Modellazione mucosa Candidosi in Zebrafish larvale da vescica natatoria Injection

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di modellare la candidosi mucosa utilizzando il pesce zebra giovane. Ciò si ottiene caricando prima una soluzione contenente gli albicani vivi in un microago. Nella seconda fase, un volume definito di cellule di lievito viene iniettato nella vescica natatoria di un giovane pesce zebra.

Successivamente, i pesci vengono sottoposti a screening per ottenere un inoculo omogeneo e incubati per il tempo desiderato. Nella fase finale, la microscopia confocale viene utilizzata per seguire l'interazione dinamica del patogeno con il sistema immunitario del pesce zebra. Inoltre, la vescica natatoria può essere microsezionata per ottenere immagini confocali a risoluzione più elevata.

Il metodo che stiamo presentando qui risponde a domande chiave dell'immunologia fungina e della microbiologia, come ad esempio qual è la sequenza precisa di eventi che portano a una risposta immunitaria fallita al patogeno fungino e ai fari del candidale sulle superfici mucose. Prima di iniziare la procedura, scaldare una capsula per iniezione contenente il 2%aros in un'incubatrice a 33 gradi Celsius. Dopo 30 minuti, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per rimuovere 100 millilitri di terreno E tre più PTU da una piastra del quarto giorno, dopo la fecondazione del pesce zebra, facendo attenzione a non aspirare nessuno dei pesci, e aggiungere due millilitri di quattro milligrammi per millilitro.

Trica metano solfonato stock ai media per anestetizzare gli animali. Dopo 15 minuti, utilizzare un microscopio da dissezione per identificare il pesce con la vescica natatoria gonfiata e utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica per trasferire 30 pesci zebra sulla capsula di iniezione preriscaldata. Rimuovere il terreno in eccesso, quindi tenere il piatto ad angolo e utilizzare una lenza da 0,012 pollici di diametro super incollata in un capillare di silicato di boro per creare tre linee di 10 pesci allineati verticalmente ciascuno successivamente a fondo vorticare un tubo di albicans di mare appena preparato a una concentrazione di 1,5 volte 10 al settimo CFU per millilitro.

E poi caricare tre microlitri della soluzione di lievito su un microago tagliato EC. Impostare la durata dell'impulso sull'impostazione appropriata. Quindi ruotare la capsula di iniezione per raggiungere un angolo di 20 gradi tra il microago e la testa del pesce, puntando verso la parte posteriore della vescica natatoria.

Ora spingi il microago nella vescica natatoria, assicurandoti che il foro dell'ago sia nel lume e premi la pozzanghera. Una volta che la verifica di quali pesci sono stati iniettati è relativamente facile, poiché il bolo sposta la bolla d'aria e la parte posteriore della vescica natatoria viene successivamente riempita di terreno, la co-iniezione di rosso fenolo con il bolo può facilitare ulteriormente la visualizzazione di un'iniezione riuscita. Dopo aver iniettato tutti e 30 i pesci, inondare la capsula con il terreno E tre e poi svuotare il pesce nella capsula di recupero.

Trasferire 10 animali in una provetta da centrifuga da 1,7 millilitri contenente un millilitro di terreno E tre e sopprimere il pesce con 200 microlitri di trica. Successivamente, per ogni animale, disporre quattro gocce di grasso sottovuoto in un quadrato, a un centimetro di distanza l'una dall'altra su un micro vetrino, e aggiungere due gocce di grasso appena preparato, a basso fondente al 2% al centro del quadrato. Successivamente, posizionare un pesce su un vetrino separato sotto un microscopio da dissezione e verificare che il cuore dell'animale abbia smesso di battere e rimuovere l'acqua in eccesso.

Ora usa un paio di pinzette sottili per tenere la testa in una posizione fissa e un altro per tirare verso il basso l'intestino anteriore. Prelevare la vescica natatoria dal condotto pneumatico, separandola dal tubo digerente, e posizionarla al centro di uno dei micro vetrini preparati prima che l'agro si solidifichi. Infine, posizionare un vetrino coprinte sul tessuto spingendo delicatamente verso il basso fino a toccare il grasso sottovuoto e l'agarosio e visualizzare la vescica natatoria entro 10 minuti dal prelievo.

Iniettando quattro nanolitri di albicans di mare a 1,5 volte 10 del settimo. Le CFU per millilitro forniscono i dati più coerenti, risultando in un intervallo da 10 a 50 cellule di lievito per pesce. Restringendo l'inoculo a 15-25 cellule di lievito si ottiene un fenotipo e una risposta ancora più stretti.

I neutrofili svolgono un ruolo chiave nella resistenza alla candidosi nei topi e nell'uomo, e l'infezione della vescica natatoria del pesce zebra con albicans vivi porta ad un reclutamento rapido e sostenuto di neutrofili. Ciò non si verifica quando vengono iniettate cellule di lievito che uccidono il calore. I filamenti si sviluppano rapidamente dopo l'iniezione delle cellule di lievito con una crescita filamentosa che continua per le prime 24 ore dopo l'iniezione, dopodiché questo numero inizia a diminuire la capacità di seguire i singoli pesci in modo non invasivo consente questi studi longitudinali ed evidenzia le differenze da individuo a individuo nella progressione della malattia e nelle risposte dell'ospite.

Un protocollo sperimentale che rimane poco pratico nell'imaging murino, le interazioni delle cellule immunitarie o epiteliali con c albicans sono relativamente facili nel modello qui presentato. Tuttavia, la dissezione della vescica natatoria, come appena dimostrato, migliora significativamente la qualità dell'imaging. Ciò è particolarmente utile quando si visualizzano linee di pesci transgenici in cui la fluorescenza è espressa in modo ubiquitario e c'è fluorescenza estranea nel tessuto circostante, come osservato in queste immagini di una vescica natatoria sezionata dalla linea di pesci citrino alfa Catine.

Seguendo questa procedura. Altri metodi, come la tecnologia morph o il trattamento di inibizione chimica, possono essere utilizzati per rispondere a domande come, qual è il ruolo di una particolare cellula immunitaria o della via di segnalazione nella candidosi della mucosa.