Name: Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Impara a modellare la candidosi mucosa in larve di zebrafish mediante iniezione nella vescica natatoria. Questo metodo consente l'imaging in tempo reale delle interazioni tra patogeno e sistema immunitario.

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Gli autori ringraziano il Dr. Le Trinh e Dr. Tobin per generosamente fornire la α-catenina: linea pesce citrino e Bill Jackman per averci permesso di fare le riprese nel suo laboratorio. Gli autori riconoscono le fonti di finanziamento National Institutes of Health (Grants 5P20RR016463, 8P20GM103423 e R15AI094406) e USDA (Project # ME0-H-1-00517-13). Questo manoscritto è pubblicato come principale dell&#39;agricoltura e delle foreste Esperimento numero di pubblicazione Stazione 3371.

NOTA: Tutti i protocolli di cura zebrafish ed esperimenti sono stati eseguiti in conformità alle linee guida NIH sotto Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocollo A2012-11-03. 1. Zebrafish allevamento a 4 giorni dopo la fecondazione <ol><li> Raccogliere AB zebrafish, o qualsiasi altra linee transgeniche, entro il primo 3 ore dopo la fecondazione, come mostrato in un altro video 34. </li><li> Incubare 120 uova in un 15 centimetri piastre Petri contenenti 150 ml di E3 Media (5 NaCl mm 0,17 mM KCl; 0,33 mm CaCl 2; 0,33 mm MgCl 2; 2 HEPES mM; pH 6.8) con il blu di metilene (0,3 mg / ml finale concentrazione) in un incubatore a 33 ° con 12/12 luce / buio fotoperiodo. </li><li> Sostituire la media dopo 6 ore con E3 + PTU (1-fenil-2-tiourea, 10 mg / ml concentrazione finale) e rimuovere le uova morti. </li><li> Incubare per 4 giorni a 33 ° C, lo scambio dei mezzi con fresca E3 + PTU dopo 2 giorni. </li></ol> 2. Inproiezione Micro-ago Preparazione <ol><li> Estrarre borosilicato capillare (OD 1,2 millimetri; ID 0,69 millimetri) in un micro-ago con un estrattore ago con le seguenti impostazioni (550 Calore, 0 Pull, 130 Velocity; 110 Time). NOTA: Le impostazioni variano da filamento a filamento per ottenere micro-aghi di forma simile (vedi Figura 1) e dovrà essere riadattato ogni volta che viene installato un nuovo filamento. </li><li> Riempire un micro-ago con 3 ml di 0,4 micron filtrata salina tampone fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4; 1,8 mm KH 2 PO 4; pH 7.4) con un 20 microlitri microloader pipetta tip. </li><li> Impostare il micro-ago su un supporto micropipetta su un micromanipolatore collegata ad un sistema di iniezione a pressione. Impostare la pressione di iniezione a 30 PSI e la durata dell&#39;impulso a 30 msec. </li><li> Utilizzando una piastra di Petri con acqua distillata, abbassare il micro-ago fino a 1/5 dell&#39;ago è nell&#39;acqua. Agganciare il micro-ago with pinzette sottili appena sotto il livello dell&#39;acqua. Portare il micro-ago fuori dall&#39;acqua e spingere il pedale più volte fino a visualizzare un bolo. </li><li> Misurare il diametro del bolo abbassando il micro-ago su un emocitometro strati con una goccia di tipo A olio per immersione. Regolare la durata dell&#39;impulso per ottenere il volume desiderato (vedi tabella 1). </li><li> Impostare la contropressione per il bolo di rimanere stabile in olio (abbassare la pressione se il bolo aumenta il volume e aumentare la contropressione se il volume di bolo diminuisce). Registrare la durata dell&#39;impulso per ogni micro-ago. </li><li> Rimuovere la PBS dal micro-ago aspirando usando un puntale microloader ed espellere la sinistra-over PBS ponendolo nuovamente l&#39;iniettore e lanciando l&#39;interruttore di impulso continuo. Prenotare ogni micro-ago. </li></ol> 3. Candida Preparazione <ol><li> Streak Candida albicans trasformate con codone ottimizzato dTomato, GFP, BFP, EOS o RemotoRed da uno stock congelati (-80 ° C magazzino in 25% glicerolo) utilizzando un bastoncino di legno su una sterile destrosio lievito peptine (YPD) piastra di agar (10 g estratto / L di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di destrosio , 20 g / L di agar, autoclave e versò 25 ml in piastre di Petri) e incubare una notte a 30 ° C. </li><li> Scegliere