Name: Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna allorecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Impara un approccio chirurgico post-auricolare per la consegna virale diretta nella coclea del topo attraverso la membrana della finestra rotonda. Questa tecnica minimizza la perdita di sangue e la mortalità, facilitando la terapia genica per la ricerca sull'udito.

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Questo lavoro è supportato da una sovvenzione R21 del National Institutes of Health e da una sovvenzione di Hearing Research, Incorporated.

NOTA: tutte le procedure e la gestione degli animali rispettate le linee guida etiche NIH e requisiti del protocollo approvati Care and Use Committee della University of California Animal Istituzionale, San Francisco. 1. Preparare la Animal di Chirurgia <ol><li> Eseguire interventi chirurgici in un ambiente pulito, spazio dedicato. Autoclave tutti gli strumenti chirurgici, sterilizzare con una sterilizzatrice vetro tallone prima dell&#39;intervento. NOTA: In questo protocollo, utilizzare giorno postnatale 10-12 (P10-12) topi FVB. Età diverse e ceppi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di uno specifico progetto. I topi di età superiore a P40 può essere impegnativo, perché l&#39;osso bulla diventa più difficile. </li><li> Anestetizzare topi con iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato (100 mg / kg), xilazina cloridrato (10 mg / kg), e acepromazina (2 mg / kg). Inizia la preparazione chirurgica solo dopo che l&#39;animale non risponde più agli stimoli dolorosi, come pinch punta. Se necessary, somministrare una dose di richiamo (un quinto della dose originale) del cocktail anestetico per ripristinare il piano anestetico originale. NOTA: Fare attenzione a questo passaggio perché la maggior parte della mortalità osservata a questa età è causata da overdose di anestetico. </li><li> Coprire gli occhi dell&#39;animale con una pomata oftalmica protettiva per mantenere gli occhi umidi durante l&#39;anestesia, sopprimendo riflesso corneale dell&#39;animale. </li><li> Posizionare il mouse con il collo esteso su una piastra elettrica per tutta la procedura fino a quando il mouse è completamente sveglio, per evitare post-anestesia ipotermia. </li><li> Radere la regione post-auricolare sinistro con un clipper e disinfettare con il 70% di etanolo e iodopovidone prima manipolazione chirurgica. </li></ol> 2. La procedura chirurgica e Vector Injection <ol><li> Utilizzare un approccio post-auricolare per esporre la bolla timpanica. Incidere il tessuto sottocutaneo con piccole forbici per esporre il muscolo post-auricolare. Dopo ritrarre il tessuto adiposo in Oce lato posteriore dell&#39;incisione, separare i muscoli a destra ea sinistra perpendicolare alla incisione per esporre l&#39;osso temporale. Assicurarsi che questa incisione è abbastanza a lungo per lavorare comodamente con visualizzazione adeguata. </li><li> Perforare bolla timpanica con un ago 25 G ed espandere il foro come necessario con pinze staccando la spina dorsale per consentire l&#39;accesso al giro basale della coclea, e quindi allargare sufficientemente visualizzare l&#39;arteria stapediale e la membrana della finestra rotonda (RWM) . </li><li> Forare la RWM delicatamente al centro con una pipetta borosilicato capillare. Osservare efflusso fluido attraverso il RWM a questo punto; questo è normale. Attendere che l&#39;efflusso è stabilizzata (il fluido effluxed dalla coclea viene asciugata con carta da filtro sterile). NOTA: Fare attenzione quando si tiene e avanza l&#39;ago di vetro in modo che la perforazione RWM è il più piccolo possibile. A seconda del microscopio utilizzato, detengono le pipette con un micromanipolatore oa mano con una pipettatitolare. </li><li> Preparare le pipette per l&#39;iniezione con una pipetta estrattore lo stesso senso pipette patch clamp sono preparati. Assicurarsi che il diametro della punta è di grandi dimensioni (circa 15 micron di diametro) in modo che il virus pipettando dentro e fuori è fatto facilmente. </li><li> Elaborare 1 a 2 ml di AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP o AAV2-GFP in una pipetta di iniezione. Dopo l&#39;efflusso è stabilizzato (da 5 a 10 min), microinject questo volume fisso nella scala timpanica attraverso lo stesso foro precedentemente realizzato in RWM. </li><li> Sigillare la nicchia RW subito dopo aver estratto la pipetta con un piccolo tampone di muscoli e fissarlo con una piccola goccia di tessuto adesivo posto sul muscolo per evitare perdite dalla finestra rotonda. NOTA: Seal questo buco molto bene dopo l&#39;ago viene rimosso con un piccolo tappo di muscoli per evitare qualsiasi perdita perilymph dalla coclea-questo passaggio è fondamentale per preservare l&#39;udito. La mancata sigillare completamente il RWM comporterà la perdita dell&#39;udito nel corso del tempo. