Name: Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Impara l'isolamento di cellule endoteliali microvascolari cerebrali primarie murine per studiare la barriera ematoencefalica. Questo metodo combina omogeneizzazione meccanica, digestione enzimatica e centrifugazione a gradiente di densità per ottenere colture pure.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Celle-in-Motion Cluster of Excellence (EXC 1003 - CIM), Università di Muenster (a SB e SGM) e dalla Else Kröner-Fresenius-Stiftung (2012_A88 a SB e SGM). Ringraziamo Heike Blum per le ottime illustrazioni.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dalle autorità locali (&quot;LandesamtfürNatur, Umwelt und Verbraucherschutz NRW, Fachbereich 87, Tiergesundheit, Tierschutz, Recklinghausen, Germania&quot;) e condotto secondo la legge tedesca di protezione degli animali. 1. Osservazioni generali per esperimenti mouse <ol><li> Eseguire tutti gli esperimenti con i topi in conformità con le linee guida del rispettivo Comitato Istituzionale cura degli animali e l&#39;uso. </li><li> Tenere i topi in condizioni esenti da organismi patogeni e consentire loro di avere accesso a cibo e acqua ad libitum. </li><li> Utilizzare i topi per età e sesso nei gruppi trattati perché le proprietà biologiche può variare con l&#39;età e il sesso. </li><li> Per quanto possibile cercare di ridurre, perfezionare o sostituire gli esperimenti sugli animali. </li></ol> 2. Preparazione del gradiente Percoll <ol><li> Mescolare 19 ml di PBS 1x con 1 ml di PBS 10x, 1 ml FCS e 10 ml di Percoll. </li><li> Eseguire sterile filtrazione in un tubo di vetro (diametro dei pori del filtro: 0,2 micron). Successivamente conservare la soluzione a 4 ° C. </li></ol> 3. Preparazione del mezzo endotelio cellulare e rivestimento delle piastre di coltura cellulare <ol><li> Media delle cellule endoteliali: <ol><li> Preparazione del mezzo 500 ml: (. Circa 20%) Miscelare 400 ml di terreno DMEM (. Circa 80%) con 100 ml PDS, 0,25 ml bFGF (. 20 ug / ml, circa 0,05%), 0,5 ml di eparina (100 microlitri / mi;. circa 0,1%) e 0,5 ml pyrumycin (4 mg / ml;. circa 0,1%). Aggiungere pyrumycin solo per mezzo di coltura cellulare usato nei primi 2 giorni di coltura. </li><li> Eseguire filtrazione sterile in un tubo di vetro (diametro dei pori del filtro: 0,2 micron). Successivamente conservare la soluzione a 4 ° C. </li></ol></li><li> Rivestimento di piastre di colture cellulari: <ol><li> Ad 1 ml di soluzione di rivestimento, preparare una soluzione di 500 microlitri DDH 2 O, 400 microlitri collagene IV (0,4 mg / ml) e 100 ml di fibronectina (0,1 mg / ml). </li><li> Coprire tutta la superficie di each pozzetto della piastra di coltura cellulare con la soluzione di rivestimento. Conservare la piastra a 4 ° C per una notte. </li></ol></li></ol> 4. L&#39;isolamento di cellule endoteliali murine Cervello microvascolari (MBMEC) <ol><li> Sacrifica 10 topi adulti (8 - 12 settimane di vita, C57BL / 6) per dislocazione cervicale. Successivamente isolare i mouse-cervello e conservare in 5 ml di PBS (Caveat: lavoro sterile). </li><li> Rimuovere cervello steli, cerebella e talami con una pinza. Staccare meningi facendo rotolare con cura il cervello su una carta assorbente sterile. Raccogliere le conseguenti free-meningi forebrains. </li><li> Trasferire il cervello di un tubo da 50 ml Falcon riempito con 13,5 ml di DMEM. </li><li> Macinare il tessuto, prima con una pipetta 25 ml, poi con una pipetta 10 ml fino alla media diventa lattiginoso. </li><li> Poi digerire il tessuto con una miscela di 0,6 ml di collagenasi CLS2 (10 mg / ml in DMEM) e 0,2 ml di DNAsi (1 mg / ml in PBS) a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) per 1 ora a 37 ° C su un orbitale scuoterer a 180 rpm. </li><li> Aggiungere 10 ml di DMEM aggiunti alla sospensione di tessuto e centrifugare le cellule a 1.