Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR

L'obiettivo generale del seguente esperimento è stimare la produzione timica e del midollo osseo quantificando sia i circoli di escissione del recettore delle cellule T che i cerchi di escissione di ricombinazione con eliminazione di REX e K o le correzioni in un singolo saggio. Ciò si ottiene costruendo prima un plasmide a triplo inserto contenente frammenti della sequenza di DNA dei corretti TRX e di un gene di riferimento a singola copia al fine di mantenere un rapporto uno a uno a uno tra i tre bersagli dopo l'amplificazione del DNA. Successivamente, viene costruita una curva standard eseguendo diluizioni seriali del plasmide a triplo inserto, che consente la quantificazione assoluta delle tre sequenze target mediante PCR in tempo reale.

Infine, viene eseguito un test PCR in tempo reale che porta alla quantificazione assoluta di tres e crepe. I risultati riportati mostrano i cambiamenti della produzione di timo e midollo osseo con l'età e il sesso nei bambini e negli adulti sani. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo avuto bisogno di analizzare sia il midollo osseo che la produzione timica nei neonati o nei lattanti, considerando che la quantità di sangue solitamente prelevata è scarsa rispetto agli adulti.

Pertanto, abbiamo deciso di combinare i due metodi di tracciamento e quantificazione corretta in un unico test al fine di ottimizzare la preparazione del campione e i costi dei reagenti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi di immunodeficienze primarie e acquisite, ma il metodo può essere utilizzato anche in tutte le malattie che comportano la perdita di cellule TMB e per studiare la nuova ricostituzione dopo il trapianto di midollo osseo Attraverso questo metodo può fornire informazioni sulla malattia umana. Può anche essere applicato alla ricerca di base, principalmente quella che coinvolge l'omeostasi dei linfociti.

Il vantaggio principale è che impiegando un triplo surplus medio è necessaria una sola polimerizzazione standard, riducendo così la variabilità sperimentale. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà a causa della lunga procedura richiesta per la preparazione del plasmide a triplo inserto o a causa dei problemi relativi alla preparazione della curva standard. Per iniziare, ottenere un campione contenente cellule che hanno un'ottima probabilità di avere TRX e crepe rilevabili mediante PCR, come il sangue periferico di un soggetto giovane e sano raccolto in provette EDTA utilizzando un metodo standard di separazione a gradiente di densità.

Separare le cellule mononucleate del sangue periferico dopo aver estratto il DNA dalle cellule secondo il protocollo di testo, utilizzare primer specifici Fort TRX REX e TCR alfa costante gene per amplificare il segnale Rex, comune Rex segnale congiunto e TCR alfa costante frammenti genici. Inserire il prodotto PCR del giunto segnale Trax nel sito accettore TA del vettore topografico PCR 2.1 e utilizzare il DNA plasmidico per trasformare le cellule blu XL, singolarmente competenti dal punto di vista termico, isolare le colonie bianche resistenti all'ampicillina che hanno perso la complementazione della beta lattasi su un nuovo piatto principale e utilizzare la PCR per identificare le colonie contenenti il frammento di trek. Dopo aver coltivato una delle colonie trek positive e isolato il DNA, utilizzare SP one per digerire il plasmide e il prodotto amplificato del gene costante TCR alfa e legare il frammento genico costante TCR alfa nel plasmide.

Ripetere la trasformazione, la selezione e l'espansione della colonia e l'isolamento del DNA per inserire il frammento corretto, utilizzare i tre posteriori anziché SP uno per digerire il plasmide e il frammento PCR corretto e ripetere il processo per legare e isolare il DNA. Una volta verificate le sequenze dei tre inserti, espandere la colonia e purificare il DNA plasmidico mediante preparazione MIDI secondo il protocollo di testo per preparare una curva standard. Dopo aver calcolato la massa e la concentrazione del plasmide come mostrato qui, scongelare un'aliquota del plasmide e mostrarne una per linearizzare due microgrammi con l'aliquota linearizzata del DNA.

Usa la formula C uno V uno è uguale a C due V due. Per calcolare il volume di diluizione necessario per preparare il primo punto di curva standard della serie, come mostrato qui, preparare una serie da una a 10 diluizioni per ottenere i restanti punti di curva standard. Conservare la diluizione del plasmide a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius fino all'uso Per preparare i campioni per la PCR in tempo reale, predisporre una piastra PCR che includa almeno due repliche per ogni campione da analizzare nel modo seguente con due provette separate, una per Rex e crepe e un'altra per TCR alfa costante.

Preparare le miscele master per il numero totale di pozzetti necessari. Aggiungere 20 microlitri ai pozzetti della piastra. Successivamente, aggiungi cinque microlitri di DNA genomico estratto da cellule mononucleate del sangue periferico o P BMC.

Aggiungere cinque microlitri d'acqua ai pozzetti di controllo senza modello prima di utilizzare una copertura adesiva ottica per sigillare la piastra di reazione. Quindi scongelare la diluizione della curva standard del DNA plasmidico e preparare la diluizione più alta. Scopri solo i pozzetti situati tra le file da A a H e le colonne da uno a quattro.

E dopo un breve vortice, aggiungere cinque microlitri di ciascun punto di diluizione al punto designato. Assicurarsi che non ci siano bolle sul fondo dei pozzetti e che i reagenti si siano depositati sul fondo. Utilizzare un sistema PCR in tempo reale per eseguire il test con il seguente protocollo.

50 gradi Celsius per due minuti e riscaldamento iniziale a 95 gradi Celsius per 10 minuti, seguiti da 45 cicli di denaturazione a 95 gradi Celsius per 15 secondi. E una sonda di innesco combinata e inginocchiamento e allungamento a 60 gradi Celsius per un minuto. Per analizzare i dati PCR in tempo reale, aprire il file dei risultati salvato nel software e fare clic sulla scheda dei risultati nella parte superiore della finestra.