una colonia utilizzando un bastoncino di legno sterile e inoculare 5 ml di liquido YPD (estratto di 10 g / L di lievito, 20 g / L peptone, 20 g / L di destrosio, autoclavato e asetticamente aliquotato in 5 ml di 16 x 150 mm coltura vetro tubi). </li><li> Incubare per una notte a 30 ° C in un tamburo a rulli a 60 rpm. </li><li> Raccogliere 1 ml di C. cultura albicans e il trasferimento in un 1,7 ml provetta da centrifuga sterile. </li><li> Centrifugare a 5.000 g per un paio di secondi. Svuotare il surnatante e aggiungere accuratamente 1 ml di PBS sterile, vortice. Ripetere due volte. </li><li> Contare le colonie usando un emocitometro diluendo 1 ml di brodo 1: 1000 in PBS sterile. </li></ol> 4. Iniettare Zebrafish inla vescica natatoria <ol><li> Riscaldare un piatto di iniezione (2% agarosio) per 30 min in un incubatore a 33 °. </li><li> Al tempo desiderato, rimuovere il 100 dei 150 ml di E3 + PTU dalla piastra Petri 15 centimetri contenente il pesce per iniettare utilizzando una pipetta 25 ml senza aspirare alcun zebrafish. </li><li> Anestetizzare 4 dpf zebrafish aggiungendo 2 ml di un / ml tamponato tricaine metano sulfonato magazzino 4 mg (TR) per i 50 ml supporti rimanenti (concentrazione finale di 200 mg / ml) e attendere 15 min. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, selezionare il pesce con una vescica natatoria gonfiato. Pesce può anche essere proiettato in quel momento per fenotipo omogeneo, come la distribuzione dei neutrofili in mpo: linea GFP utilizzando un epifluorescenza dissezione microscopio. </li><li> Diluire il C. albicans magazzino dalla sua concentrazione iniziale (fase 3.8) a 1,5 x 10 7 unità formanti colonia per ml (ufc / ml) in PBS. </li><li> Trasferire 30 zebrafish sul piatto di iniezione con un tubo di plastica di trasferimentotte e rimuovere il supporto in eccesso. </li><li> Utilizzando uno strumento di pesca-wire (0,012 pollici di diametro filo da pesca super-incollato in un capillare borosilicato), fare 3 linee di 10 pesci, tenendo il piatto iniezione verticale e orientare il pesce in verticale. </li><li> Togliere la carta in eccesso. </li><li> Vortice accuratamente il tubo con 1,5 x 10 7 CFU / ml C. albicans. </li><li> Riempire un micro-ago con 3 ml di C. albicans utilizzando una nuova punta microloader pipetta e impostare la durata dell&#39;impulso per l&#39;impostazione appropriata (vedere il punto 2.9). </li><li> Ruotare il piatto iniezione per formare un angolo di 20 ° tra il micro-ago e la testa del pesce, puntando verso la parte posteriore della vescica natatoria (Figura 3A). </li><li> Premere il micro-ago nella vescica natatoria, assicurandosi che il foro dell&#39;ago sia nel lume, e premere il pedale una volta. </li><li> Ripetere l&#39;operazione per ogni pesce e trasferire a un piatto di recupero (25 ml E3 + PTU) inondando il piatto con un E3d svuotamento nel piatto di recupero. </li><li> Trasferire altri 30 pesce al piatto iniezione. </li><li> Ripetere l&#39;iniezione con un nuovo micro-ago riempito con fondo in agitazione C. albicans. </li><li> Fine iniettando controllo PBS, se necessario, usando un piatto diversi di iniezione per evitare la contaminazione e versare in un piatto di recupero separato (passo 4.10). </li></ol> 5. Screening il pesce per desiderata Inoculum <ol><li> Preparare 40 ml di 0,4% bassofondente soluzione di agarosio (LMA) aggiungendo 160 mg di agarosio a basso punto di fusione 40 ml di E3, in ebollizione da microonde fino a completa dissoluzione e raffreddamento a 37 ° C. Aggiungere 400 ml di TR (concentrazione finale di 200 mg / ml), una volta raffreddato. </li><li> Dopo 30 min di recupero, anestetizzare il pesce come descritto (passo 4.3 usando solo 1 ml di TR in 25 mL E3 + PTU, concentrazione finale 200 mg / ml). </li><li> Trasferimento 30 pesci (con il minor numero possibile di mezzi) a 2 ml di LMA in una barca di peso. </li><li> Aspirare singoli pesci con una pipetta di trasferimento e piatto il pesce con 1 goccia di LMA in una piastra di imaging a 96 pozzetti, utilizzando solo i 10 x 6 pozzi centrali. </li><li> Ripetere fino a quando tutti i pesci di schermo