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante (Caveat: PELLET è facile perdere) </li><li> Per rimuovere la mielina, risospendere il pellet con una pipetta 25 ml in 25 ml di BSA-DMEM (20% w / v) (circa. 25 volte), e centrifugare a 1000 xg per 20 min a 4 ° C. </li><li> Eliminare lo strato di mielina superiore (latte) con una rotta pipetta Pasteur di vetro con diametro maggiore, e quindi eliminare lo strato di BSA con una normale pipetta Pasteur. </li><li> Risospendere il pellet in 9 ml di DMEM ed aggiungere 1 ml di collagenasi / dispasi (concentrazione finale di 1 mg / ml) e 0,1 ml di DNAsi. Digerire la soluzione per 1 ora a 37 ° C in un agitatore orbitale a 180 giri al minuto (avvertimento: non utilizzare la pipetta per sospendere di nuovo - le cellule possono essere persi). </li><li> Durante la digestione, centrifugare la soluzione Percoll per impostare il gradiente di densità utilizzando un&#39;ultracentrifuga a 3.000 xg per 1 ora a 4 ° C, con accelerazione, wisarie, senza freno. </li><li> Aggiungere 10 ml di DMEM alla sospensione cellulare digerito. Centrifugare la sospensione a 1000 xg per 10 min a 4 ° C. Poi scartare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di DMEM. </li><li> Aggiungere le cellule risospese attenzione sulla parte superiore del gradiente di Percoll e centrifugare a 700 xg per 10 min a 4 ° C senza accelerazione e frenatura. Nota: Le celle sono visibili come una nuvola in interfase. </li><li> Prendete circa. 12 ml di interfase con le cellule con un lungo ago sterile e posizionarlo in una nuova Falcon da 50 ml con 5 ml di DMEM. </li><li> Centrifugare le cellule di nuovo a 1000 xg per 10 min a 4 ° C. Successivamente risospendere il pellet in mezzo delle cellule endoteliali (utilizzare circa. 0,2 ml di terreno per 1 cm 2 di superficie della piastra di coltura cellulare). </li><li> Rimuovere la soluzione di rivestimento da piastre di coltura di cellule rivestite (vedere il punto 3.2) e sciacquare ogni bene con PBS sterile in due fasi di lavaggio consecutive. </li><li> Mantenere colture cellulari in endotelialemedio cella a 37 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore sterile. Cambiare la media ogni due o tre giorni. Celle divise al 90% di confluenza. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Disfunzioni emato-encefalica-barriera è un marchio di garanzia di varie malattie deleteri sul sistema nervoso centrale, ad esempio una ripartizione della BBB nella sclerosi multipla facilita ampiamente l&#39;invasione del sistema nervoso centrale da parte delle cellule immunitarie autoreattive e permette l&#39;incontro e la distruzione degli oligodendrociti. In ictus ischemico l&#39;interruzione della BBB e la successiva formazione di edema cerebrale sono fattori critici che influenzano la crescita infarto secondario e la sopravvivenza globale dei pazienti 6. Inoltre, da alterazioni della BBB in aree remote lesioni ischemiche focali sono in grado di indurre diffuse alterazioni funzionali del cervello. Tuttavia, i meccanismi molecolari alla base sono in gran parte sconosciuti 5. Al contrario, l&#39;alta densità e la diversità dei trasportatori di efflusso in BMECs funzionali riduce la concentrazione di farmaci benefici come chemioterapici per tumori maligni del cervello o di antibiotici per le malattie infettive. Di conseguenza, una più profonda comprensione del sangue-cervello-barÈ necessario rier funzione in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche per sviluppare agenti farmacologici in grado di regolare specificamente la funzione