FIM Imaging e FIMtrack: due nuovi strumenti che ad alta produttività e costo effettivo Locomotion Analysis
24 dicembre 2014
FIM è un nuovo sistema, il costo di imaging efficace progettato per monitorare piccoli oggetti in movimento, quali C. elegans, planaria o Drosophila larve. Il programma FIMTrack di accompagnamento è stato progettato per fornire analisi dei dati veloce ed efficiente. Insieme, questi strumenti permettono analisi high-throughput di tratti comportamentali.
L'obiettivo generale della seguente metodologia è quello di visualizzare e quantificare la locomozione delle larve di Drosophila Melan Gaster, consentendo uno screening ad alta produttività in condizioni di movimento libero. Ciò si ottiene creando una superficie di tracciamento sulla configurazione FIM e utilizzando la riflessione interna totale frustrata per l'illuminazione indiretta. Larve di diversi genotipi vengono quindi poste sulla superficie e viene registrato il comportamento strisciante in risposta a un gradiente di calore.
I video vengono poi analizzati dalla FIM Track. Il software e i dati ottenuti vengono utilizzati per generare grafici che descrivono le differenze nelle larve e nei modelli di locomozione. I risultati mostrano che le larve sono quantificate in modo preciso, ad alta produttività, flessibile e facile da usare.
La locomozione può essere eseguita sulla base della tecnica di imaging FIM e del programma di traccia FIM associato. Il vantaggio principale di questa tecnica di imaging rispetto ai metodi esistenti, come l'uso della luce incidente o trasmessa, è che sono visibili solo gli animali che toccano la superficie, risultando in un superbo contrasto di sfondo in primo piano senza artefatti inquietanti, sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla biologia della lava oph. Può anche essere applicato per studiare il comportamento di deambulazione, le mosche e la locomozione di altri mono organismi come l'eleganza del mare, le plenarie o persino la crescita delle radici delle piante.
La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per convincere gli altri che una tecnologia complessa è facile da usare. Il primo passo è creare una superficie strisciante umida per il metodo di imaging basato su FITR o fim. Per fare questo bollire, coclea alimentare allo 0,8% in acqua ultrapura deionizzata.
Versare la coclea calda su una lastra di vetro acrilico. Non agitare la coclea dopo l'ebollizione e versare continuamente. Per evitare bolle a questa temperatura, è necessario creare una lastra di due millimetri di spessore.
Utilizzare la soluzione rimanente della coclea per riempire piastre di Petri standard da sei centimetri. Questi saranno utilizzati per selezionare, pulire e abituare le larve prima dell'esperimento. Quindi, tagliare a circa due centimetri dal perimetro della lastra della coclea per ottenere una superficie quadrata liscia per la registrazione.
Trasferire la soletta della coclea nella configurazione FIM subito dopo il raffreddamento. Spingendo delicatamente la coclea oltre il bordo della lastra di vetro acrilico, la coclea dovrebbe scivolare in posizione. A questo punto si è pronti per la preparazione dell'imaging per includere una barriera a coclea avversiva nella superficie strisciante.
Far bollire la coclea alimentare al 2,5% con NACL a tre molari in acqua ultrapura deionizzata. Quindi, taglia una tacca larga due centimetri che circonda il campo visivo nella superficie strisciante precedentemente versata. Quando è pronto, riempire la tacca con una trivella di sale da 0,1 a 0,3 centimetri più alta della superficie di tracciamento.
Quindi, preparare il dispositivo per il gradiente di calore. Il dispositivo è una piastra di alluminio ricoperta da una superficie isolante e perfusa con l'acqua delle pompe ad entrambe le estremità. Per consentire il controllo della temperatura, accendere il dispositivo del gradiente di calore un'ora prima dell'uso e posizionarlo sopra la configurazione per consentirgli di raggiungere la temperatura desiderata.
Questo tempo può essere utilizzato per ulteriori preparativi. Quando è pronta, trasferire la coclea della superficie strisciante con una barriera al sale nella configurazione. Posizionare la piastra del radiatore sopra la coclea e regolare la distanza tra la piastra e la superficie strisciante a due millimetri.
Stabilire un gradiente lineare da 34 gradi Celsius a 18 gradi Celsius regolando la temperatura dei circuiti dell'acqua a un grado Celsius e 45 gradi Celsius, che è appropriato per questa apparecchiatura. Lasciare che la superficie strisciante si equilibri nel gradiente per 20 minuti. Prima di procedere, testare il gradiente di temperatura con un TER per preparare le mosche, recuperarle da un'incubatrice a 25 gradi Celsius e far cadere un po' d'acqua nelle fiale di coltura per guidare il terzo in ritardo nel movimento della larva stellata.
Quindi, raccogli le larve più grandi dalle pareti della fiala usando un piccolo pennello, da due a cinque minuti prima della registrazione, trasferisci abbastanza larve per un video in una capsula di Petri preparata in precedenza. Dopo aver stabilito il gradiente di temperatura, impostare il software di registrazione. Specificate il numero di fotogrammi per video.