vengono caricati alla piastra di imaging. </li><li> Ai media solidificano a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Posizionare il pesce dalla loro parte, facendo in modo che siano a contatto con il fondo di vetro. </li><li> Usando l&#39;obiettivo 20X su un epifluorescenza / microscopio confocale invertita e il filtro appropriato, registrare il numero di C. cellule di lievito albicans in vescica natatoria di ogni pesce. </li><li> Selezionare il pesce con 15-25 cellule di lievito nella vescica natatoria (o inoculo desiderato), eutanasia non selezionata pesce (800 ug / ml di TR in E3) e ritornare pesci selezionato in un piatto profondo Petri con 50 ml di E3 + PTU by aggiungendo 3 gocce di E3 alla piastra di imaging pozzetti selezionati ed aspirando il pesce con una pipetta di plastica trasferimento. </li><li> Incubare a 33 ° C per la durata desiderata. </li></ol> 6. Imaging the Fish post-selezione <ol><li> Al momento desiderato, eliminare 25 dei 50 ml di media E3 + PTU dalla capsula di Petri profondo contenente il pesce di immagine. </li><li> Anestetizzare il pesce come descritto (passo 4.3 usando solo 1 ml di TR in 25 ml E3 + PTU rimanente, la concentrazione finale di 200 mg / ml). </li><li> Piatto il pesce in un piatto di imaging 96-bene e la posizione in modo appropriato (passi 5,3-5,7). </li><li> Immagine di scansione microscopia confocale utilizzando i laser appropriati e filtri di emissione. Prima concentrarsi sul pesce con l&#39;obiettivo 4X in contrasto interferenziale differenziale (DIC) e di acquisire immagini della regione di interesse utilizzando l&#39;obiettivo 20X con i laser confocale in modalità di scansione con 2 velocità msec / pixel e 1024 x 600 pixel aspect ratio. Acquisire Z-stack con 1 micron dimensione del passo, applicando modalità filtro Kalman di 3 fotogrammi. </li><li> Ritorno a un piatto fondo di Petri con 50 ml E3 + PTU o in individuapozzi l (piatto 24 pozzetti cultura, 3 ml E3 + PTU) e incubare a 33 ° C. </li></ol> 7. Dissecting la vescica natatoria <ol><li> Riempire una siringa da 10 ml con grasso alto vuoto. </li><li> Preparare una LMA 2% (passo 5,3 con 160 mg di bassa fusione agarosio in 8 ml di E3). </li><li> Al momento desiderato, anestetizzare il pesce (fase 5.2). </li><li> Trasferire 10 pesci in una provetta 1,7 ml centrifuga con 1 ml di E3 e euthanize aggiungendo 200 ml di 4 mg / ml Tricaine (concentrazione finale 800 mg / ml) al tubo da centrifuga e incubando per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare un vetrino di imaging ponendo 4 gocce di grasso per vuoto in un quadrato, distanti 1 cm su un MicroSlide (75 x 25 mm, Figura 2). </li><li> Mettere 2 gocce di 2% LMA nel centro della piazza. </li><li> Posizionare un pesce su un vetrino separato sotto un microscopio da dissezione e verificare che il cuore ha smesso di battere, rimuovere l&#39;acqua in eccesso. </li><li&gt; con una pinzetta belle sezionare il vescica natatoria mantenendo la testa in una posizione fissa con le pinze sinistra e tirando giù l&#39;intestino anteriore con le pinzette destra (Figura 4A). </li><li> Sollevare la vescica natatoria dal condotto pneumatico con le pinzette sinistra, separandolo dal tratto digerente, e posizionarlo al centro della LMA 2% prima che solidifica. </li><li> Inserire una copertura antiscivolo (18 x 18 mm) sulla parte superiore del vetrino imaging e spingerla fino a toccare il grasso per vuoto, nonche la LMA (Figura 2). </li><li> Immagine entro 10 minuti di dissezione, come descritto al punto 6.4. Ripetere il passaggio 7,7-7,11 con gli altri pesci. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Anticipi e limitazioni della microiniezione modello di malattia vescica natatoria Il modello qui presentato è un&#39;estensione del modello di immersione mucosa candidosi descritto in Gratacap et al (2013).; aggiunge i vantaggi di un tempo un&#39;infezione controllata, una dose un&#39;infezione altamente riproducibile, e quindi una maggiore efficienza. Dimostriamo qui nuovi metodi che permettono non invasivo documentazione temporale delle dinamiche di infezione in modo molto dettagliat...

