Protocollo per lo studio Extinction of Fear Condizionata in Naturalmente bicicletta ratti di sesso femminile

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare gli effetti degli ormoni gonadici sul comportamento di estinzione della paura nelle femmine durante gli stati ormonali bassi e alti del ciclo Esra e il ruolo dell'estradiolo quando viene somministrato esogenamente. Ciò si ottiene monitorando prima il ciclo ESRA di ratti femmine adulte e identificando in quale fase si trovano prima della sperimentazione. Successivamente, gli animali che si trovano nella fase di estro vengono collocati nelle camere loro assegnate per l'abitazione e il condizionamento della paura.

Il giorno successivo, quando gli animali sono in estro, le femmine vengono iniettate con estradiolo o veicolo e vengono sottoposte a un addestramento all'estinzione della paura. Infine, il terzo giorno, gli animali vengono rimessi nella stessa camera per testare il ricordo della sessione di estinzione del giorno prima. In definitiva, il tampone vaginale per l'identificazione della strasi EST consente agli investigatori di manipolare le fluttuazioni naturali degli ormoni gonadici per studiare la loro influenza sulla memoria di estinzione della paura.

Questo protocollo può essere utilizzato per aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle differenze sessuali, ad esempio i processi di estinzione della paura sono diversi nei maschi e nelle femmine? E se è così, quali sono i meccanismi ormonali e neurobiologici che soddisfano queste differenze? Il vantaggio principale di questo protocollo è che può aiutare a promuovere lo studio dell'estinzione della paura femminile condividendo i metodi per farlo.

I ricercatori nuovi a questi metodi spesso faticano a monitorare in modo affidabile il ciclo ESER perché la procedura può richiedere molto tempo e dipendere fortemente da una tecnica corretta. Le implicazioni di questi studi possono contribuire alle opzioni di trattamento specifiche per sesso per i disturbi legati alla paura e all'ansia. Questo può essere importante dato che le donne hanno il doppio delle probabilità rispetto agli uomini di sviluppare queste psicopatologie.

Lisa uomo, un postdoc in laboratorio e cura segreta. Un assistente di ricerca in laboratorio mostrerà la procedura per raccogliere campioni per monitorare il ciclo dell'estro. Dopo aver preparato una soluzione salina allo 0,9%, immergere un applicatore con punta di cotone nel liquido e utilizzare un tovagliolo di carta per tamponare la punta della soluzione in eccesso, tenendo la coda di un ratto verso l'alto e facendo attenzione a non causare angoscia.

Inserire delicatamente la punta di cotone nel canale vaginale non troppo in profondità e arrotolarla attorno alle pareti per catturare rapidamente le cellule vaginali sciolte. Rimuovendo la punta senza trasferire troppo fluido, far rotolare delicatamente la punta dell'applicatore su un vetrino da microscopio pre-etichettato, assicurandosi che il campione si trasferisca sul vetrino. Raccogliere campioni per almeno due cicli completi e trasferirli per diversi giorni consecutivi su un vetrino per poter tracciare e identificare meglio gli extra EST giornalieri.

Cambia fase una volta che i vetrini sono asciutti, immergerli 10 volte nel fissativo, quindi 10 volte nella soluzione colorante. E infine, cinque volte in soluzione di controcolorante. Risciacquare delicatamente con acqua.

Lasciare asciugare completamente i vetrini all'aria prima di osservarli al microscopio prima dell'inizio dell'esperimento di condizionamento, pre-esporre le femmine alle camere di condizionamento con le luci della casa accese per 20-30 minuti al giorno per tre giorni per consentire loro di acclimatarsi all'ambiente. Assegna la scatola a cui sono pre-esposti come camera per lo studio. Pulisci accuratamente le scatole tra le sessioni e gli animali per rimuovere gli odori poiché possono influenzare il comportamento e il ciclo di stress EST.

Una volta verificato che gli animali sono nella fase di estro del ciclo extra EST, iniziare la fase di condizionamento dell'assuefazione. Effettuare misurazioni di base del congelamento prima del primo stimolo della condizione di tono misurando i secondi in cui l'animale trascorre un cellulare durante lo stimolo. Intervallo di tempo assente, calcolare il punteggio di congelamento percentuale dividendo il secondo trascorso immobile per la durata della prova.