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, coprire ilbuco nella bolla uditiva con tessuto adiposo, restituire i muscoli post-auricolari e tessuto adiposo alla loro posizione normale e suturare la ferita a strati con un assorbibile sutura cromico 6-0 o più piccolo. </li><li> Disinfettare la ferita con povidone-iodio. </li></ol> 3. postoperatoria Cura <ol><li> Mettere i topi in una gabbia calda e non lasciarli incustoditi fino a quando non sono completamente recuperati poi spostarli nuovamente con la madre. Si consiglia di rimuovere il maschio dalla gabbia prima di mettere i cuccioli di nuovo con la madre. </li><li> Somministrare per via sottocutanea Carprofen (2 mg / kg) per l&#39;analgesia dopo l&#39;intervento e ogni 24 ore in seguito per 3 giorni, per gestire l&#39;infiammazione e il dolore. Monitorare gli animali ogni giorno per i segni di disagio, perdita di peso anormale, dolore, o infezione. Generalmente dal 3 ° giorno dopo l&#39;intervento chirurgico tutti i topi vanno agiscono normalmente. Se i sintomi di disagio o di malattia appaiono in un mouse dopo il 3 ° giorno, in considerazione eutanasia tegli mouse come da linee guida istituzionali. </li></ol> 4. Valutazione della funzione cocleare dopo la consegna Viral Utilizzando uditiva del tronco encefalico (ABR) Risposta Recordings NOTA: La risposta del tronco encefalico uditivo (ABR) è un Potenziali evocati uditivi estratto da attività elettrica in corso nel cervello e registrato attraverso elettrodi posti sotto il cuoio capelluto. L&#39;animale viene stimolato con il suono. La registrazione risultante consiste di cinque onde che riflettono l&#39;attività elettrica dei punti successivi nel percorso uditivo nei primi 10 msec dopo l&#39;insorgenza di uno stimolo uditivo. <ol><li> Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina cloridrato e xilazina cloridrato come descritto nella sezione 1.2 del presente protocollo, salvo non acepromazina. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra elettrica per tutto il test dell&#39;udito fino a quando il mouse è completamente sveglio, per evitare post-anestesia ipotermia. NOTA: Usai seguenti stimoli sonori in questo esperimento: clicca (5 msec durata; 31 Hz tasso presentazione). </li><li> Inserire elettrodi sottocutanei aghi al vertice, sotto la pinna dell&#39;orecchio sinistro (riferimento), e sotto l&#39;orecchio controlaterale (massa) e iniziare ABRs registrazione come precedentemente descritto in una camera insonorizzata 27,28. Record ABR forme d&#39;onda a intervalli di 5 dB del livello di pressione sonora giù dal massimo di ampiezza. </li><li> Determinare le soglie ABR dopo l&#39;intervento già a quattro giorni dopo la consegna virale NOTA: soglia è definita come il livello di stimolo minimo al quale risposta picchi di onde I-V erano chiaramente e ripetutamente presente un controllo visivo. </li><li> Misura onda Io per analizzare l&#39;attività del nervo cocleare. Il livello di stimolo più basso che produce una forma d&#39;onda rilevabile ABR è definito come soglia. </li></ol> 5. Cochlear Transgene Protein Expression Usando immunofluorescenza <ol><li> Anestetizzare topi da un overdose di intrapiniezione eritoneal di una miscela di ketamina cloridrato e xilazina cloridrato come descritto nella sezione 1.2 del presente protocollo, salvo non acepromazina. </li><li> Decapitare il capo solo dopo che l&#39;animale non risponde più agli stimoli dolorosi, come il pinch punta. </li><li> Sezionare il coclee fuori e di processo per tutto il montaggio immunofluorescenza come descritto 26. Un protocollo dettagliato di cocleare tutto-mount immunofluorescenza utilizzando anti-VGLUT3 e anticorpi anti-miosina 7a è descritto in Akil et al., 2013 29. </li><li> Per l&#39;etichettatura GFP, incubare le cocleari tutto-monti notte a 4 ° C con un coniglio anti-GFP anticorpi a 1: 250 di diluizione. </li><li> Risciacquare la coclee due volte per 10 min con PBS e poi incubare per 2 ore a IgG anti-coniglio di capra coniugata Cy2 diluito 1: 4000 in PBS. </li><li> Sciacquare la coclee con PBS due volte per 10 minuti e incubare con DAPI per 15 min. </li><li> Montare la coclee su vetrini e osservare under un microscopio con immunofluorescenza confocale. </li></ol>

