Name: Produzione e luso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore In Vitro Saggi mielinizzazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Scopri come produrre e utilizzare lentivirus per trasdurre selettivamente precursori di oligodendrociti primari in saggi di mielinizzazione in vitro. Questo metodo consente di studiare il ruolo delle proteine nel sistema nervoso centrale.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC fellowship #454330 to JX, project grant #628761 to SM e APP1058647 to JX), Multiple Sclerosis Research Australia (MSRA #12070 to JX), dal programma di sostegno alla sovvenzione per la ricerca dell'Università di Melbourne e dalla Melbourne Research CI Fellowship a JX, nonché dalle borse di studio post-laurea australiane per HP e AF. Vorremmo riconoscere lo schema di infrastruttura operativa del Dipartimento per l'Innovazione, l'Industria e lo Sviluppo Regionale, Victoria Australia.

<ol><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiol Rev. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>Watkins, T. A., Emery, B., Mulinyawe, S., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stages+of+myelination+regulated+by+gamma-secretase+and+astrocytes+in+a+rapidly+myelinating+CNS+coculture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Distinct stages of myelination regulated by gamma-secretase and astrocytes in a rapidly myelinating CNS coculture system.</a> Neuron. 60 (4), 555-569 (2008).</li>
<li>Lee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDGAs+interact+selectively+with+neuroligin-2+but+not+other+neuroligins+to+regulate+inhibitory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MDGAs interact selectively with neuroligin-2 but not other neuroligins to regulate inhibitory synapse development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (1), 336-341 (2013).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+DRG+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent DRG neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li>
<li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Promotes+Central+Nervous+System+Myelination+via+a+Direct+Effect+upon+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosignals%22%5BJournal%5D)">Brain-Derived Neurotrophic Factor Promotes Central Nervous System Myelination via a Direct Effect upon Oligodendrocytes.</a> Neurosignals. 18 (3), 186-202 (2010).</li>
<li>Lundgaard, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+and+BDNF+induce+a+switch+to+NMDA+receptor-dependent+myelination+by+oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuregulin and BDNF induce a switch to NMDA receptor-dependent myelination by oligodendrocytes.</a> PLoS Biology. 11 (12), e1001743(2013).</li>
<li>Kleitman, N., W, P. M., Bunge, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleitman%2C+N+%22Tissue+culture+methodes+for+the+study+of+myelination%22">Tissue culture methodes for the study of myelination</a>. , MIT Press. Cambridge, MA. (1991).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+signal-regulated+kinase+1%2F2+signaling+promotes+oligodendrocyte+myelination+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Extracellular signal-regulated kinase 1/2 signaling promotes oligodendrocyte myelination in vitro.</a> J Neurochem. 122 (6), 1167-1180 (2012).</li>
<li>Wong, A. W., Xiao, J., Kemper, D., Kilpatrick, T. J., Murray, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglial+expression+of+TrkB+independently+regulates+myelination+and+progenitor+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglial expression of TrkB independently regulates myelination and progenitor cell proliferation.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (11), 4947-4957 (2013).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%2C+Characterization+and+Expression+of+miR-15a-3p+and+miR-15b-3p+in+Dairy+Cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning, Characterization and Expression of miR-15a-3p and miR-15b-3p in Dairy Cattle.</a> Molecular and Cellular Probes. , (2014).</li>
<li>Emery, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+gene+regulatory+factor+is+a+critical+transcriptional+regulator+required+for+CNS+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Myelin gene regulatory factor is a critical transcriptional regulator required for CNS myelination.</a> Cell. 138 (1), 172-185 (2009).</li>
<li>Murai, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+receptor+TLX+stimulates+hippocampal+neurogenesis+and+enhances+learning+and+memory+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nuclear receptor TLX stimulates hippocampal neurogenesis and enhances learning and memory in a transgenic mouse model.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (25), 9115-9120 (2014).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano che non vi è alcun conflitto di interessi in merito a questa ricerca.

Mielinizzazione di assoni è un processo fondamentale per il funzionamento ottimale di entrambi i sistemi nervoso centrale e periferico di vertebrati. La generazione e la manutenzione di assoni mielinizzati è un processo complesso e coordinato che coinvolge interazioni molecolari tra neuronale, gliale (dalle cellule di Schwann o oligodendrociti) e proteine ​​extracellulari della matrice. Il significato e l&#39;applicabilità di questo protocollo è che permette la manipolazione delle proteine ​​in un tipo di cellula specif...