Per condurre l'addestramento all'estinzione durante la fase estrale ME, condizionare i ratti nel loro ultimo giorno di ESTRO come determinato mediante tampone. Posizionare gli animali nella camera di condizionamento e per eseguire una prova di assuefazione CS da soli. Induce un tono CS per 30 secondi.

Dopo aver atteso in media tre minuti prima della prova successiva, ripetere la prova CS da sola altre quattro volte per un totale di cinque prove prima del condizionamento. Collegare il pavimento della griglia dell'ammortizzatore del piede a un generatore di stimolazione elettrica. Utilizzare un livello di stimolazione compreso tra 0,5 e 0,6 milliampere come stimolo incondizionato o eco e un tono di quattro kilohertz e 80 decibel come CS immediatamente dopo la sessione di assuefazione.

Iniziare le prove CS US accoppiate di condizionamento della paura presentando un 32° tono CS, seguito da uno shock ecografico di 0,5 secondi separati da un intervallo tra le prove di circa tre minuti. Ripeti la prova di coppia altre sei volte alla fine della sessione di condizionamento. Riporta gli animali nelle gabbie di casa e nella struttura per animali fino al giorno successivo, il secondo giorno.

Dopo aver tamponato e identificato la fase estrale di ME per tutti gli animali sottoposti al primo giorno del protocollo, preparare abbastanza estradiolo in olio di sesamo o soluzione salina allo 0,9% per ogni animale per ricevere una dose di 15 microgrammi per chilogrammo per somministrare l'ormone per via sottocutanea. Sollevare la pelle flaccida tra la scapola per il collo con un pizzico delicato e inserire la siringa nel triangolo formato dalle pieghe della pelle. 30 minuti dopo che gli animali hanno ricevuto le iniezioni, posizionali nelle camere di condizionamento e inizia l'addestramento all'estinzione eseguendo 20 CS da solo.

Le prove consistono ciascuna in un 32° tono di quattro kilohertz, 80 decibel con circa tre minuti tra le prove 24 ore dopo. Terzo giorno, tamponare gli animali che hanno completato le sessioni il primo e il secondo giorno dopo aver posizionato gli animali nelle camere di condizionamento assegnate. Inizia la sessione di richiamo dell'estinzione eseguendo tre prove C da solo con circa tre minuti tra le prove al termine della sessione di richiamo, riporta gli animali nelle loro gabbie domestiche e analizza i dati secondo il protocollo di testo in questo protocollo di estinzione della paura.

Gli animali che si sono estinti bene e hanno conservato il ricordo dell'addestramento all'estinzione hanno mostrato una bassa paura l'ultimo giorno di test comportamentali durante l'estinzione Recall. Come dimostrato qui, i ratti maschi e femmine non differiscono in modo significativo nell'espressione della paura condizionata. Durante ogni fase, una differenza di sesso diventa evidente quando gli animali vengono analizzati separatamente come gruppi di fase ES ad alto e basso livello di estrogeni.

Questo grafico mostra l'effetto della fase estro sulla memoria di estinzione della paura, ratti femmina che si sottopongono a training di estinzione durante la fase a basso contenuto di estrogeni del ciclo extra EST. Non ricordano la memoria dell'estinzione del terzo giorno, così come quelli addestrati nei PROE. Tuttavia, quando le femmine metri vengono iniettate per via sottocutanea con una dose di 15 microgrammi per chilogrammo di estradiolo prima dell'estinzione, l'apprendimento del consolidamento della memoria di estinzione della paura sembra essere migliorato, come dimostrato dal basso congelamento durante il richiamo dell'estinzione.

Pertanto, questi dati indicano che gli ormoni gonadici possono modulare il richiamo all'estinzione della paura e anche mediare le differenze di sesso nei comportamenti di estinzione della paura condizionata. Ulteriori procedure come la chirurgia dell'incannulamento e l'immunoistochimica possono essere eseguite in combinazione con il metodo qui descritto per rispondere a domande come: dove agisce l'estradiolo nel cervello per modulare la paura, l'estinzione, il consolidamento della memoria e in che modo l'estradiolo altera l'attività neuronale all'interno di queste regioni? Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come studiare il riciclaggio naturale dei ratti femmina e l'influenza dell'estradiolo nell'estensione ex chiara.