Produzione e l'uso di Lentivirus a celle selettivamente trasdurre primaria Oligodendrocyte precursore In Vitro Saggi mielinizzazione

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di manipolare viralmente le cellule precursori degli oligodendrociti o OPC per sovraesprimere le proteine di interesse. Per lo studio in vitro della nazione di mielinizzazione del SNC, ciò si ottiene clonando prima un vettore lentivirale. I prossimi passi sono la produzione del lentivirus e la determinazione della concentrazione virale ottimale per l'esperimento.

In seguito le OPC sezionate e coltivate vengono trasdotte con il lentivirus. Il passo finale consiste nel seminare le OPC trasdotte su neuroni in coltura sezionati dal DRG. Infine, le cocolture mielinizzanti vengono valutate per l'espressione della proteina mielinica mediante analisi western blot e visualizzate per la formazione di segmenti assonali mielinizzati mediante immunocolorazione.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli strumenti farmacologici, è che l'approccio lentivirale ci consente di sovraesprimere selettivamente proteine wild type o mutanti nel tipo di cellula desiderato, come in questo caso, gli oligodendrociti In preparazione clonare i 2K sette vettori di quaresima richiesti come descritto nel protocollo di testo la mattina del giorno della trasfezione, preparare 32 milioni di cellule T HEK 2 93 in un pallone T 1 75 contenente 25 millilitri di terreno. Fondamentalmente, queste cellule devono essere bloccate prima della trasfezione, quindi placcale prima se necessario. In una provetta Falcon da 50 millilitri, preparare una miscela master per la trasfezione del pallone T 1 75 come descritto nella tabella uno, aggiungere il DNA al vortice di DMEM caldo, quindi aggiungere il PEI sterile per ultimo per evitare precipitazioni premature.

Mescolare bene capovolgendo la provetta tre o quattro volte, quindi incubare la miscela per circa 15 minuti sul banco. Cambiare il terreno sulle celle e quindi aggiungere la miscela di trasfezione. DROPWISE mescola delicatamente il terreno sulle cellule e poi incuba le cellule durante la notte.

Il giorno seguente. L'espressione della GFP può essere verificata mediante microscopia a fluorescenza. 48 ore dopo la trasfezione, raccogliere il primo lotto di surnatante virale e aggiungere 25 millilitri di terreno fresco alle cellule.

Centrifugare il surnatante virale a 1,140 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante virale senza il pellet di detriti cellulari in una nuova provetta e conservarlo a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, a 72 ore dalla trasfezione, raccogliere l'ultimo lotto di centrifuga di surnatante virale per rimuovere i detriti cellulari e raccoglierlo con il primo lotto di surnatante virale eliminato.

Quindi concentrare il virus mediante ultracentrifugazione del surnatante virale a 170.000 G per 90 minuti. A quattro gradi Celsius. Scaricare l'ultra centrifuga e versare via il surnatante, lasciando un palato di PEI precipitato e il virus, che non è visibile sul fondo della provetta da 30 millilitri.

Ripeti questo processo. Centrifugare tutto il supernat virale in lotti nelle stesse provette da 30 millilitri per concentrare il virus e risospendere il virus in ciascuna provetta per ultracentrifuga. Aggiungere 500 microlitri di terreno Sato e coprire il tubo con la pellicola.

Quindi agitare il tubo per 30 secondi e rimuovere meccanicamente il pellet con una punta per pipetta. Ripetere questo ciclo di spostamento del vortice circa sei volte per assicurarsi che il pellet sia completamente sospeso nel mezzo Sato. Ora raccogli tutto il virus risospeso in Sato in una nuova microprovetta.

Far girare brevemente il surnatante in piscina alla massima velocità per un minuto. Per pellettare il PEI, raccogliere il surnatante contenente il virus e filtrare facendo passare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 micron utilizzando una siringa per avvolgere. Aliquotare il virus purificato in Sedia in volumi da 2050 e 100 microlitri e conservarli tutti a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius.