Fare clic sul menu di analisi e selezionare le impostazioni di analisi. Lascia che il software determini automaticamente la soglia selezionando tutti i rivelatori e il CT automatico per il ciclo di soglia. Lascia che il software imposti la linea di base automatica per l'eliminazione dello sfondo per impostazione predefinita.

Fare clic sulla scheda denominata grafico di amplificazione e, nella parte più a destra della finestra, selezionare uno dei tre rivelatori nel menu a discesa corrispondente. Appena sotto seleziona CT manuale per impostare manualmente una soglia nella parte inferiore della finestra, selezionare i pozzetti corrispondenti ai punti di diluizione della curva standard del rivelatore scelto per mostrare i grafici di amplificazione facendo clic e trascinando il mouse sulle celle corrispondenti della tabella. Per regolare manualmente la soglia, trascinare la linea di soglia rossa verso l'alto e verso il basso, quindi fare clic su Analizza per rianalizzare i risultati.

Per verificare in che modo l'impostazione della soglia influisce sui risultati, selezionare la scheda del rapporto e visualizzare la TC risultante dei rispettivi punti di diluizione della curva standard. Quando si sposta la soglia per ottenere un posizionamento ottimale nella scheda del grafico di amplificazione, verificare che la soglia si trovi in una regione di amplificazione esponenziale sufficientemente al di sopra del rumore di fondo, ma al di sotto della fase di plateau. Se il grafico di amplificazione non viene visualizzato in scala logaritmica, fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico per richiamare le impostazioni del grafico e impostare l'impostazione Y ais post esecuzione come log.

Impostate la soglia a metà della parte lineare del grafico e osservate le curve di amplificazione approssimativamente parallele tra loro. Fare clic sulla scheda del rapporto per visualizzare i risultati della CT. Assicurarsi che il posizionamento della soglia produca risultati che massimizzino la precisione delle due repliche di ciascuna curva standard.

Punti di diluizione. Verificare che la soglia sia posizionata nel punto che meglio riflette gli ordini di grandezza estremi dei punti di diluizione della curva standard nella scheda del report. Trascinare nuovamente il mouse nella tabella nella parte inferiore della finestra per selezionare le celle corrispondenti ai pozzetti della curva standard Per tutti i rivelatori, verificare che la CT risultante dei tre bersagli sia molto simile agli stessi punti di diluizione.

Ad esempio, la differenza, non più di 0,5 CT, regolare nuovamente le soglie, se necessario, e ricontrollare nella scheda del rapporto nella parte inferiore della finestra. Selezionare i pozzetti NTC e verificare che non sia presente alcuna amplificazione nei pozzetti NTC, il che corrisponde a una TC di indeterminata. Selezionare la scheda della curva standard e, a destra della finestra del grafico, selezionare i rilevatori dal menu a discesa e verificare se la pendenza della curva standard riportata varia tra 3,55 e 3,32 negativo, che corrisponde a efficienze PCR dal 91 al 100%Assicurarsi che il coefficiente di determinazione o R al quadrato sia superiore a 0,998 controllando il suo valore appena sotto la pendenza e l'intercettazione.

Fare clic sulla scheda del rapporto e nelle celle corrispondenti della tabella sotto il grafico, verificare che la TC del controllo positivo sia coerente con i risultati dei test precedenti sullo stesso controllo positivo noto. Fare clic sul menu File, salvare, quindi esportare in un file CSV per esportare le quantità di tutti i pozzetti in un file di testo contenente valori separati da virgole. Infine, importa il file CSV in un software per fogli di calcolo e calcola il numero di tracce o corregge per 10 ai sei PBM impostando la seguente formula in modo appropriato.

Il test descritto in questo video è stato eseguito su un campione rappresentativo di 87 controlli sani, 42 bambini di età compresa tra zero e 17 anni e 45 adulti, tra 24 e 60 anni. Come mostrato qui, il numero di escursioni è diminuito bruscamente con l'età a causa dell'involuzione timica da zero a tre o quattro anni negli adulti.

Il numero di trek dipende anche dal sesso perché diminuisce più rapidamente negli uomini che nelle donne, il che può influire sulla capacità di impostare intervalli di riferimento appropriati. Questi grafici mostrano che il numero di crepe, tuttavia, diminuiva con l'età in modo simile al modello osservato con i T TREX solo nei bambini. Mentre negli adulti, la produzione di midollo osseo è abbastanza stabile per tutta la vita e non dipende dal sesso.

La preparazione del plasmide triplo in inserto richiede circa due o tre settimane, ma successivamente le assegnazioni di plasmidi conservate dureranno tre anni. La parte rimanente della tecnica può essere eseguita in sole quattro o cinque ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante eseguire tutte le manipolazioni relative ai plasmidi in un'area dedicata per evitare la contaminazione incrociata del DNA.

È inoltre essenziale verificare la stabilità del tubo standard quando si analizzano i risultati dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha fornito ai ricercatori nel campo dell'immunologia clinica o dell'ematologia, uno strumento migliorato per l'identificazione delle deficienze immunitarie primarie per monitorare l'esito della ricostituzione immunitaria, dopo il trapianto di midollo osseo, o semplicemente per studiare l'omeostasi dei linfociti. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere il triplo nel plasmide, preparare la curva standard, eseguire l'esperimento di PCR in tempo reale ed eseguire i calcoli necessari per ottenere una quantificazione assoluta riproducibile di trax e crepe.