barriera nella direzione favorita 21. Affidabile in modelli in vitro di BBB sono strumenti indispensabili per lo studio dei meccanismi di regolamentazione a BBB. Molte linee di cellule endoteliali cerebrali immortalati sono stati stabiliti e impiegati come modelli in vitro di BBB 22. Queste linee cellulari offrono alcuni vantaggi rispetto BMECs primarie man mano che crescono più velocemente e mantengono alcune caratteristiche BBB nell&#39;arco di diversi passaggi. Tuttavia, le linee di cellule endoteliali non possono sostituire in toto per le cellule primarie proprietà come importanti sono modificati che si mescolano con la trasferibilità dei risultati sperimentali alla situazione in vivo. Ad esempio, la linea cellulare endoteliale cervello murino bEnd.5 esprime solo bassi livelli di proteine ​​di giunzione stretti discontinuo distribuiti portano a alto Paracpermeabilità ellular 23. BEnd.3, un&#39;altra linea di cellule murine endoteliali cerebrali di uso frequente, dimostra giunzioni densi e continui distribuiti stretti, una elevata resistenza transendoteliale, diversi trasportatori di efflusso e bassa permeabilità paracellulare. Tuttavia, strati cellulari bEND.3 confrontati BMECs primari mancano di una vera discriminazione rispetto alla permeazione di alcuni transcellulare e substrati paracellular 24. Nelle preparazioni di colture cellulari primarie, cellule contaminanti possono interferire in modo significativo con la validità dei risultati sperimentali. Nel protocollo descritto, pyrumicin viene usato come agente selettivo per cellule endoteliali di raggiungere elevata purezza. Tuttavia, un controllo regolare della qualità della coltura cellulare è inevitabilmente necessario per garantire per esperimenti affidabili. Ci sono diversi metodi per il controllo qualità, oltre a tipiche caratteristiche morfologiche delle cellule endoteliali (Figura 1A), il transendotheliaresistenza l può essere misurato o l&#39;espressione del marcatore delle cellule endoteliali come CD31 (Figura 1B) o il fattore di von Willebrand (vWF) potrebbe essere valutata. Il numero di cellule endoteliali cerebrali isolate da un cervello di topo è relativamente basso e di creare una coltura cellulare adeguata per più esperimenti, il cervello dei topi diversi devono essere messe in comune. Nella nostra esperienza, almeno 10 topi devono essere utilizzati per un esperimento che potrebbe essere un fattore limitante seconda delle risorse dei rispettivi stabulario. Al fine di evitare distorsioni o fattori confondenti, solo i topi con un background genetico e ambientale identiche dovrebbero essere messe in comune. Al contrario, bovini e preparazioni di cellule endoteliali cerebrali suine fornire un gran numero di cellule endoteliali cerebrali disponibili in un cervello. Tuttavia, oltre il semplice allevamento e l&#39;alloggiamento, il repertorio ampio e sempre crescente di topi transgenici rende disponibili murino primario BMECs come idealemodello per studiare la funzione emato-encefalica Barriera. Diversi risultati fondamentali riguardanti le funzioni del BBB e dei meccanismi molecolari alla base provengono da studi in sistemi di coltura di tessuti 2D. Recentemente, sistemi di coltura 3D sono stati sviluppati 25, in cui le cellule endoteliali sono collocati all&#39;interno di una matrice di collagene che consenta loro di formare lume e reti tubolari. Questi nuovi sistemi di coltura cellulare consentono una riproduzione ancora più precisa dei processi vascolari nell&#39;organismo integro in vivo. Il coinvolgimento di ulteriori cellule dei NVU in 3D sistemi di colture cellulari, come i periciti e astrociti potrebbe rivoluzionare in vitro studio della funzione emato-encefalica