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<li>Lalwani, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+cochlear+transgene+expression+mediated+by+recombinant+adeno-associated+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus.</a> Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).</li>
<li>Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenoviral-mediated+gene+transfer+into+guinea+pig+cochlear+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo.</a> Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).</li>
<li>Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+mediated+gene+transfer+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Viral mediated gene transfer in the cochlea.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).</li>
<li>Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracochlear+infusion+of+recombinant+adeno+associated+virus%3A+Analysis+of+its+dissemination+to+near+and+distant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Assoc.+Res.+Otolaryngol.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues.</a> Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673(1998).</li>
<li>Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+guinea+pig+cochlea+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors.</a> J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).</li>
<li>Kaplitt, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+gene+expression+and+phenotypic+correction+using+adeno-associated+virus+vectors+in+the+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain.</a> Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

In questo lavoro, si descrive in dettaglio una tecnica che può essere utilizzato per la terapia genica cocleare, con l&#39;obiettivo di ripristino o salvataggio normale funzione uditiva che viene compromessa da un difetto genetico. Come è tipicamente atraumatica, questo approccio è sicuro per il trasferimento di geni cocleare o altri potenziali terapie molecolari 30. Altri approcci per la terapia cocleare sono stati descritti, tra cui un approccio ventrale 24, cocleostomia 31,32 e sacco ...