Mielinizzazione degli assoni è fondamentale per la trasmissione rapida ed efficiente dei potenziali d&#39;azione sia nel sistema nervoso centrale e periferico. Cellule specializzate, le cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico e oligodendrociti nel sistema nervoso centrale, avvolgono e ensheathe assoni in mielina, efficace isolamento del nervo e facilitando la conduzione saltatory 1. Il processo di mielinizzazione può essere studiato in vitro utilizzando retina neuroni gangliari 2, nanofibre ingegnerizzati 3, o neuroni dei gangli delle radici dorsali co-coltura sia con le cellule di Schwann 4 o oligodendrociti 5-7. Il saggio mielinizzazione in vitro è un modello stabilito per lo studio mielinizzazione del sistema nervoso e si replica molti dei processi fondamentali che avvengono durante la mielinizzazione in vivo 5-8. Il test prevede la co-coltura di popolazioni purificate di dorsale Root Ganglion (DRG) neuroni, con OPC (per CNS mielinizzazione) o cellule di Schwann (per PNS mielinizzazione). In condizioni particolari queste cellule mielinizzanti ensheathe assoni DRG in ordinata, ultra strutturalmente verificato, scheda multi-lamellare di isolamento membrana plasmatica che esprimono lo stesso complemento di specifiche proteine ​​della mielina presenti in vivo. Il modello cellulare più comunemente usato di studiare CNS mielinizzazione in vitro è co-colture di neuroni DRG e OPC, che sono stati usati con successo per studiare l&#39;effetto che i fattori esogeni, quali le neurotrofine esercitano sul sistema nervoso centrale mielinizzazione in vitro 5,6. Fattori esogeni, quali fattori di crescita o piccole molecole inibitori farmacologici sono stati ampiamente utilizzati per studiare il ruolo delle vie di segnalazione nella mielinizzazione utilizzando il DRG-OPC modello coculture 7,9. Tuttavia, nelle impostazioni co-coltura miste contenenti sia i neuroni e oligodendrociti, rimase formalmente possibile che sia i fattori di crescita o il pharinibitori ve- avrebbero potuto esercitare effetti su entrambi i neuroni DRG e oligodendrociti (OL). Questo non offre la possibilità di sezionare specificamente i ruoli che le proteine ​​espresse solo DRG o oligodendroglia esercita su mielinizzazione con questo sistema a doppia cella. Per confermare in modo inequivocabile che il percorso di segnalazione in oligodendrogliale regola direttamente mielinizzazione, trasduzione lentivirale di OPC, prima della semina su neuroni DRG per il saggio mielinizzazione in vitro, ha dimostrato di essere un modo elegante per iperespressione sia wild-type e le proteine ​​mutanti, come pure come espressione atterramento di proteine ​​costitutivamente espresse da oligodendrociti. Così questo approccio offre un viale di interrogare in modo specifico e manipolare vie di segnalazione all&#39;interno oligodendrociti per studiare mielinizzazione 9,10. In questo lavoro, si segnala metodi che abbiamo sviluppato per iperespressione una proteina di interesse selettivamente in oligodendrociti mediante lentiviralapproccio per studiare mielinizzazione in vitro. La tecnica inizia con la generazione di vettori di espressione contenenti il ​​gene di interesse, sia esso in un ceppo selvatico, forma negativa costitutivamente attiva o dominante che vengono successivamente clonato nel vettore pENTR (pENTR L1-L2 pENTR4IRES2GFP). Questo vettore (contenente il gene di interesse), il donatore CMV promotore (pENTR L4-R1-pENTR pDNOR-CMV) e la lentivector 2K7 sono combinati in una reazione enzimatica per produrre un vettore contenente 2K7 CMV promoter, il gene di interesse, un sito interno ribosomiale ingresso e GFP (Figura 1). Questo Gateway clonato costrutto 2K7 combinata con la busta virus PMD2.G e il pacchetto di virus pBR8.91 può essere co-trasfettato in cellule HEK293T generare lentivirus che può essere successivamente utilizzato per trasdurre OPC. Una volta infettati con il lentivirus le OPC esprimono un alto livello della proteina di interesse. Questi OPC possono essere seminati in colture DRG neuroni e l&#39;effetto che l&#39;espressionedi elevati livelli della proteina desiderata esercita sulla mielinizzazione possono essere interrogato. Le co-colture sono valutati per l&#39;espressione delle proteine ​​della mielina mediante analisi western blot e visualizzati per la formazione di segmenti assonale mieliniche mediante immunocitochimica.