Barriera; primi modelli sono stati recentemente sviluppati 26. Ci sono alcune raccomandazioni per la risoluzione dei problemi. Innanzitutto lavoro sterile è essenziale per la qualità della coltura di cellule endoteliali. In secondo luogo, pyrumycin deve essere aggiunto solo per cellulareterreno di coltura utilizzato nei primi 2 giorni di coltura, l&#39;applicazione più lungo potrebbe portare ad un aumento della morte cellulare MBMEC e la funzione di barriera bassa qualità. In terzo luogo, gli enzimi applicati in questo protocollo devono essere utilizzati e conservati secondo le istruzioni del fabbricante; altrimenti la loro funzione potrebbe essere compromessa. Inoltre, il rivestimento delle piastre di coltura di cellule potrebbe essere modificata se le cellule endoteliali non attribuiscono. Le concentrazioni di fibronectina e collagene potrebbero essere modificati o altre proteine ​​della matrice possono essere aggiunti alla soluzione di rivestimento. Infine, l&#39;età, il sesso, la stagione delle condizioni anno e ambientali all&#39;interno della struttura degli animali sono fattori importanti che potrebbero influenzare la qualità di isolamento MBMEC e comparabilità degli esperimenti. Occorre garantire che le condizioni siano comparabili tra esperimenti indipendenti. Il protocollo descritto dovrebbe essere considerato come un metodo neuroimmunologica base per isolare BMECs murini. Le cellule isolate possono essere used per una vasta gamma di applicazioni per ottenere una visione più completa funzione BBB, come ad esempio test di migrazione, genetica e studi di espressione di proteine, valutazioni elettrofisiologiche o esperimenti di permeabilità. Come accennato in precedenza, i sistemi di coltura cellulare 3D di BMECs potrebbero fornire nuove opportunità per studiare i complessi meccanismi coinvolti nella regolazione della BBB nel contesto del NVU. Pertanto, l&#39;isolamento delle cellule endoteliali primarie rimarrà una tecnica prezioso nel campo della ricerca BBB in futuro.

<html> Cervello microvascolare cellule endoteliali (BMEC) formano monostrati che sono parte integrante della ematoencefalica barriera altamente specializzato (BBB). BMECs sono interconnessi da proteine ​​giunzionali attaccato ad una membrana basale. Insieme con periciti, cellule muscolari lisce, i piedi di fascia astrociti e cellule circolanti del sangue si accumulano i cosiddetti unità neurovascolare (NVU) 1. Contro il concetto precedente di una barriera impermeabile tra il sangue e il nervoso centrale (SNC), il NVU è un&#39;interfaccia dinamica, altamente specifico e regolato che controlla il passaggio di fluidi, molecole e cellule tra vasi sanguigni cerebrali e del SNC 2 . Una disfunzione o disregolazione del NVU possono avviare e / o contribuire ad una varietà di neurovascolari, malattie infettive, infiammatorie o degenerative del sistema nervoso centrale, come l&#39;ictus ischemico, l&#39;HIV-encefalopatia, la sclerosi multipla, il morbo di Alzheimer o di Parkinson malattia 3-6. _content &quot;&gt; Il monostrato BMEC è chiuso ermeticamente da un complesso giunzionale costituito di tenuta (TJ) e giunzioni aderenti (AJ) 7. L&#39;elevata resistenza elettrica e la bassa permeabilità paracellulare della BBB si basano principalmente sulle proteine ​​TJ 8. Le TJs sono complessi formati dalle proteine ​​transmembrana della famiglia Claudin e occludina, che sono collegati al citoscheletro delle cellule endoteliali da molecole adattatori, quali le zonulaoccludens (ZO) proteine ​​ZO1-3 4. giunzioni aderenti sono assemblati principalmente dalla proteina integrale di membrana vascolare endoteliale (VE) -cadherin, che è legata al citoscheletro tramite catenine 8. La stretta tenuta