Definisci il percorso di salvataggio e configura la registrazione istantanea entro 20 secondi. Dopo aver posizionato le larve sulla superficie strisciante, iniziare a fotografare una delle larve e regolare l'intensità dell'illuminazione per ottenere un buon contrasto. Quando è pronta, sollevare leggermente la piastra del radiatore e posizionare le larve a 34 gradi Celsius, a due centimetri dalla barriera salina.
Abbassa nuovamente la piastra del radiatore e inizia a registrare al buio per non disturbare gli animali. Dopo la registrazione, rimuovere le larve e pulire e idratare la superficie. Per evitare la diffusione di NACL, non toccare la coclea del sale durante il lavoro, mentre la superficie deve essere mantenuta sempre umida, evitare l'umidità eccessiva, che può essere vista come aloni o gocce che circondano le larve.
Nelle registrazioni e nel tracciamento disturbato, lasciare che la superficie della coclea si equilibri per uno o due minuti prima di procedere. Durante questo periodo, salva le immagini raccolte e raccogli nuovi animali. Per prepararti al video successivo, controlla il gradiente di temperatura utilizzando un TER ogni cinque video e regola il dispositivo di temperatura, se necessario.
Per iniziare a tracciare la locomozione, regolate i parametri di tracciamento utilizzando l'opzione di anteprima. Regola il millimetro per pixel in base alla fotocamera e al campo visivo. Successivamente, regola i fotogrammi al secondo in base alle impostazioni della fotocamera, utilizza il feedback fornito nella finestra di anteprima per regolare le soglie di luminosità in modo che tutti gli animali vengano rilevati correttamente.
Successivamente, regola le soglie delle dimensioni dell'area larvale, i singoli animali sono evidenziati da cerchi gialli, le larve che si scontrano sono evidenziate in rosso e l'area di ciascun animale è indicata in blu. Inizia il tracciamento utilizzando il pulsante in basso a destra dopo la sessione di tracciamento, un'immagine con le tracce delle larve e un file CSV contenente le caratteristiche di locomozione e postura calcolate viene memorizzato nella directory delle immagini. Infine, utilizza il modulo di visualizzazione dei risultati FIM per rivedere e regolare manualmente i risultati del tracciamento.
Definire l'orientamento del crawling rispetto al gradiente di calore per valutare i dati in base a questo stimolo. Nella rappresentazione della larva mostrata qui, la testa e la punta della coda sono segnate tra questi punti. Un numero dispari arbitrario di punti della spina dorsale può essere impostato con un raggio.
Inoltre, vengono calcolati il baricentro e l'angolo di flessione del corpo principale. Di seguito sono mostrati i risultati dell'imaging FI e del tracciamento da diverse telecamere. Le immagini a sinistra catturano tre larve che strisciano su un palco di tracciamento di 10 centimetri per 10 centimetri.
La massa, la traiettoria e l'area di una singola larva sono mostrate a destra. La freccia rossa indica il punto temporale dell'immagine ritagliata risultante dall'applicazione. Uno stimolo termico è mostrato qui come traiettorie di diversi colori calcolate tramite la traccia F.
Queste immagini applicative ad alta risoluzione di una terza, seconda e prima larve stellari sono state ottenute con un obiettivo macro. Anche altri organismi come il mare possono essere facilmente ripresi. Una volta padroneggiato, è possibile analizzare circa un centinaio di laboratori all'ora per ogni configurazione di tracciamento.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di registrare sempre nelle stesse condizioni Seguendo questa procedura. Altri metodi come la stimolazione optogenetica o il rilevamento in vivo dell'attività neurale potrebbero essere inclusi nella configurazione. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di quanto possa essere facile analizzare in modo efficiente la locomozione ulare.
Panoramica
Il sistema di imaging FIM è progettato per il tracciamento di piccoli organismi in movimento, come le larve di Drosophila, consentendo un'analisi comportamentale ad alto rendimento. Il programma FIMTrack facilita un'analisi dati efficiente, permettendo ai ricercatori di quantificare in modo efficace i modelli di locomozione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Analisi del Comportamento
- Tecniche di Imaging
Sfondo
- Il sistema FIM utilizza la riflessione totale interna frustrata per l'illuminazione indiretta.
- Fornisce un contrasto superiore visualizzando esclusivamente gli organismi a contatto con la superficie di tracciamento.
- Questo metodo può essere applicato a diversi organismi, inclusi C. elegans e planaria.
- Dimostrazioni visive sono essenziali per mostrare la facilità d'uso del sistema.
Scopo dello studio
- Visualizzare e quantificare la locomozione delle larve di Drosophila.
- Permettere schermature ad alto rendimento in condizioni di movimento libero.
- Analizzare le risposte comportamentali a stimoli ambientali, come gradienti termici.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una superficie umida per il movimento strisciante utilizzando agar di grado alimentare.
- Creazione di un gradiente termico per le condizioni sperimentali.