La terapia genica è stato a lungo suggerito come un potenziale trattamento per la perdita dell&#39;udito genetica, ma il successo in questo settore è rimasta inafferrabile 1. Ad oggi, le metodologie viralmente mediati hanno prevalso grazie alla capacità teorica di indirizzare specifici tipi cellulari all&#39;interno della coclea relativamente inaccessibile. Entrambi adenovirus (AV) e il virus adeno-associato (AAV) sono stati utilizzati per la consegna del gene cocleare. AAV sono vantaggiosi nella coclea per una serie di motivi. Sono virus replica-carenti e possono efficacemente trasferire molecole transgenici a diversi tipi di cellule, tra cui i neuroni, un obiettivo importante per una serie di cause di perdita dell&#39;udito. AAV ingresso nella cellula è mediata da recettori specifici 2; pertanto, la scelta di un particolare sierotipo deve essere compatibile con i tipi cellulari da trasdotte. AAV può efficacemente trasfettare cellule ciliate 3 e incorporare nel genoma dell&#39;ospite, conseguente, espressione stabile a lungo termine del TRAproteine ​​nsgenic e il cambiamento fenotipico nella cella 4. Anche se non necessariamente vantaggioso per applicazioni a breve termine, come la rigenerazione delle cellule ciliate, espressione a lungo termine è molto importante per il salvataggio stabile di difetti genetici. Perché AAV non sono associati a qualsiasi malattia umana o infezione e non mostrano ototossicità 5,6,7, sono un candidato ideale per l&#39;uso in terapia genica per forme ereditarie di perdita dell&#39;udito 8. Trasferimento di materiale genetico esogeno nell&#39;orecchio interno dei mammiferi utilizzando vettori virali è stata studiata negli ultimi dieci anni e sta emergendo come una tecnica promettente per il trattamento di forme sia genetiche e acquisite di perdita dell&#39;udito 9. La coclea è potenzialmente un bersaglio ideale per la terapia genica per diverse ragioni: 1) la sua piccolo volume richiede una quantità limitata del virus necessaria; 2) il suo relativo isolamento da altri effetti limiti organi laterali; e 3) le sue camere piene di liquido facilitano viraleconsegna in tutto il labirinto 10, 11,12,13,14, 15. I modelli murini di sordità congenita consentono uso di molti metodi di studio per monitorare lo sviluppo dell&#39;orecchio interno in un modo replicabile sistematica. Mentre le dimensioni ridotte del topo coclee non presenta difficoltà chirurgica, il mouse serve come modello estremamente importante nello studio della sordità genetica, con diversi vantaggi sperimentali su altre specie 16. Modelli murini consentono la valutazione di una serie di caratteristiche, attraverso analisi di linkage genetico, raccolta di osservazioni dettagliate morfologiche, e la simulazione di scenari patogeni; come tali, sono buoni candidati per la terapia genica mediata viralmente. Ampi studi genetici nei topi combinate con i progressi tecnologici hanno permesso di generare topi geneticamente modificati in modo riproducibile attraverso laboratori 17,18, 19, 20,21. Furthermore, esistono numerosi modelli sia per acquisite ed ereditarie udito fenotipi di perdita nei topi, consentendo test rigorosi in questo modello animale 22, 23,24. Così, correggendo l&#39;udito con la terapia genica virale mediato in un modello di topo è un primo passo opportuno nella ricerca di una cura per le malattie umane. Abbiamo precedentemente dimostrato che i topi transgenici privi di glutammato vescicolare Transporter 3 (VGLUT3) nascono sordi a causa della mancanza di rilascio di glutammato a nastro sinapsi IHC 25. Poiché questa mutazione non porta ad una degenerazione primaria delle cellule ciliate sensorie, questi topi mutanti sono potenzialmente un ottimo modello in cui sperimentare la terapia genica per cocleare sordità congenita. Fino ad oggi, una serie di tecniche di consegna virali per la terapia genica cocleare sono stati descritti, tra andata diffusione membrana finestra, rotondo iniezione membrana finestra e distribuirla su cocleostomia. Ci sono potentivantaggi ial e svantaggi di ciascuno di questi approcci 9. Qui riportiamo un metodo chirurgico per la consegna del gene virale mediata all&#39;orecchio interno VGLUT3 KO mouse attraverso la membrana della finestra rotonda (RWM). Il metodo di iniezione RWM post-auricolare è minimamente invasiva con ottima conservazione dell&#39;udito, ed è relativamente veloce. Come precedentemente pubblicato, nel tentativo di ripristinare dell&#39;udito in questo modello di topo, un vettore che porta il gene AAV1 VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) è stato introdotto nella coclea di questi topi sordi al giorno postnatale 12 (P! @), Con conseguente il restauro di sentire 26. Audizione in topi VGLUT3 KO è stato verificato dai uditivo risposta tronco encefalico (ABR), mentre l&#39;espressione della proteina transgene è stata verificata mediante immunofluorescenza (IF). Questa metodologia dimostra quindi che la terapia genica mediata viralmente può correggere un difetto genetico che altrimenti provoca sordità.

<table><tbody><tr><td>Ketamina</td><td>Butler Schein</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>AnaSed</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromazina</td><td>Fornito da UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analgesia del carprofene</td><td>Fornito da UCSF LARC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine Betadine</td><td>Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>desametasone unguento oftalmico (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Braintree scientific, inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago 25G</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>pipetta capillare in borosilicato</td><td>World precision instruments, inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sutura PDS*plus Antibatterico</td><td>Ethicon</td><td>PDP149</td><td></td></tr><tr><td>Colla tissutale (Vetcode)</td><td>Butler Schein</td><td>31477</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio Anticorpo anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A11122</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>MZ95</td></tr><tr><td>Micropipetta fiammata/marrone&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Estrattore Sutter Instrument Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Modello P-97&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema TDT BioSig III&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; Tecnologie</td><td></td><td></td> Tucker-Davis</tr></tbody></table>

metodo chirurgico per virally mediated gene consegna all&#39;orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana

Surgical Method for Virally Mediated Gene Delivery to the Mouse Inner Ear through the Round Window Membrane

La terapia genica, utilizzato per realizzare il recupero funzionale di sordità neurosensoriale, promette di concedere una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e genetici alla base che contribuiscono alla perdita dell&#39;udito. Introduzione di vettori nell&#39;orecchio interno deve essere fatto in modo che l&#39;agente ampiamente distribuisce tutta la coclea minimizzando lesioni alle strutture esistenti. Questo manoscritto descrive un approccio chirurgico post-auricolare che può essere utilizzato per il mouse terapia cocleare usando molecolari, farmacologico, e consegna virale per topi giorno postnatale 10 e anziani attraverso la membrana finestra rotonda (RWM). Questo approccio chirurgico consente la consegna rapida e diretta nella scala timpanica, riducendo al minimo la perdita di sangue ed evitare la mortalità degli animali. Questa tecnica comporta trascurabile o nessun danno alle strutture essenziali dell&#39;orecchio interno e medio nonché muscoli del collo mentre tutto conservando udito. Per dimostrare l&#39;efficacia di questa tecnica chirurgica, la glutam vescicolaremangiato transporter 3 knockout (VGLUT3 KO) topi verrà utilizzato come esempio di un modello murino di sordità congenita che recupera l&#39;udito dopo la consegna del VGLUT3 all&#39;orecchio interno tramite un virus adeno-associato (AAV-1).

Per verificare le caratteristiche tecniche e l'utilità di un approccio post-auricolare per la terapia molecolare cocleare, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP e AAV2-GFP sono state consegnate in topi P10-12 all'orecchio interno tramite l'RWM. Questo approccio dimostra espressione del transgene successo all'interno delle cellule ciliate interne (IHC) (VGLUT3 Figura 1 e Figura 2 e GFP GFP figura 3A), le cellule ciliate esterne (OHC) (GFP Figura 2) e cellule di supporto...

L'approccio chirurgico post-auricolare descritto consente una somministrazione rapida e diretta nel timpano della scala cocleare del topo, riducendo al minimo la perdita di sangue e la mortalità animale. Questo metodo può essere utilizzato per la terapia cocleare utilizzando la somministrazione molecolare, farmacologica e virale a topi postnatali attraverso la membrana rotonda della finestra.

Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all&#39;orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana

Gene therapy, used to achieve functional recovery from sensorineural deafness, promises to grant better understanding of the underlying molecular and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di descrivere un approccio chirurgico postauricolare che consenta la somministrazione rapida e diretta del virus nel topo Cochlear S squame timi attraverso la membrana rotonda della finestra. Ciò si ottiene esponendo prima la bolla timpanica. Nella seconda fase, il tessuto viene perforato e vengono visualizzate l'arteria edia e la membrana rotonda della finestra.La membrana rotonda della finestra viene quindi perforata e il virus viene iniettato nello spon. Nella fase finale, il foro viene sigillato. In definitiva, l'espressione della proteina transgenica e il recupero dell'udito dell'animale possono essere valutati rispettivamente mediante microscopia a immunofluorescenza e misurazione della risposta uditiva del tronco encefalico.I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la coch, la stomia e l'approccio ventrale sono che l'iniezione postulare della membrana rotonda è minimamente invasiva relativamente veloce, consente iniezioni di volume più elevato e facilita la trasfezione diffusa di una varietà di cellule in tutta la cocleare. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà perché la procedura dipende fortemente dalla comprensione approfondita dell'anatomia cocleare. Dopo aver confermato l'anestesia con le dita dei piedi, pizzicare la regione postauricolare sinistra e disinfettare la pelle di un giorno postnatale, da 10 a 12 topi con etanolo al 70% e iodio povidone.Quindi coprire gli occhi con un unguento oftalmico protettivo e posizionare l'animale con il collo esteso su un termoforo. Al termine della preparazione chirurgica, incidere il tessuto sottocutaneo con piccole forbici per esporre il muscolo postauricolare. Dopo aver retratto il tessuto adiposo sul lato posteriore dell'incisione, separare i muscoli ai lati destro e sinistro perpendicolarmente all'incisione.Per esporre l'osso temporale, utilizzare un ago calibro 25 per perforare la bolla timpanica, staccando l'osso con una pinza quanto necessario per espandere il foro e consentire l'accesso al giro basale della coclea. Quindi allargare il foro a sufficienza per consentire la visualizzazione dell'arteria stagnata e della membrana rotonda della finestra. Forare delicatamente la membrana rotonda della finestra al centro con una pipetta capillare di silicato di burro.Asciugare la membrana rotonda della finestra con una carta da filtro sterile. Quindi attendere da cinque a 10 minuti affinché il fluido e il flusso si stabilizzino in questa fase. Prestare attenzione quando si tiene e si avanza la pipetta, in modo da rendere la perforazione della membrana della finestra rotonda il più piccola possibile.A seconda dell'uso del microscopio, la pipetta può essere tenuta a mano o con un manipolatore microm. Come puoi vedere qui, teniamo la pipetta a mano poiché il microscopio è troppo vicino al mouse per consentire un micro manipolatore. Ora aspirare uno o due microlitri di virus in una pipetta di vetro tirata con una punta di 15 micrometri di diametro e microiniettare il virus nella scaglia di timoni attraverso lo stesso foro precedentemente praticato nella membrana rotonda della finestra.Quindi estrarre la pipetta e sigillare rapidamente la nicchia rotonda della finestra con un piccolo tappo di muscolo, fissandola con una piccola goccia di adesivo per tessuti. Coprire il foro nella bolla uditiva con tessuto adiposo e riportare i muscoli postauricolari e il tessuto adiposo nella loro posizione normale. Successivamente, utilizzando una sutura cromica assorbibile 6.0 o inferiore, chiudere la ferita e disinfettare l'area dell'incisione con iodio povidone.Quindi posiziona il topo in una gabbia calda, restituendo il pop alla madre dopo il pieno recupero con monitoraggio quotidiano. Per valutare la funzione cocleare già quattro giorni dopo la somministrazione virale, posizionare un animale sedato trasfettato su un termoforo, quindi posizionare gli elettrodi dell'ago sottocutaneo al vertice sotto il padiglione auricolare sinistro e sotto l'orecchio controlaterale. Infine, inizia a registrare le risposte uditive del tronco encefalico o un BR in una camera insonorizzata come descritto in precedenza, misurando l'onda uno per analizzare l'attività del nervo cocleare come visto nel montaggio del foro cocleare.Questo approccio dimostra il successo dell'espressione transgenica all'interno delle cellule ciliate interne, delle cellule ciliate esterne e delle cellule di supporto senza un organo significativo di lesione COR T che diversi tipi di cellule che esprimono GFP possono essere osservati nel foro cocleare. Mount dimostra che la scelta del sierotipo del virus adeno associato deve essere compatibile con i tipi di cellule da trasdurre. Il numero di cellule trasfettate varia a seconda della concentrazione e del volume iniettato dal virus.In questo caso, l'aumento da 0,6 a un microlitro ha comportato un aumento del numero di cellule trasfettate a un livello paragonabile a quello del transgene del gluteo tre di tipo V selvatico è stato ripristinato nei topi KO iniettati come si vede in queste immagini qui, l'effetto della somministrazione postauricolare della membrana della finestra rotonda del virus V GL tre nell'orecchio interno dei topi V gl tre knockout sul salvataggio dell'udito è dimostrato come si vede in il grafico. Le tracce di A BR sono state ripristinate nel topo knockout salvato da tre VLU, raggiungendo soglie paragonabili a quelle osservate nei topi wild type. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di prendersi il tempo necessario per ogni passaggio per evitare danni alle strutture dell'orecchio interno e medio e ai muscoli del collo.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un approccio post-chirurgico per la somministrazione di trattamenti sperimentali virali farmacologici molecolari nel pan dello scheletro delle MA attraverso la membrana rotonda del vento.