della BBB impedisce il libero scambio di substrati e cellule tra il sangue e nel liquor. Le eccezioni a questa regola sono lipofile, piccole molecole di peso molecolare &lt;400 Da, che sono in grado di attraversare la BBB da lipidica mediata diffusione 9. Il passaggio di grandi e / omolecole idrofile, come il glucosio, aminoacidi, peptidi, proteine ​​e molti farmaci è limitata a sistemi altamente controllati transcellulare di trasporto 10, che possono essere classificati in cinque categorie principali: trasporto carrier-mediato, trasporto di ioni, trasporti efflusso attivo, mediata da recettori trasporti, e caveole mediata trasporto 4. Questi sistemi trasportatori aiutano mantenere l&#39;omeostasi del sistema nervoso centrale, che è richiesto per una generazione del segnale accurata, trasduzione e integrazione. Inoltre, BMECs sono in grado di controllare attivamente il passaggio di molecole distinte mediante l&#39;espressione di una varietà di ectoenzimi. Questi enzimi sono localizzati sulla superficie cellulare e modificare substrati endogeni ed esogeni specifici impedire o consentire il passaggio della BBB 11. Considerando che il sistema nervoso centrale è stato considerato come un organo immunitario privilegiato per un lungo tempo, i recenti risultati suggeriscono un sistema piuttosto dinamico e strettamente regolamentato di Surv immunitarioeillance del SNC. I BMECs sono criticamente coinvolti nella regolazione della trasmigrazione delle cellule immunitarie. Con l&#39;espressione delle selectine sulle loro linfociti superficie selettivamente indotto a fissare liberamente per l&#39;endotelio. La secrezione di chemochine che incontrano con specifici recettori sui leucociti conduce all&#39;espressione o cambiamenti conformazionali di integrine leucocitarie, come LFA-1 (funzione associato al linfocita-1) e VLA-4 (molto tardi antigene-4). Le integrine mediano una ferma adesione legandosi loro counterreceptors endoteliali, ad esempio, VCAM-I (molecola di adesione delle cellule vascolari), ICAM-I (molecola di adesione intercellulare) che permettono la trasmigrazione nel parenchima cerebrale fra o attraverso BMECs della BBB 12-14. Questi e altri risultati sottolineano il ruolo attivo dell&#39;endotelio stesso nella regolazione della migrazione delle cellule immunitarie. Inoltre, BMECs come parte del NVU sono coinvolti nella regolazione del flusso ematico cerebrale linked alle richieste metaboliche neuronali locali. Dopo la stimolazione astrociti cellule endoteliali producono sostanze vasoattive come l&#39;ossido nitrico che porta al rilassamento delle cellule muscolari lisce vascolari 15. L&#39;angiogenesi e neurogenesi nella sviluppo e nell&#39;adulto mostra cervello patterning e sviluppo parallelo e condividere molte proprietà di regolazione 1, 4. Le cellule endoteliali sono criticamente coinvolte in questi processi 16, 17. In sintesi, BMECs fornire caratteristiche essenziali per garantire un corretto sviluppo e funzionamento del sistema nervoso centrale. La disfunzione BBB è legato a molti gravi disturbi neurologici. Tuttavia, solo pochi obiettivi sono stati identificati a livello di interfaccia cervello-vascolare per il trattamento specifico ed efficace 18. Semplificata in modelli in vitro sono stati utilizzati per comprendere i meccanismi coinvolti nella funzione e la regolazione di sistemi fisiologici complessi per lotempo ng. L&#39;isolamento come descritto da questo manoscritto e lo studio in vitro di murino BMECs, data la grande varietà di specifiche topo knockout-ceppi, potrebbe fornire una maggiore comprensione della funzione BBB e regolazione in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche aprono nuove strade terapeutiche.

