodo consente l'identificazione di meccanismi molecolari che regolano l'espressione della superficie di GluR modulando processi di internalizzazione o riciclaggio.

Un approccio di alimentazione anticorpale per studiare il traffico di recettori del glutammato nelle culture ippocampali primarie dissociate

Qui descritto è un protocollo che consente la quantificazione colorimetrica della quantità di cibo mangiata entro un intervallo di tempo definito dalle larve di Drosophila melanogaster esposte a diete di diversa qualità macronutriente. Questi test sono condotti nel contesto di uno schermo termogenetico neuronale.

Quantificazione dell'assunzione di macronutrienti in uno schermo neuronale termogenetico usando larve di Drosophila

Questo articolo descrive un protocollo per determinare le differenze nello stato redox basale e le risposte redox alle perturbazioni acute nei neuroni primari dell'ippocampo e corticale utilizzando la microscopia confocale dal vivo. Il protocollo può essere applicato ad altri tipi di cellule e microscopi con modifiche minime.

Imaging dal vivo dello stato redox del glutatione mitocondriale nei neuroni primari utilizzando un indicatore raziometrico

La quantificazione delle forme ossidate e ridotte di glutatione (GSSG e GSH, rispettivamente) è stata ottenuta attraverso l'uso dell'orto-ftalaldeide (OPA). L'OPA diventa altamente fluorescente una volta coniugato al GSH, ma non è in grado di coniugare il GSSG fino a quando non viene ridotto. Qui, descriviamo un saggio multiparametrico per quantificare entrambi utilizzando la quantificazione delle proteine per la normalizzazione.

Quantificazione rapida di forme ossidate e ridotte di glutatione utilizzando l'orto-ftalaldeide in cellule di mammifero in coltura in vitro

Questo protocollo descrive un test per quantificare la velocità di alimentazione di Caenorhabditis elegans basato sulla misurazione della clearance dei batteri in coltura liquida.

Quantificazione dell'assunzione di cibo in Caenorhabditis elegans misurando la clearance batterica

Utilizzando l'imaging in time-lapse, si può seguire l'intero processo di rigenerazione degli sferoidi di Hydra . Questo protocollo descrive la generazione degli sferoidi Hydra , discute una varietà di strategie di montaggio e dettaglia come eseguire imaging a lungo termine e in tempo reale utilizzando microscopia confocale a disco rotante e microscopia a fluorescenza a foglio luminoso.

Preparazione e immagini dal vivo degli Sferoidi Idra in Rigenerazione

Scopri un metodo per misurare la risposta alimentare indotta dal glutatione in Hydra. Questo saggio quantifica la distanza tra tentacolo e bocca per studiare i meccanismi di chemosensazione nel sistema nervoso semplice di questo organismo.

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

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