Le infezioni della mucosa possono portare a infezioni del flusso sanguigno pericolose per la vita a causa del danno della barriera epiteliale, che consente agli agenti patogeni di accedere all'ambiente sistemico1,2. Inoltre, le infezioni delle mucose possono anche causare un'immunopatologia significativa anche se contenute esternamente3-5. Il fungo unicellulare commensale Candida albicans è presente nella maggior parte della popolazione nella cavità orale e in altri siti mucosi6-9. Sebbene normalmente contenuti da risposte immunitarie innate e adattative, i difetti immunitari innati e gli interventi medici possono portare a una grave candidosi della mucosa. L'assalto alla barriera epiteliale si traduce in un aumento del rischio di malattia disseminata pericolosa per la vita e immunopatologia, come nel caso della candidosi vulvo-vaginale, inoltre la colonizzazione da C. albicans è stata collegata all'omeostasi immunitaria polmonare10,11. La candidosi disseminata è ora la quarta infezione del flusso sanguigno più comune nelle unità di terapia intensiva12 e la mortalità fino al 40% la rende una delle principali preoccupazioni. A causa dell'aumento dei trattamenti immunomodulatori per i pazienti con malattie autoimmuni, cancro o trapianti d'organo, è imperativo comprendere l'interazione tra questo patogeno e il compartimento immunitario della mucosa.
La maggior parte dei progressi biologici cellulari riguardanti le interazioni C. albicans-cellula a livello della mucosa provengono da modelli in vitro13-15 e murini16-18. Entrambi questi approcci presentano vantaggi distinti, ma la capacità di visualizzare cellule vive ad alta risoluzione in un ospite intatto ha limitato la caratterizzazione temporale e spaziale dell'infezione. Per questi studi, c'è la necessità di un modello in vivo in cui l'interazione tra patogeno, cellule immunitarie innate ed epiteliali possa essere visualizzata in un ospite vertebrato intatto.
Il pesce zebra è emerso come uno strumento inestimabile per la comprensione delle malattie umane, principalmente grazie alla sua trasparenza e alla possibilità di manipolare geneticamente. Lo sviluppo delle cellule e degli organi è stato ripreso in modo squisitamente dettagliato, il che ha portato alla descrizione di nuovi comportamenti delle cellule immunitarie, come il comportamento delle cellule T nel timo19 in via di sviluppo o la battaglia tra micobatteri intracellulari e fagociti20-22. Lavori recenti hanno descritto le interazioni microbico-ospite intestinale nel pesce zebra e hanno dimostrato che la colonizzazione microbica del tratto intestinale influenza la fisiologia intestinale dell'ospite e la resistenza ad altre infezioni23,24. Inoltre, è stata descritta un'infezione attraverso l'epitelio intestinale per diversi agenti patogeni.
A differenza del tratto intestinale, la vescica natatoria rappresenta un modello di mucosa più isolato e complementare. Questo organo è un'estensione del tubo intestinale in via di sviluppo e si forma anteriormente al fegato e al pancreas25,26. Produce tensioattivo, muco e peptidi antimicrobici27,28 e anatomicamente, oltre che ontogeneticamente, questo organo è considerato un omologo del polmone dei mammiferi29,30. Poiché il condotto pneumatico rimane collegato all'intestino nel pesce zebra, ciò consente l'infezione da immersione in modo naturale. Sorprendentemente, le uniche infezioni naturali conosciute dei pesci con le specie di Candida sono le infezioni da C. albicans nella vescica natatoria31. Recentemente abbiamo descritto un modello sperimentale di infezione da immersione in cui C. albicans infetta la vescica natatoria e abbiamo scoperto che questa infezione ricapitola alcuni dei segni distintivi dell'interazione C. albicans-epiteliale in vitro32,33. 