<table><tbody><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Fattore di crescita dei fibroblasti basici</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>Aldrich A9418</td><td>Albumina sierica bovina</td></tr><tr><td>Collagenasi CLS2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>Alto livello relativo di attività proteasica</td></tr><tr><td>Collagenasi-dispasi</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td>Collagenasi da V. alginolyticus, Dispasi da B. polymyxa</td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0543</td><td>Da Engelbreth-Holm-Swarm membrana basale per sarcoma murino</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5030</td><td>Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4513</td><td>Deossiribonucleasi I da pancreas bovino</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6178</td><td>Siero fetale di vitello (chiamato anche siero fetale bovino)</td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3393</td><td>Anticoagulante</td></tr><tr><td>PDS</td><td>First Link UK Ltd.</td><td>60-00-850</td><td>Siero plasmaderivato</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1644</td><td>Riscaldare a temperatura ambiente prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pirumicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td>Deve essere utilizzato solo nei primi 2 giorni di coltura</td></tr></tbody></table>

isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

La barriera emato-encefalica è assemblata ultrastrutturalmente da un monostrato di cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) interconnesse da un complesso giunzionale di giunzioni strette e aderenti. Insieme ad altri tipi di cellule come gli astrociti o i periciti, formano l'unità neurovascolare (NVU), che regola in modo specifico lo scambio di fluidi, molecole e cellule tra il sangue periferico e il SNC. Attraverso questo sistema complesso e dinamico, i BMEC sono coinvolti in vari processi che mantengono l'omeostasi del SNC. Una disfunzione della BBB è osservata come un passaggio essenziale nella patogenesi di molte gravi malattie del SNC. Tuttavia, le terapie specifiche e mirate sono molto limitate, poiché i meccanismi sottostanti sono ancora lontani dall'essere compresi. 
I modelli animali e in vitro sono stati ampiamente utilizzati per ottenere una comprensione approfondita di complessi processi fisiologici e fisiopatologici. Attraverso la riduzione e la semplificazione è possibile focalizzare l'indagine sull'argomento di interesse ed escludere una varietà di fattori confondenti. Tuttavia, la comparabilità e la trasferibilità sono ridotte anche nei sistemi di modelli, di cui si deve tenere conto per la valutazione. I modelli animali più comuni si basano sui topi, tra le altre ragioni, principalmente a causa delle possibilità di metodologia in costante aumento. Studi in vitro di BMEC murini isolati potrebbero consentire un'analisi approfondita delle loro proprietà e della barriera emato-encefalica in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche. Ulteriori approfondimenti sui complessi meccanismi della BBB forniscono potenzialmente la base per nuove strategie terapeutiche.
Questo protocollo descrive un metodo per isolare le cellule endoteliali microvascolari murine primarie mediante una sequenza di fasi di purificazione fisica e chimica. Vengono discusse considerazioni speciali per la purezza e la coltivazione degli MBMEC, nonché per il controllo di qualità, le potenziali applicazioni e le limitazioni.

Subito dopo l'isolamento, BMECs murine e cellule contaminanti formano conglomerati galleggianti nel mezzo di coltura cellulare (Figura 1A, giorno 0). Il trattamento con pyrumycin porta ad una selezione di BMECs murini quanto esprimono elevati livelli di trasportatori di efflusso quali la P-glicoproteina portando ad una relativa resistenza alle tossine. Cellule contaminanti sono molto più sensibili a pyrumycin citotossicità mediata 19. Durante il processo di selezione pyrumicin, cellule contaminanti entrano morte cellulare per apoptosi o necrosi, mentre MBMECs cominciano ad allegare al collagene IV / fibronectina rivestite con piastre di coltura cellulare (Figura 1A, il giorno 1 e il giorno 2). Fino al giorno 5, i MBMECs proliferano ad una densità di circa. 