Una procedura di impianto del Camera spinale per longitudinale In Vivo Imaging del cavo del mouse spinale

In questo video, si descrive un procedimento per impiantare una camera di imaging ottico cronica nel midollo spinale dorsale di un topo vivo. La camera, procedura chirurgica, e di imaging cronica sono rivisti e dimostrati.

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di impiantare una camera di imaging sopra il midollo spinale dorsale di un topo per consentire l'imaging ottico longitudinale senza la necessità di ripetere le crisi chirurgiche. Ciò si ottiene esponendo prima tre vertebre toraciche e rimuovendo i tessuti molli sopra la colonna vertebrale. Il secondo passo consiste nel bloccare le vertebre esposte utilizzando i pezzi laterali della camera ed eseguire una laminectomia dorsale.

Successivamente, la piastra superiore della camera viene fissata saldamente sopra il midollo spinale esposto e sigillata con elastomero siliconico e un vetro di copertura. Il passaggio finale consiste nel sigillare la pelle attorno all'impianto utilizzando adesivi e consentire all'animale di riprendersi. In definitiva, la microscopia a fluorescenza multifotone viene utilizzata per visualizzare il comportamento cellulare e la struttura dei tessuti nel midollo spinale con risoluzione subcellulare nel tempo.

Il vantaggio principale della nostra nuova metodologia rispetto ai metodi esistenti, come l'apertura chirurgica ripetuta del midollo spinale, è la capacità di avere un numero quasi arbitrario di punti temporali di imaging distribuiti su un lungo periodo di tempo senza le complicazioni associate alla chirurgia ripetuta, come potenziali infezioni, traumi chirurgici o stress animale. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando stavamo considerando il precedente successo dell'imaging longitudinale a seguito di una lesione del midollo spinale nel pesce zebra trasparente. Abbiamo quindi deciso di espandere questo paradigma al modello dei mammiferi.

Iniziare questa procedura radendo l'area dell'arco toracico di un topo anestetizzato con fluoro. Quindi rimuovere i capelli tagliati. Successivamente, somministrare la miscela di soluzione fisiologica, ketoprofene e desametasone al topo per via sottocutanea.

Usando tamponi di cotone. Eseguire tre lavaggi alternati di iodio ed etanolo al 70% e attendere un minuto tra un lavaggio e l'altro. Successivamente, somministrare 100 microlitri di bupivacaina allo 0,125% al centro del cerotto rasato per via sottocutanea per ridurre il dolore nel sito di incisione.

Quindi trasferisci il mouse sugli attacchi stereo personalizzati. Inserire il termometro rettale e attendere circa 10 minuti affinché la bupivacaina faccia effetto al microscopio. Crea un'incisione di cinque millimetri sopra le vertebre di interesse con una lama di bisturi.

Successivamente, aumentare le dimensioni dell'apertura nella pelle mediante dissezione smussata. Successivamente, dissocia delicatamente la fascia connettiva tra la pelle e il muscolo sottostante. Tenere la pelle indietro per un'area di lavoro più ampia con i divaricatori e fare attenzione a non aumentare il peso sul torace e ostruire la respirazione.

Quindi afferrare il rostrale, la maggior parte delle vertebre che saranno esposte attraverso il muscolo sovrastante con un paio di pinze. Tagliare il tessuto su entrambi i lati del processo dorsale lontano da tre vertebre. Successivamente, rimuovere tutto il tessuto sovrastante dal laminato dorsale.

Successivamente, tagliare con cura i tendini attaccati alle vertebre su entrambi i bordi laterali della colonna vertebrale. Rimuovere delicatamente quanto più tessuto possibile dai bordi laterali della colonna vertebrale per fornire una superficie di serraggio pulita. Quindi sbrigliare delicatamente le vertebre di eventuali tessuti molli rimanenti.

Usando un raschietto osseo e un batuffolo di cotone, taglia via il tessuto incongruo usando le forbici chirurgiche. Quindi, regolare i divaricatori per trattenere il tessuto che circonda la colonna vertebrale. Insieme alla pelle, fissare le barre laterali dell'impianto ai rebbi dei perni di consegna e posizionarle nei supporti dei perni.

Quindi, blocca le tre vertebre. Utilizzando le barre laterali, applicare una pressione sufficiente per tenerle saldamente. Quindi utilizzare la pinza per garantire un serraggio livellato delle tre vertebre.

Assicurati che le barre laterali siano sia livellate che parallele prima di eseguire la laminectomia. Successivamente, pulire e asciugare accuratamente la superficie dorsale delle vertebre bloccate utilizzando tamponi di cotone. In questa procedura, inserire le punte delle forbici Vana nello spazio epidurale della vertebra mediale bloccata e stringere leggermente le maniglie.