<table><tbody><tr><td>Lentivettore 2K7&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Gentile regalo da parte del Dr Suter9</td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&prime;-deossiuridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100mg</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 IgG anti-topo di capra Jackson</td><td>Immunoresearch</td><td>115545205</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 capra anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-topo IgG (H+L)</td><td>Life Tecnologie</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 capra anti-coniglio IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11012</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-5G</td><td></td></tr><tr><td>B27 - NeuroCul SM1 Integratore neuronale</td><td>Cellule staminali Tecnologie&nbsp;</td><td>5711</td><td></td></tr><tr><td>BDNF (Umano)</td><td>Peprotech</td><td>PT450021000</td><td></td></tr><tr><td>Biotina (d-Biotina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Bradford</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916-500ML&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-100G</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Peprotech</td><td>450-13020</td><td></td></tr><tr><td>DAKO Mezzi di montaggio per fluorescenza</td><td>DAKO</td><td>S302380-2</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto glucosio, piruvato, senza glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>10313039</td><td></td></tr><tr><td>DNasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-375KU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, calcio, magnesio</td><td>Life Technologies</td><td>14040182</td><td></td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14155063</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101</td><td></td></tr><tr><td>Vettori di ingresso per il promotore e il gene di interesse</td><td></td><td></td><td>Genera secondo i protocolli 1-2</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12003C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio (D-glucosio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Chem Supply</td><td>GL010-500M</td><td>Vedi soluzioni stock</td></tr><tr><td>IgG anti-topo</td><td>di capra Jackson ImmunoResearch</td><td>115005003</td><td></td></tr><tr><td>IgM anti-topo di capra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115005020</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-ratto di capra</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>112005167</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3021-100ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Insulina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td></td></tr><tr><td>Laminina&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>LB Medium</td><td></td><td></td><td>Vedi soluzioni stock</td></tr><tr><td>LB-Agar</td><td></td><td></td><td>Vedi soluzioni stock</td></tr><tr><td>L-Cisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7477</td><td></td></tr><tr><td>L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>di</td> Leibovitz 11415064 <td></td></tr><tr><td>L-Glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina- 200 mM (100x) liquido</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>LR Clonasi II Plus enzima</td><td>Life Technologies</td><td>12538-120</td><td></td></tr><tr><td>MEM, NEAA, no Glutammina</td><td>Life Technologies</td><td>10370088</td><td></td></tr><tr><td>Topo &; &beta; III Tubulina&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G7121</td><td></td></tr><tr><td>Mouse &alpha; MBP (monoclonale)</td><td>Millipore</td><td>MAB381</td><td></td></tr><tr><td>Na piruvato&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>NAC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>NcoI-HF</td><td>NEB</td><td>R3193S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 4</td><td>NEB</td><td>B7004S</td><td></td></tr><tr><td>Medium neurobasale</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>NGF (mouse)</td><td>Alomone Labs</td><td>N-100</td><td></td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>&nbsp; 450-03</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo O1 - Topo anti-O1</td><td>Millipore</td><td>MAB344</td><td>Alternativa se le cellule di ibridoma O1 non sono disponibili</td></tr><tr><td>Cellule di ibridoma O1 Terreno</td><td></td><td></td><td>condizionato contenente anticorpi anti-O1 da utilizzare per l'immunopanazione</td></tr><tr><td>Anticorpo O4 - Topo anti-O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>Alternativa se le cellule di ibridoma O4 non sono disponibili</td></tr><tr><td>Cellule</td><td></td> <td>di ibridoma O4</td><td>Terreno condizionato contenente anticorpi anti-O4 da utilizzare per l'immunopanning</td></tr><tr><td>Cellule competenti</td><td>Life Technologies</td><td>A10460</td><td></td></tr><tr><td>Cellule competenti One Shot Stbl</td><td>Life Technologies</td><td>C7373-03</td><td></td></tr><tr><td>Sospensione di papaina</td><td>Worthington/Cooper</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>pBR8.91</td><td></td><td></td><td>Gentile dono del Dr. Denham10</td></tr><tr><td>PDGF-AA (Umano)</td><td>Peprotech</td><td>PT10013A500&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina 100x soluzione</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pENTRY4IRES2GFP</td><td>Invitrogen</td><td>11818-010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina (PEI)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-ornitina&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich&nbsp;</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>Progesterone&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Compressa inibitore della proteasi (Mini completo)</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td></td><td></td><td>Fornito con enzima clonasi</td></tr><tr><td>Putrescina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-5780</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio e alfa; neurofilamento</td><td>Millipore</td><td>AB1987&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio &alfa; MBP (policlonale)</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td></td></tr><tr><td>Ran2 cellule di ibridoma</td><td>ATCC</td><td>TIB-119</td><td>Terreno condizionato contenente anticorpo anti-Ran2 da utilizzare per l'immunopanning</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-CD140A/PDGFRa di ratto</td><td>BD Pharmingen</td><td>558774</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>NEB</td><td>R0157</td><td></td></tr><tr><td>Terreno</td><td></td><td></td> SOC <td>Fornito con batteri competenti</td></tr><tr><td>Selenito di sodio&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>NEB</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi tampone</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TE tampone pH8</td><td></td><td></td><td>Vedi soluzioni stock</td></tr><tr><td>TNE tampone</td><td></td><td></td><td></td>di lisi</tr><tr><td>Oligoelementi B</td><td>Cellgro&nbsp;</td><td>99-175-CI</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina (apo-Transferrina umana)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9201-1G</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina dall'albume d'uovo di gallina</td><td>Roche</td><td>10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (1x), rosso fenolo (0,05%)</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Lectina Griffonia Simplicifolia non coniugata BSL-1</td><td>Vector laboratories&nbsp;</td><td>L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Uridina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td></td></tr></tbody></table>