80-90%. Sono caratterizzati dal tipico aspetto a forma di fuso. Alla confluenza, formano un monostrato di contatto inibito cellule non sovrapposte ravvicinate, allineati longitudinalmente e (Figura 1A, il giorno 5). Daselezione pyrumicin, un'elevata purezza di fino al 99% MBMEC è raggiunto come dimostra il marker endoteliale CD31 (PECAM1; Figura 1B). I MBMECs formano monostrati ben sigillati tra loro da proteine ​​di giunzione stretti. Dopo 7 - 8 giorni di coltura, gli strati di cellule endoteliali accumulano valori stabili per resistenza elettrica (raggiungendo valori tipici tra 20 - 30 che Ω x cm 2). E capacità (Figura 1C) A questo punto test funzionali quali cellulo esperimenti di migrazione 3, 20,21 e permeabilità test, ad esempio con il blu di Evans o destrano, devono essere eseguiti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" width="500"> Figura 1. morfologiche e funzionali di Murine BMECs. (A) andamento temporale Rappresentante di BMECs coltivate visti di trasmissione della luce microSCOPY più di 5 giorni. Barra di scala vale per tutte le immagini. (B) colorazione immunofluorescenza per il marcatore delle cellule endoteliali CD31 al giorno 5. CD31 (verde) e DAPI (blu). (C) Le cellule sono state precultured per 5 giorni e poi trasferiti ad un sistema automatizzato per la analisi delle proprietà biofisiche (resistenza e capacità). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52204/52204fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC) sono interconnesse da specifiche proteine giunzionali che formano una barriera altamente regolata che separa il sangue e il sistema nervoso centrale (SNC), la cosiddetta barriera emato-encefalica (BBB). L'isolamento delle cellule endoteliali microvascolari primarie del cervello murino, come discusso in questo protocollo, consente studi dettagliati in vitro della BEE.

Isolamento di cellule primarie murini cervello microvascolare endoteliali

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere cellule endoteliali microvascolari primarie murine e cerebrali o MBX. Ciò si ottiene isolando prima e poi omogeneizzando il proencefalo libero dalle meningi di topi adulti. Nella seconda fase, l'omogeneizzato tissutale viene ulteriormente elaborato mediante digestione enzimatica.Quindi, nella fase finale, le cellule endoteliali vengono separate per densità, gradiente, centrifugazione e piastrate per la coltura cellulare. In definitiva, la colorazione immunofluorescente delle cellule isolate per l'espressione di CD 31 può essere utilizzata per confermare la purezza della coltura di mech MB. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di linee cellulari endoteliali cerebrali immortalizzate, è che i risultati ottenuti con le cellule primarie forniscono una migliore trasferibilità alla situazione in vivo.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della ricerca della barriera ematoencefalica, ad esempio, quali percorsi sono coinvolti nel pensiero delle cellule immunitarie. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la terapia di malattie neurovascolari, infettive, infiammatorie o degenerative del sistema nervoso centrale. Poiché la disfunzione della barriera emato-encefalica è coinvolta in modo critico nell'agente patogeno di tali malattie.Questa procedura sarà dimostrata da Lisa Eeping, una studentessa laureata del nostro laboratorio. Dopo aver isolato il cervello da 18 a 12 settimane di C 57 BL, sei topi conservano i tessuti in cinque millilitri di PBS sterile. Quindi, usa una pinza per rimuovere il tronco encefalico, il cervelletto e il talamo, quindi arrotola con cura ogni cervello su carta assorbente sterile.Per rimuovere le meningi, mettere il cervello in una provetta da 50 millilitri e aggiungere 13,5 millilitri di DM em, quindi tritare il tessuto prima con una pipetta da 25 millilitri e poi con una pipetta da 10 millilitri fino a quando il terreno diventa lattiginoso. Digerire il tessuto in collagenasi e DNA a 37 gradi Celsius su uno shaker orbitale a 180 giri/min. Dopo un'ora, aggiungere 10 millilitri di DM em alla sospensione tissutale e centrifugare le cellule per 10 minuti a 1000 Gs e quattro gradi Celsius.Scartare il surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet sciolto, quindi utilizzare una pipetta da 25 millilitri per triare il pellet circa 25 volte in 25 millilitri di B-S-A-D-M-E-M. Dopo