Name: Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: Scopri come quantificare simultaneamente TREC e KREC mediante PCR in tempo reale per valutare la produzione timica e midollare. Questo metodo ottimizza l'analisi immunologica con campioni di sangue ridotti.

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Gli autori non hanno riconoscimenti.

<ol><li>Douek, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+thymic+function+with+age+and+during+the+treatment+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection.</a> Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).</li>
<li>Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+history+of+B+lymphocytes+reveals+homeostatic+proliferation+and+extensive+antigen-induced+B+cell+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion.</a> J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).</li>
<li>Fronkova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+reconstitution+after+allogeneic+SCT+impairs+minimal+residual+disease+monitoring+in+children+with+ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL.</a> Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+recent+thymic+T-cell+and+bone+marrow+B-cell+emigrants+in+patients+with+primary+immunodeficiency+undergone+to+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation.</a> Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+and+bone+marrow+output+in+patients+with+common+variable+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency.</a> J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+effects+of+interferon-%CE%B2+on+new+B+and+T+cell+release+from+production+sites+in+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis.</a> J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).</li>
<li>Zanotti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+accumulation+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+in+natalizumab-treated+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients.</a> Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).</li>
<li>Sottini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+T-+and+B-cell+defects+in+one+progressive+multifocal+leukoencephalopathy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient.</a> PLoS One. 7, e34493(2012).</li>
<li>Quiros-Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+combined+antiretroviral+therapy+on+B-+and+T-cell+release+from+production+sites+in+long-term+treated+HIV-1%2B+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients.</a> J. Transl. Med. 10, 94(2012).</li>
<li>Mensen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+TREC+and+KREC+quantification+for+the+monitoring+of+early+T-+and+B-cell+neogenesis+in+adult+patients+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> J. Transl. Med. 11, 188(2013).</li>
<li>Serana, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+different+extent+of+B+and+T+cell+immune+reconstitution+after+hematopoietic+stem+cell+transplantation+and+enzyme+replacement+therapies+in+SCID+patients+with+adenosine+deaminase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency.</a> J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).</li>
<li>Borte, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+screening+for+severe+primary+immunodeficiency+diseases+using+high-throughput+triplex+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR.</a> Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).</li>
<li>Baker, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementing+routine+testing+for+severe+combined+immunodeficiency+within+Wisconsin%27s+newborn+screening+program%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Health+Rep%22%5BJournal%5D)">Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin's newborn screening program.</a> Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).</li>
<li>Lorenzi, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+thymic+function+directly+from+peripheral+blood%3A+a+validated+modification+to+an+established+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method.</a> J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).</li>
<li>De Boer, R. J., Perelson, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+T+lymphocyte+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying T lymphocyte turnover.</a> J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La quantificazione TREC e KREC può essere considerata una buona stima della produzione recente di timo e midollo osseo, a condizione che vengano prese in considerazione alcune avvertenze. Anche se un metodo di quantificazione assoluta che impiega una curva standard richiede più reagenti e più spazio sulla piastra di reazione della PCR in tempo reale, garantisce risultati quantitativi estremamente accurati perché le quantità di campione sconosciute vengono interpolate da curve standard costruite su quantità note di materi...