Nel metodo qui presentato, il modello originale di infezione da immersione viene migliorato iniettando direttamente C. albicans nella vescica natatoria di 4 giorni dopo la fecondazione (dpf) zebrafish. Ciò consente un controllo temporale preciso dell'infezione e un inoculo altamente riproducibile. Consente un imaging intravitale dettagliato, insieme alla versatilità del modello zebrafish. Come esempio di ciò che può essere fatto con questo metodo, presentiamo le dinamiche spazio-temporali della crescita di C. albicans insieme al reclutamento dei neutrofili nel sito di infezione. Poiché il tessuto della vescica natatoria del pesce zebra è difficile da visualizzare intravitalmente, presentiamo anche una tecnica di dissezione rapida della vescica natatoria che migliora il segnale di fluorescenza e la risoluzione microscopica. Questi metodi ampliano la cassetta degli attrezzi per la ricerca fungina, immunologica e dell'acquacoltura, oltre a descrivere una nuova via di infezione che può essere tradotta per modellare altre infezioni fungine, batteriche o virali delle superfici mucose.

<table><tbody><tr><td>Provette da 1,7 ml</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri profonde</td><td>Fisher Scientific</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-726</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-264</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR Scientific</td><td>90000-760</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta fine (Dumont Dumoxel #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Tasselli in legno</td><td>VWR Scientific</td><td>10805-018</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-722</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette marrone fiammante</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Capillare borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di iniezione MPPI-3</td><td>Strumentazione scientifica applicata Unità di</td> contropressione <td>MPPI-3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Strumentazione scientifica applicata Kit</td><td></td> porta micropipette BPU <td></td></tr><tr><td></td><td>Strumentazione scientifica applicata Interruttore</td> a pedale <td>MPIP</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Applied Scientific Strumentazione</td><td>FSW</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Strumentazione Scientifica Applicata</td><td>MM33</td><td></td></tr><tr><td>Base Magnetica</td><td>Strumentazione Scientifica Applicata</td><td>Base</td><td></td>Magnetica</tr><tr><td>Tricaina metano solfonato</td><td>Western Chemical Inc.</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Olympus</td><td>SZ61 top SZX-ILLB2-100 base</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>IX-81 con sistema confocale a scansione laser FV-1000</td> Obiettivo per microscopio 20X Olympus UPlanSApo 20x/0.75 Tamburo a rulli New Brunswick Scientific TC-7 Puntali per pipette Microloader <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Provette per colture in vetro (16 x 150 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>60825-435</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4534-500GP</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4532-500GP</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH0246-500GP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>BDH4520-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Bambini argilla (Play-Doh)</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C69-500</td><td></td></tr><tr><td>Blu di metilene</td><td>VWR Scientific</td><td>VW6276-0</td><td></td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>Emocitometro ( </td><td></td><td></td><td></td>Olio</tr> da <tr><td>immersione di tipo A</td><td>Blue Marble Products</td><td>51935</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>VWR Scientific</td><td>14216-184</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Lonza)</td><td>VWR Scientific</td><td>12001-870</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4 </td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Filo da pesca</td><td>Piastra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di imaging a 96 pozzetti (Sensoplate)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655892</td><td></td></tr><tr><td>Grasso per alto vuoto (Dow Corning)</td><td>VWR Scientific</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microvetrini (25 x 75 mm)</td><td>VWR Scientific</td><td>48300-025</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti (18 x 18 mm), n. 1,5</td><td>VWR Scientific</td><td>48366-045</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 15 cm (plastica Olympus)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-106</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo (prodotti chimici EMD)</td>Piastra di coltura <td>VWR Scientific</td><td>EMGX0185-5</td><td></td></tr><tr><td>a 24 pozzetti (plastica Olympus)</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>Peso barche (8,9 cm)</td><td>VWR Scientific</td><td>89106-766</td><td></td></tr></tbody></table>