aver fatto girare nuovamente le cellule, utilizzare una pipetta di vetro rotta di grande diametro per rimuovere lo strato di mielina superiore lattiginosa. Quindi rimuovere lo strato BSA con un normale PE o una pipetta.Risospendere il pellet in nove millilitri di DM em, quindi aggiungere un millilitro di spazio del disco della collagenasi e 0,1 millilitri di DNA alle cellule. Digerire la soluzione a 37 gradi Celsius sull'agitatore orbitale a 180 giri/min. Durante la digestione impostare un gradiente di densità perca in un'ultracentrifuga.Dopo un'ora, aggiungere 10 millilitri di DM E em alla sospensione cellulare digerita per fermare la reazione, quindi far girare le cellule e risospendere il pellet In due millilitri di DM E em, aggiungere la sospensione cellulare con cura sopra il gradiente per chiamata, quindi separare le cellule mediante centrifugazione. Dopo la separazione, le cellule possono essere visibili come un'interfaccia torbida. Immergere con cautela l'ago sterile nell'interfaccia con un angolo di 30 gradi e raccogliere circa 12 millilitri di soluzione.L'interfaccia spesso non è visibile per ottenere il maggior numero possibile di celle con la minor contaminazione possibile. Una piccola parte dell'interfaccia deve essere aspirata. In aggiunta a ciò, la punta dell'ago sterile deve essere spostata con attenzione e continuamente in ogni parte dell'interfaccia, trasferire le cellule in un nuovo Falcon da 50 millilitri contenente cinque millilitri di DM em, e poi dopo aver fatto girare nuovamente le cellule, reus, sospendere il palato in 0,2 millilitri di terreno cellulare endoteliale per un centimetro quadrato di superficie di una piastra di coltura cellulare.Quindi, rimuovere la soluzione di rivestimento dalle piastre di coltura cellulare rivestite e risciacquare ogni pozzetto con PBS sterile in due fasi di lavaggio consecutive. Infine, mantenere le colture cellulari in terreno cellulare endoteliale a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica in un incubatore sterile. Cambiare il terreno ogni due o tre giorni subito dopo l'isolamento.Il midollo osseo murino e le cellule contaminanti formano conglomerati che possono essere osservati fluttuare nella coltura cellulare. Il trattamento medio con micina porta alla selezione di BMAX murino poiché le cellule contaminanti sono molto più suscettibili alla citotossicità mediata da pura micina e il BM E non interessato inizia ad attaccarsi al collagene quattro piastre di coltura cellulare rivestite di fibronectina fino al quinto giorno, il BME prolifera a una densità di circa l'80-90% formando un monostrato di strettamente impacchettato, cellule inibite dal contatto allineate longitudinalmente e non sovrapposte caratterizzate dal loro tipico aspetto a forma di fuso mediante puram Selezione della micina, Si raggiunge un'elevata purezza fino al 99% di BMAX murina come confermato dal marcatore di cellule endoteliali CD 31. I BM E formano monostrati strettamente sigillati interconnessi da proteine a giunzione stretta.Dopo sette-otto giorni di coltura, questi strati cellulari accumulano valori stabili di resistenza elettrica tra 20 e 30 ohm per centimetro quadrato e una capacità abbondante in questo momento, è possibile eseguire saggi funzionali come esperimenti di migrazione cellulare o test di permeabilità con blu di Evans o destrano Una volta padroneggiati. Questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque ore dopo questa procedura. Altri metodi come saggi di migrazione, esperimenti di permeabilità o misurazioni elettrofisiologiche possono essere eseguiti per affrontare queste domande visionarie, ad esempio, come viene alterato il traffico di cellule immunitarie in determinate condizioni sperimentali?O in che modo i canali del ferro sono coinvolti nella regolazione della barriera ematoencefalica? Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'urina, le cellule endoteliali microvascolari cerebrali mediante omogeneizzazione meccanica, enzimatica, digestione e centrifugazione in gradiente di densità.

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Generazione di un immortalato Murine Linea microvascolare Brain Cell endoteliali come<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Cervello Modello barriera

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