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L'orecchio interno è un topo placode derivato il cui organo sensoriale per lo sviluppo del programma è elaborato durante la gestazione. Definiamo...

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

Fonte: Kozin, E. D., et.al. Visualizzazione diretta del nucleo cocleare dorsale murino per la stimolazione optogenetica della via uditiva. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra il trasferimento genico mediato da virus nel nucleo cocleare dorsale del topo (DCN) per consentire la stimolazione uditiva indotta dalla luce. Un vettore virale che codifica per l'opsina, un canale ionico sensibile alla luce, viene iniettato nel DCN dopo una craniotomia e un'aspirazione cerebellare per l'accesso diretto.

Trasferimento genico mediato da virus nel nucleo cocleare dorsale del topo per la stimolazione uditiva indotta dalla luce

Questo video mostra la canalostomia, una procedura che consente la somministrazione locale di farmaci nell'orecchio interno di un topo attraverso il canale semicircolare con danni minimi all'udito e alla funzione vestibolare. Questo metodo consente l'inoculazione di vettori virali, prodotti farmaceutici e piccole molecole nell'orecchio interno del topo.

Canalostomia per la somministrazione locale di farmaci nell'orecchio interno di un topo adulto

Fonte: Akil, O., et al., Metodo chirurgico per la consegna genica mediata da virus all'orecchio interno del topo attraverso la membrana della finestra rotonda. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra la procedura di somministrazione di un gene terapeutico nell'orecchio interno di un cucciolo di topo con perdita dell'udito indotta geneticamente. Utilizzando un vettore virale adeno-associato (AAV), il gene viene iniettato attraverso la membrana rotonda della finestra, consentendo alle particelle...

Terapia genica basata su vettori virali per il ripristino dell'udito in un modello murino

Esistono vari metodi per introdurre agenti ototossici nelle coclee dei modelli animali. Viene presentato un protocollo chirurgico per la somministrazione di agenti ototossici alla nicchia della finestra rotonda. La procedura è affidabile, crea lesioni intra-cocleari mirate ed evita danni meccanici alla microarchitettura. È possibile l'esame dell'autoriparazione/rigenerazione cocleare.

L&#39;approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Due approcci microchirurgici per la somministrazione locale di farmaci all'orecchio interno sono descritti e confrontati in termini di impatto sui parametri uditivi, citoarchitettura cocleare ed espressione di marcatori infiammatori.

Uno studio comparato Drug metodi di consegna mirate per l'orecchio interno mouse: Bullostomy Versus Iniezione transtimpanica

Segnaliamo un metodo chirurgico per amministrare le droghe all'interno dell'orecchio di un primate non umano, il comune uistitì (Callithrix jacchus), tramite la membrana della finestra rotonda.

Una procedura chirurgica per l'amministrazione delle droghe all'interno dell'orecchio in un Non umano primati comune uistitì (Callithrix jacchus)

In questo studio, descriviamo l'approccio del canale semicircolare posteriore come un metodo affidabile per la consegna del gene dell'orecchio interno in topi neonatali. Indichiamo che consegna del gene attraverso il canale semicircolare posteriore è in grado di irrorare l'intero orecchio interno.

Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

Qui descriviamo la procedura canalostomy che permette la consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati attraverso il canale semicircolare con minimo danno alla funzione uditiva e vestibolare. Questo metodo può essere utilizzato per inoculare vettori virali, prodotti farmaceutici e le piccole molecole nell'orecchio interno del mouse.

Canalostomy come un approccio chirurgico alla consegna di droga locale nelle orecchie interno dei topi adulti e neonati

Microscopia intravitale di seguire gli eventi emodinamici infiammatori e temporale e spaziale del microcircolo piale.

Microscopia intravitale della microcircolazione cervello di topo usando una finestra chiusa del cranio

Impara un approccio chirurgico post-auricolare per la consegna virale diretta nella coclea del topo attraverso la membrana della finestra rotonda. Questa tecnica minimizza la perdita di sangue e la mortalità, facilitando la terapia genica per la ricerca sull'udito.

Metodo chirurgico per Virally Mediated Gene consegna all'orecchio mouse interno attraverso la finestra rotonda a membrana

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