modellazione mucosa candidosi in zebrafish larvale da vescica natatoria injection

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Difesa precoce contro i patogeni delle mucose consiste sia una barriera epiteliale e cellule immunitarie innate. La immunocompetency di entrambi, e la loro intercomunicazione, sono di primaria importanza per la protezione contro le infezioni. Le interazioni di cellule immunitarie innate epiteliali e con un agente patogeno è meglio studiati in vivo, in cui il comportamento complesso si sviluppa nel tempo e nello spazio. Tuttavia, i modelli esistenti non consentono un facile spazio-temporale delle immagini della battaglia con i patogeni a livello della mucosa. Il modello sviluppato qui crea un&#39;infezione della mucosa con iniezione diretta del patogeno fungino, Candida albicans, nella vescica natatoria di zebrafish giovanile. L&#39;infezione risultante permette imaging ad alta risoluzione di comportamenti epiteliale e innata cellule immunitarie durante lo sviluppo della malattia della mucosa. La versatilità di questo metodo permette di interrogatorio di accoglienza per sondare la sequenza riportata di eventi immunitari che portano a phreclutamento agocyte e di esaminare il ruolo di particolari tipi di cellule e percorsi molecolari nella protezione. Inoltre, il comportamento del patogeno come funzione di attacco immunitario può essere ripreso simultaneamente utilizzando proteine ​​esprimono fluorescente C. albicans. Risoluzione spaziale Aumento della interazione ospite-patogeno è possibile anche utilizzando la tecnica rapida vescica natatoria dissezione descritta. Il modello di infezione della mucosa descritto qui è semplice e altamente riproducibile, che lo rende uno strumento prezioso per lo studio della mucosa candidosi. Questo sistema può anche essere sostanzialmente traducibile ad altri patogeni mucosali come microbi micobatteri, batteriche o virali che normalmente infettano attraverso superfici epiteliali.

Microiniezione nella vescica natatoria posteriori Il metodo sperimentale qui presentato descrive l'iniezione di una dose costante di C. cellule di lievito albicans nella vescica natatoria di 4 dpf zebrafish. Lavoro precedente con il modello di immersione suggerisce che la risposta immunitaria vescica natatoria a C. albicans è simile a mammiferi mucosa candidosi 32. Qui mostriamo un metodo di infezione modificato che è più semplice, riproducibile e rapida; d...

In vivo le interazioni spazio-temporali del patogeno e delle difese immunitarie a livello della mucosa non sono facilmente visualizzabili negli ospiti vertebrati esistenti. Il metodo qui presentato descrive una piattaforma versatile per studiare la candidosi mucosa nei vertebrati vivi utilizzando la vescica natatoria del giovane zebrafish come sito di infezione.

Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare la candidosi mucosa utilizzando il pesce zebra giovane. Ciò si ottiene caricando prima una soluzione contenente gli albicani vivi in un microago. Nella seconda fase, un volume definito di cellule di lievito viene iniettato nella vescica natatoria di un giovane pesce zebra.Successivamente, i pesci vengono sottoposti a screening per ottenere un inoculo omogeneo e incubati per il tempo desiderato. Nella fase finale, la microscopia confocale viene utilizzata per seguire l'interazione dinamica del patogeno con il sistema immunitario del pesce zebra. Inoltre, la vescica natatoria può essere microsezionata per ottenere immagini confocali a risoluzione più elevata.Il metodo che stiamo presentando qui risponde a domande chiave dell'immunologia fungina e della microbiologia, come ad esempio qual è la sequenza precisa di eventi che portano a una risposta immunitaria fallita al patogeno fungino e ai fari del candidale sulle superfici mucose. Prima di iniziare la procedura, scaldare una capsula per iniezione contenente il 2%aros in un'incubatrice a 33 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per rimuovere 100 millilitri di terreno E tre più PTU da una piastra del quarto giorno, dopo la fecondazione del pesce zebra, facendo attenzione a non aspirare nessuno dei pesci, e aggiungere due millilitri di quattro milligrammi per millilitro.Trica metano solfonato stock ai