Per questo protocollo, avere cellule precursori di oligodendrociti primari. OPC coltivate in piastre da 10 centimetri con 10 millilitri di sedia contenenti i seguenti fattori di crescita, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT tre, e per le cellule devono essere state coltivate per 24 ore sotto l'8% di anidride carbonica. Iniziare con l'aspirazione del supporto e rimuoverlo completamente.

Quindi sostituirlo con 10 millilitri dello stesso terreno con i fattori di crescita. Infetta i tuoi OPC con lentivirus, esprimendo la proteina di interesse aggiungendo il volume richiesto di virus per goccia nel terreno. Sempre in una piastra OPC separata, mescolare il lentivirus di controllo che esprime solo GFP nella coltura del terreno, le cellule per altre 48 ore.

Quindi raccogliere gli OPC dalle piastre per la semina sui neuroni GRG in coltura. Per prima cosa sciacquare due volte ogni piastra con otto millilitri di EBSS. Preparare un millilitro di tripsina EDTA 0,05% con nove millilitri di EBSS caldo.

Aggiungere cinque millilitri di tripsina diluita a ciascuna piastra. Incubare a 37 gradi Celsius per un massimo di due minuti. Neutralizzare la tripsina aggiungendo cinque millilitri di FBS al 30% in EBSS.

Quindi utilizzando una pipetta da 10 millilitri. Lavare gli OPC dalla superficie della piastra. Gira la piastra di un quarto di giro ogni volta per raccogliere tutte le celle.

Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a temperatura ambiente per 15 minuti a 180 Gs.Ora aspirare il surnatante e risus. Sospendi il pellet di cellule in un millilitro di terreno saddo caldo senza fattori di crescita e conta le cellule.

Successivamente, preparare i neuroni DRG che vengono coltivati sui vetrini coprioggetto da 22 millimetri aspirando completamente il terreno dalla loro piastra. Quindi seminare delicatamente 200.000 OPC goccia a goccia su ciascun vetrino coprioggetti. Il volume di semina deve essere inferiore a 200 microlitri per vetrino coprioggetto.

Lascia che le cellule si depositino senza muovere la piastra Dopo 10 minuti, ricopri ogni pozzetto con un millilitro di liquido caldo. Ora rigioca gli OPC gemelli rimanenti. Poiché contengono fattori di crescita, possono essere utilizzati in seguito per verificare l'espressione della proteina di interesse.

Una chinasi correlata al segnale extracellulare contrassegnata con flag. Un costrutto è stato utilizzato per la restrizione della produzione di lentivirus: gli enzimi sono stati utilizzati per verificare il costrutto di imballaggio e il costrutto accessorio per determinare la diluizione ottimale del virus da utilizzare sugli OPC. Il lentivirus IR one è stato titolato in cellule T HEK 2 93 con un intervallo di diluizione virale in cellule T HEK 2 93.

I livelli di espressione del gene di interesse sono aumentati con il tempo. Successivamente, gli OPC purificati sono stati infettati e coltivati per almeno due giorni per garantire l'espressione del transgene. I livelli di FLAG e GFP sono stati confermati nelle OPC sorelle.

Gli OPC sono stati quindi posizionati sui neuroni DRG. Gli OPC si sono poi differenziati in oligodendrociti e, secondo quanto valutato dagli occidentali, hanno iniziato a esprimere proteine mieliniche. Alcuni oligodendrociti maturi mielinizzati, che sono stati visualizzati dagli assoni di colorazione MBP, sono stati colorati con neurofilamento o beta tre tubulina per garantire che le densità degli assoni fossero prese in considerazione.

Quando si analizzano i livelli di mielinizzazione Dopo aver seminato gli OPC, è importante la coltura. Gli APC gemelli. In questo modo, la proteina di interesse o il tag sulla proteina di interesse, quell'espressione può essere verificata nelle APC sorelle se non può essere verificata nella co-coltura.