Cerchi escissione recettore T-cellulare (TREC) e cerchi ricombinazione di escissione-K (eliminazione KRECs) sono piccoli elementi di DNA della circolare che vengono asportate in una proporzione di T e cellule B, rispettivamente, durante un processo di ricombinazione DNA genomico, portando alla formazione di un repertorio altamente diversificato di T e dei recettori delle cellule B. Essi non hanno alcuna funzione, ma perché sono stabili e non possono essere replicate, vengono diluiti dopo ogni divisione cellulare, persistendo quindi solo in una delle due cellule figlie. Pertanto, i livelli nel sangue periferico può essere assunta come una stima della produzione del midollo osseo e timo. Mentre il test TREC è stato ampiamente utilizzato nel corso degli ultimi 15 anni per valutare l&#39;entità della produzione del timo, 1 il test KREC, che è stato sviluppato inizialmente per misurare la proliferazione delle cellule B e il suo contributo alla omeostasi delle cellule B in salute e malattia, 2 è stato solo di recente proposto come marker di osso mfreccia in uscita. 3,4 Qui, descriviamo il metodo che abbiamo sviluppato per la quantificazione simultanea di entrambi TREC e KRECs. 4 Con questo metodo combinato, la variabilità associata quantificazione DNA da PCR in tempo reale è eliminata mediante l&#39;uso di una curva standard unico ottenuta diluendo un plasmide triplo inserto contenente frammenti di TREC, KRECs e T-costante di cella recettore alfa (TCRAC) gene in un rapporto 1: 1: 1. Questo permette una valutazione più accurata del numero di copie TREC e KREC. Inoltre, la quantificazione simultanea dei due bersagli nella stessa reazione permette la riduzione dei costi dei reagenti. La proposta di test TREC / KREC può essere utile per misurare il grado di T e cellule B neo-produzione in bambini o adulti con grave immunodeficienza combinata (SCID), 4 immunodeficienza variabile comune, 5 malattie autoimmuni, 6-8 e l&#39;infezione da HIV . 9 Inoltre, può essere utilizzato permonitorare il recupero immunitario dopo il trapianto di cellule staminali emopoietiche, 10 enzimatica sostitutiva, 11 e antivirale 9 o immunomodulanti terapie. 6-8, infine, perché i pazienti SCID sono rilevati sulla base del test TREC nonostante i difetti genetici sottostanti, e agammaglobulinemia pazienti possono essere identificati usando KREC quantificazione , il dosaggio TREC / KREC può essere utilizzato anche per rilevare immunodeficienze in programmi di screening neonatale. 12 In questo caso, la prova deve essere eseguita su DNA estratto da piccole macchie di sangue cancellato ed essiccato su carta da filtro, deve essere altamente sensibile e specifico per le malattie in questione, così come altamente riproducibile e conveniente. L&#39;introduzione di KREC quantificazione nel test dovrebbe migliorare le prestazioni di screening neonatale per la immunodeficienze, che è stato regolarmente effettuato nel alcune parti degli Stati Uniti (WI, MA, CA) dal 2008, quando Wisconsin è diventato il primo e introduzionee l&#39;analisi del TREC nel suo programma di screening postnatale. 13

<table><tbody><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>10771-500 ML</td><td>metodo di separazione in gradiente di densità</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)</td><td>QIAGEN</td><td>51106</td><td>Estrazione del DNA</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi DNA non modificati HPSF 0,01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Risospendere il prodotto liofilizzato a 100 pmol/&micro; l</td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA polimerasi: incluso 10x Buffer II e 25 mM MgCl2</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080156</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp dNTP Blend (100 mM)</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>N8080261</td><td></td></tr><tr><td>Kit di clonazione TOPO TA per il subclonaggio</td><td>Invitrogen/Life-Technologies</td><td>K4500-01</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells</td><td>Stratagene</td><td>200130</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmide Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>SpeI 500U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF 10.000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104S</td><td></td></tr><tr><td>PureYield Plasmide Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2492</td><td></td></tr><tr><td>XhoI 5.000 U</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Utrapure</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich SRL</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>tampone TE (1 mM TRIS e 0,1 mM EDTA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems/Life-Technologies</td><td>4364338</td><td></td></tr><tr><td>Sonde a doppia marcatura HPLC 0,01 mmol</td><td>Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l&nbsp;</td><td></td><td>Risospendere il prodotto liofilizzato a 100 pmol/&micro; l</td></tr><tr><td>Spettrofotometro NanoDrop 2000c</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 2720 Termociclatore</td><td>Biosistemi applicati/Tecnologie per la vita</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Sistema PCR in tempo reale Fast 7500</td><td>Biosistemi applicati/Tecnologie</td><td></td><td></td></tr> per <tr><td>la vita Software di rilevamento della sequenza SDS 1.4</td><td>Biosistemi applicati/Tecnologie</td><td></td><td></td> per la vita</tr></tbody></table>

quantificazione simultanea di t-cell receptor excision circles (trec) e circles k-eliminazione ricombinazione excision (krecs) per real-time pcr

Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR

'I cerchi di escissione del recettore delle cellule T (TREC) e i cerchi di escissione di ricombinazione con eliminazione K (KREC) sono elementi di DNA circolarizzati formati durante il processo di ricombinazione che crea recettori per le cellule T e B. Poiché i TREC e i KREC non sono in grado di replicarsi, vengono diluiti dopo ogni divisione cellulare e quindi persistono nella cellula. La loro quantità nel sangue periferico può essere considerata come una stima della produzione di timo e midollo osseo. Combinando il test TREC ben consolidato e comunemente utilizzato con una versione modificata del test KREC, abbiamo sviluppato una PCR quantitativa duplex in tempo reale che consente la quantificazione dei linfociti T e B di nuova produzione in un singolo test. Il numero di TREC e KREC è ottenuto utilizzando una curva standard preparata diluendo in serie i giunti segnale TREC e KREC clonati in un plasmide batterico, insieme a un frammento del gene costante alfa del recettore delle cellule T che funge da gene di riferimento. I risultati sono riportati come numero di TREC e KREC/106 cellule o per ml di sangue. La quantificazione di questi frammenti di DNA si è dimostrata utile per monitorare la ricostituzione immunitaria dopo trapianto di midollo osseo sia nei bambini che negli adulti, per una migliore caratterizzazione delle deficienze immunitarie o per una migliore comprensione di alcune attività immunomodulanti dei farmaci.

Il dosaggio è stato effettuato in un campione rappresentativo di 87 controlli sani: 42 bambini di età compresa tra 0-17 (maschi / femmine: 25/17) e 45 adulti di età compresa tra 24-60 (maschi / femmine: 29/16). I risultati sono stati ottenuti come TREC e KRECs per 10 6 PBMC, e poi le TREC e KRECs per ml di sangue sono stati calcolati. Il numero di TREC diminuisce con l'età a causa involuzione timica, 4 in particolare in un modo molto acuto da 0 a 3 - 4 anni. Negli adult...

Qui, descriviamo un metodo per la quantificazione simultanea dei circoli di escissione del recettore delle cellule T (TREC) e dei circoli di escissione di ricombinazione con eliminazione K (KREC). Il test TREC/KREC può essere utilizzato come marcatore della produzione di timo e midollo osseo.

Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è stimare la produzione timica e del midollo osseo quantificando sia i circoli di escissione del recettore delle cellule T che i cerchi di escissione di ricombinazione con eliminazione di REX e K o le correzioni in un singolo saggio. Ciò si ottiene costruendo prima un plasmide a triplo inserto contenente frammenti della sequenza di DNA dei corretti TRX e di un gene di riferimento a singola copia al fine di mantenere un rapporto uno a uno a uno tra i tre bersagli dopo l'amplificazione del DNA. Successivamente, viene costruita una curva standard eseguendo diluizioni seriali del plasmide a triplo inserto, che consente la quantificazione assoluta delle tre sequenze target mediante PCR in tempo reale.Infine, viene eseguito un test PCR in tempo reale che porta alla quantificazione assoluta di tres e crepe. I risultati riportati mostrano i cambiamenti della produzione di timo e midollo osseo con l'età e il sesso nei bambini e negli adulti sani. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo avuto bisogno di analizzare sia il midollo osseo che la produzione timica nei neonati o nei lattanti, considerando che la quantità di sangue solitame

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Immunologia e Infezioni

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Scopri come quantificare simultaneamente TREC e KREC mediante PCR in tempo reale per valutare la produzione timica e midollare. Questo metodo ottimizza l'analisi immunologica con campioni di sangue ridotti.

Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR (Video) | JoVE Journal

Quantificazione simultanea di T-Cell Receptor Excision Circles (TREC) e Circles K-Eliminazione ricombinazione Excision (KRECs) per Real-time PCR

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