media per anestetizzare gli animali. Dopo 15 minuti, utilizzare un microscopio da dissezione per identificare il pesce con la vescica natatoria gonfiata e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire 30 pesci zebra sulla capsula di iniezione preriscaldata. Rimuovere il terreno in eccesso, quindi tenere il piatto ad angolo e utilizzare una lenza da 0,012 pollici di diametro super incollata in un capillare di silicato di boro per creare tre linee di 10 pesci allineati verticalmente ciascuno successivamente a fondo vorticare un tubo di albicans di mare appena preparato a una concentrazione di 1,5 volte 10 al settimo CFU per millilitro.E poi caricare tre microlitri della soluzione di lievito su un microago tagliato EC. Impostare la durata dell'impulso sull'impostazione appropriata. Quindi ruotare la capsula di iniezione per raggiungere un angolo di 20 gradi tra il microago e la testa del pesce, puntando verso la parte posteriore della vescica natatoria.Ora spingi il microago nella vescica natatoria, assicurandoti che il foro dell'ago sia nel lume e premi la pozzanghera. Una volta che la verifica di quali pesci sono stati iniettati è relativamente facile, poiché il bolo sposta la bolla d'aria e la parte posteriore della vescica natatoria viene successivamente riempita di terreno, la co-iniezione di rosso fenolo con il bolo può facilitare ulteriormente la visualizzazione di un'iniezione riuscita. Dopo aver iniettato tutti e 30 i pesci, inondare la capsula con il terreno E tre e poi svuotare il pesce nella capsula di recupero.Trasferire 10 animali in una provetta da centrifuga da 1,7 millilitri contenente un millilitro di terreno E tre e sopprimere il pesce con 200 microlitri di trica. Successivamente, per ogni animale, disporre quattro gocce di grasso sottovuoto in un quadrato, a un centimetro di distanza l'una dall'altra su un micro vetrino, e aggiungere due gocce di grasso appena preparato, a basso fondente al 2% al centro del quadrato. Successivamente, posizionare un pesce su un vetrino separato sotto un microscopio da dissezione e verificare che il cuore dell'animale abbia smesso di battere e rimuovere l'acqua in eccesso.Ora usa un paio di pinzette sottili per tenere la testa in una posizione fissa e un altro per tirare verso il basso l'intestino anteriore. Prelevare la vescica natatoria dal condotto pneumatico, separandola dal tubo digerente, e posizionarla al centro di uno dei micro vetrini preparati prima che l'agro si solidifichi. Infine, posizionare un vetrino coprinte sul tessuto spingendo delicatamente verso il basso fino a toccare il grasso sottovuoto e l'agarosio e visualizzare la vescica natatoria entro 10 minuti dal prelievo.Iniettando quattro nanolitri di albicans di mare a 1,5 volte 10 del settimo. Le CFU per millilitro forniscono i dati più coerenti, risultando in un intervallo da 10 a 50 cellule di lievito per pesce. Restringendo l'inoculo a 15-25 cellule di lievito si ottiene un fenotipo e una risposta ancora più stretti.I neutrofili svolgono un ruolo chiave nella resistenza alla candidosi nei topi e nell'uomo, e l'infezione della vescica natatoria del pesce zebra con albicans vivi porta ad un reclutamento rapido e sostenuto di neutrofili. Ciò non si verifica quando vengono iniettate cellule di lievito che uccidono il calore. I filamenti si sviluppano rapidamente dopo l'iniezione delle cellule di lievito con una crescita filamentosa che continua per le prime 24 ore dopo l'iniezione, dopodiché questo numero inizia a diminuire la capacità di seguire i singoli pesci in modo non invasivo consente questi studi longitudinali ed evidenzia le differenze da individuo a individuo nella progressione della malattia e nelle risposte dell'ospite.Un protocollo sperimentale che rimane poco pratico nell'imaging murino, le interazioni delle cellule immunitarie o epiteliali con c albicans sono relativamente facili nel modello qui presentato. Tuttavia, la dissezione della vescica natatoria, come appena dimostrato, migliora significativamente la qualità dell'imaging. Ciò è particolarmente utile quando si visualizzano linee di pesci transgenici in cui la fluorescenza è espressa in modo ubiquitario e c'è fluorescenza estranea nel tessuto circostante, come osservato in queste immagini di una vescica natatoria sezionata dalla linea di pesci citrino alfa Catine.Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la tecnologia morph o il trattamento di inibizione chimica, possono essere utilizzati per rispondere a domande come, qual è il ruolo di una particolare cellula immunitaria o della via di segnalazione nella candidosi della mucosa.

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