produzione e l'uso di lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria oligodendrocyte precursore in vitro saggi mielinizzazione

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Mielinizzazione è un processo complesso che coinvolge sia i neuroni e la mielina che formano le cellule gliali, oligodendrociti nel sistema nervoso centrale (SNC) e le cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico (PNS). Usiamo una vitro mielinizzazione test in un modello stabilito per lo studio del sistema nervoso centrale mielinizzazione in vitro. Per fare questo, le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) vengono aggiunti i primari roditore dorsale radice gangli (DRG) neuroni purificati per formare co-culture mielinizzanti. Per interrogare specificamente i ruoli che particolari proteine ​​espresse da oligodendrociti esercitano su di mielinizzazione abbiamo sviluppato protocolli che trasducono selettivamente OPC con il lentivirus overexpressing wild type, proteine ​​negativi costitutivamente attive o dominanti prima di essere testa di serie sui neuroni DRG. Questo ci permette di interrogare in particolare il ruolo di queste proteine ​​nella regolazione oligodendrogliali mielinizzazione. I protocolli possono essere applicati anche nello studio di otsuoi tipi cellulari, fornendo così un metodo che permette la manipolazione selettiva di proteine ​​espresse da un tipo cellulare desiderato, come oligodendrociti per lo studio mirato di segnalazione e meccanismi di compensazione. In conclusione, combinando la mielinizzazione test in vitro con lentivirali infettato OPC fornisce uno strumento strategico per l&#39;analisi dei meccanismi molecolari coinvolti nella mielinizzazione.

Il segnale legate chinasi 1 (Flag-Erk1) costrutto usato per la produzione di lentivirus è verificato da enzima di restrizione digerire dei costrutti utilizzati, inclusi sia i costrutti 2K7 ei costrutti packaging e accessori necessari per la produzione di virus extracellulare (Figura 3) flag-tagged . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52179/52179fig3highres.jpg"> Figura 3: verifica costrutto DNA. Tutti i costru...

Qui presentiamo protocolli che offrono una base flessibile e strategica per manipolare viralmente le cellule precursori degli oligodendrociti per sovraesprimere proteine di interesse al fine di interrogare specificamente il loro ruolo negli oligodendrociti attraverso il modello in vitro di mielinizzazione del sistema nervoso centrale.