Se l'osso è secco, dovrebbe rompersi lungo la lamina dorsale. Ripetere questa procedura sul lato controlaterale per rilasciare la lamina mentre si afferra la lamina sciolta Delicatamente con il processo dorsale con una pinza, tagliare accuratamente il tessuto connettivo alle estremità rostrali e coccolare la lamina. Quindi lavare accuratamente il sangue sovrastante il midollo spinale con soluzione fisiologica allo 0,9% o la colonna vertebrale cerebrale artificiale assorbire il liquido in eccesso con tamponi di cotone.

Successivamente, tagliare i bordi laterali dell'osso e procedere verso le barre laterali dell'impianto. Successivamente controllare l'emorragia utilizzando tamponi di cotone e soluzione fisiologica. Nel caso in cui una porzione del periostio si sia staccata e sovrastante il midollo spinale, rimuovere delicatamente il tessuto utilizzando tamponi di cotone e un ago da 29 a 30 gauge.

Fare attenzione a non ferire il midollo spinale e non confondere il periostio allentato con un dator ben avvolto. Alla fine. Sigillare i restanti bordi esposti dell'osso con dentale, acrilico e cianoacrilato.

Prestare particolare attenzione per evitare che la colla penetri nel midollo spinale esposto. Ora, posiziona con cura la piastra superiore sull'animale in modo che le quattro fessure siano allineate con i quattro fori sulle barre laterali e l'apertura si sovrapponga al midollo spinale esposto. Usando un cacciavite da gioielliere, inizia con attenzione con la prima vite, stabilizzando l'asta del cacciavite con un altro paio di pinze.

Non serrare la vite in questa fase, ma inserirla in modo che le prime filettature siano innestate. Ripetere questo processo per le altre tre viti. Con tutte e quattro le viti in posizione, serrare ciascuna vite alternativamente con gli stessi piccoli incrementi fino a quando tutte le viti non sono saldamente fissate.

Quindi, utilizzare l'elastomero siliconico di marca Quick Sill per riempire lo spazio tra il midollo spinale e la finestra di vetro e applicarlo al midollo spinale esposto. Assicurarsi di eliminare eventuali bolle d'aria contenenti silicone dal puntale di miscelazione prima della sua applicazione. Quindi posizionare rapidamente un vetrino coprioggetti da cinque millimetri nell'inserto nella piastra superiore.

Applicare una pressione sufficiente a spremere gradualmente l'elastomero liquido per circondare il midollo spinale, ma senza provocare la compressione del midollo spinale. Successivamente, coprire i bordi dell'elastomero essudato con dentale, acrilico e cianoacrilato e utilizzare gli adesivi per far aderire l'elastomero all'osso circostante il più possibile per evitare che l'elastomero si sposti sulla superficie del midollo spinale. Quindi, rimuovere i divaricatori e tirare la pelle verso l'alto attorno al bordo dell'impianto.

Utilizzare il cianoacrilato per far aderire la pelle ai bordi dell'impianto. Successivamente, inserire le viti nelle alette della piastra superiore. Successivamente sigillare le fessure delle viti della piastra superiore utilizzando acrilico dentale prima di rimettere l'animale nella gabbia per il recupero.

Prima delle sessioni di imaging, anestetizzare nuovamente il mouse e fissare le viti esposte dell'impianto ai perni filettati per la stabilizzazione. Questa figura mostra che una camera spinale cronica rimane otticamente trasparente per più settimane. Si tratta di immagini da bianche a chiare del midollo spinale che vanno da alcuni minuti a tre settimane dopo l'operazione.

I punti di riferimento vascolari sono identificabili in tutti i punti temporali. Si osservano pochi cambiamenti in un giorno dopo l'intervento. Una densa proliferazione fibrosa è presente in una parte della finestra già dopo tre giorni e provoca un parziale offuscamento dell'area di imaging.

È presente anche una lieve neovascolarizzazione, che non oscura la vascolarizzazione originale in luce bianca o con due PEF. La camera spinale cronica consente l'imaging ripetuto di più fotoni senza la necessità di interventi chirurgici ripetuti Mostrato. Ecco le immagini di un topo transgenico che esprime YFP in un sottogruppo di assoni DRG nel fii dorsale del midollo spinale.

Il sistema vascolare è stato marcato mediante iniezione intravascolare di colorante mostrato in rosso. L'attività della microglia può anche essere monitorata nel tempo in topi transgenici doppi della coscia, uno YFP, CX, tre CR, uno GFP, mentre gli assoni e la microglia rimangono visibili. Il contrasto e la risoluzione diminuiscono modestamente nel tempo.

Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente Dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ci ha aperto la strada per esplorare l'eterogeneità temporale e spaziale del deperimento degli assoni dopo una lesione del midollo spinale.

E topi.