Produzione e l'uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore In Vitro Saggi mielinizzazione

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di manipolare viralmente le cellule precursori degli oligodendrociti o OPC per sovraesprimere le proteine di interesse. Per lo studio in vitro della nazione di mielinizzazione del SNC, ciò si ottiene clonando prima un vettore lentivirale. I prossimi passi sono la produzione del lentivirus e la determinazione della concentrazione virale ottimale per l'esperimento.In seguito le OPC sezionate e coltivate vengono trasdotte con il lentivirus. Il passo finale consiste nel seminare le OPC trasdotte su neuroni in coltura sezionati dal DRG. Infine, le cocolture mielinizzanti vengono valutate per l'espressione della proteina mielinica mediante analisi western blot e visualizzate per la formazione di segmenti assonali mielinizzati mediante immunocolorazione.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli strumenti farmacologici, è che l'approccio lentivirale ci consente di sovraesprimere selettivamente proteine wild type o mutanti nel tipo di cellula desiderato, come in questo caso, gli oligodendrociti In preparazione clonare i 2K sette vettori di quaresima richiesti come descritto nel protocollo di testo la ma

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Biologia dello sviluppo

Descriviamo una piccola molecola a base di protocollo per la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in cellule precursori degli oligodendrociti (OPC). Questo protocollo genera Olig2 + NG2 + OPC ad alta efficienza da 30 giorni di differenziazione. Abbiamo anche descrivere un metodo per generare "chiodare" OPC che può sparare potenziali d'azione.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Lentivirali-mediata Knockdown Durante Ex Vivo</emEritropoiesi> di cellule staminali emopoietiche

In questo protocollo si descrive la produzione, purificazione e titolazione di vettori lentivirali. Forniamo un esempio di vettori lentivirali mediata consegna gene in colture primarie neuroni ed astrociti. I nostri metodi possono valere anche per altri tipi di...

Produzione di vettori lentivirali per Celle di trasduzione del Sistema Nervoso Centrale

Il video dimostra un protocollo per differenziare le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in oligodendrociti e indurre la mielinizzazione in una co-coltura con neuroni del ganglio della radice dorsale (DRG). Gli OPC sono trasdotti con vettori lentivirali che codificano per una proteina di segnalazione che regola la mielinizzazione. Le OPC trasdotte vengono co-coltivate con neuroni DRG per valutare la differenziazione in oligodendrociti e la mielinizzazione indotta dalla proteina di...

Un test di mielinizzazione indotta da trasduzione in vitro per cellule precursori di oligodendrociti

Gli oligodendrociti sono le cellule mielinizzanti del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento e la coltura dei loro precursori, le cellule progenitrici degli oligodendrociti, da cortecce di ratto, nonché un metodo quantitativo rapido e affidabile per valutare l'oligodendrogenesi in vitro in risposta a fattori sperimentali.

Preparazione delle Culture Rat progenitrici degli oligodendrociti e la quantificazione dei Oligodendrogenesis Utilizzando Dual-infrarossi fluorescenza Scansione

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

Basato sull'ingegneria calularisa in vitro dei precursori neuronali, sul loro co-trapianto in cervelli di tipo selvatico e sulla valutazione morbiterale accoppiata dei derivati "test" e "controllo", questo metodo consente una modellazione accurata del controllo genico in vivo morfologia dei neuroni in modo semplice e conveniente.

Trapianto intraventricolare di precursori neuronali ingegnerizzati per studi sulla neuroarchitettura In Vivo

Le interazioni neurone-glia nella neurodegenerazione non sono ben comprese a causa di strumenti e metodi inadeguati. Qui, descriviamo protocolli ottimizzati per ottenere neuroni indotti, cellule precursori degli oligodendrociti e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti umane e forniamo esempi dei valori di questi metodi nella comprensione dei contributi specifici del tipo di cellula nella malattia di Alzheimer.

Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti

Utilizzando il polimero cationico a basso costo polietilenimina (PEI), abbiamo prodotto particelle lentivirali per l'espressione stabile di shRNA in cellule staminali embrionali umane H9 (hESC) e cellule progenitrici neurali derivate da H9 trasdotte transitoriamente (NPC) ad alta efficienza.

Consegna mediata lentivirale di shRNA a hESC e NPC utilizzando polietilenimina polimerica cationica a basso costo (PEI)

Scopri come produrre e utilizzare lentivirus per trasdurre selettivamente precursori di oligodendrociti primari in saggi di mielinizzazione in vitro. Questo metodo consente di studiare il ruolo delle proteine nel sistema nervoso centrale.

Produzione e luso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore In Vitro Saggi mielinizzazione (Video) | JoVE Journal

Produzione e l'uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore In Vitro Saggi mielinizzazione

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