- Registrazione del movimento delle larve mediante il sistema di imaging FIM.
- Analisi dei video registrati con il software FIMTrack per quantificare i modelli di locomozione.
Risultati principali
- Il sistema FIM consente un monitoraggio preciso della locomozione larvale.
- È possibile effettuare analisi ad alto rendimento con artefatti minimi.
- I dati ottenuti possono rivelare differenze significative nei pattern di locomozione tra diversi genotipi.
- Il metodo è adattabile allo studio di diversi organismi e comportamenti.
Conclusioni
- La tecnica di imaging FIM offre una soluzione economica per l'analisi del comportamento.
- Fornisce chiari vantaggi rispetto ai metodi di imaging tradizionali.
- Il sistema è facile da usare, favorendone l'adozione in ambito di ricerca.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi comportamentale ad alto rendimento di organismi modello supporta la validazione precoce delle target, consentendo una valutazione quantitativa delle risposte fenotipiche a perturbazioni genetiche o ambientali. Il flusso di lavoro basato sull'imaging FIM e su FIMTrack fornisce una piattaforma economica e riproducibile per la fenotipizzazione della locomozione, riducendo la variabilità nei saggi comportamentali e aumentando la potenza statistica nei test di scoperta. Questo approccio migliora la fiducia predittiva nell'identificazione dei composti promettenti, collegando il genotipo a un output comportamentale misurabile in un formato scalabile.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la misurazione quantitativa della locomozione larvale come parametro funzionale dell'attività della rete neuronale.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo immagini ad alto contrasto che minimizzano gli artefatti e migliorano l'affidabilità del rilevamento in condizioni di movimento libero.
- Valore predittivo: Facilita lo screening fenotipico tra diversi genotipi, permettendo una precoce discriminazione delle differenze comportamentali che potrebbero indicare l'interazione con il bersaglio o la modulazione del percorso metabolico.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: Genera output standardizzati in formato CSV contenenti parametri relativi alla locomozione e alla postura, consentendo l'elaborazione automatizzata dei dati e il confronto tra esperimenti.
- Scalabilità: Permette l'analisi di fino a 100 larve all'ora per ogni sistema di tracciamento, supportando campagne di screening a medio rendimento in biologia della scoperta.
- Riutilizzo della piattaforma: L'architettura open-source consente l'adattamento ad altri organismi di piccole dimensioni (ad esempio, C. elegans, planaria) e a stimoli diversi dai gradienti termici, aumentando l'utilità a lungo termine.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Fornisce un sistema rilevante per lo studio di fenotipi neuromotori che possono modellare aspetti di disturbi neurologici, supportando la validazione preclinica.
- De-risking meccanicistico: Permette il calcolo di parametri biomeccanici (ad esempio, centro di massa, angolo di flessione del corpo) per chiarire i legami meccanicistici tra manipolazione genetica e output motorio.
- Avanzamento proporzionato al rischio: Output oggettivi e quantificabili aiutano a prioritizzare bersagli in base alla gravità e alla coerenza del fenotipo comportamentale tra ripetizioni.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il sistema FIM/FIMTrack si integra nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto guida, in cui il fenotipaggio comportamentale informa lo screening dei composti e il successivo approfondimento meccanicistico.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando i modelli di locomozione in risposta a stimoli, consentendo la chiarificazione dei percorsi e la conferma delle target.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili essenziali per la standardizzazione dei saggi e la conferma dei risultati negli screening fenotipici.
- Analisi: I risultati includono parametri di traiettoria, area e flessione che permettono il confronto statistico tra condizioni e genotipi.
- Ricerca traslazionale: Collega i fenotipi comportamentali larvali a meccanismi neurogenici conservati, favorendo l'estrapolazione a modelli più complessi.
- Riutilizzo aziendale: La progettazione modulare e open source consente il deployment tra diversi team e sistemi modello con minima formazione aggiuntiva.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo il rumore del saggio comportamentale e migliorando il rilevamento del segnale.
- Valore operativo: Una preparazione standardizzata delle superfici e parametri di tracciamento migliorano la riproducibilità tra utenti e sedi.
- Valore strategico: Permette decisioni più rapide di tipo go/no-go fornendo dati fenotipici precoci ad alta risoluzione sulla modulazione dell'obiettivo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio attraverso endpoint comportamentali oggettivi e scalabili che riducono l'abbandono in fasi avanzate dovuto alla mancanza di efficacia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in neuroscienze comportamentali ed elaborazione di base delle immagini per ottimizzare i parametri di tracciamento e interpretare le caratteristiche della locomozione.
- Dipende dalla preparazione costante della superficie (concentrazione di agar, controllo dell'umidità) e dalla stabilità del gradiente termico per ottenere risultati affidabili.
- Necessita di un accordo tra diversi gruppi di lavoro sui valori soglia per l'estrazione delle caratteristiche (ad esempio, area delle larve, luminosità) per garantire la comparabilità dei dati.
- L'adattamento ad altri modelli (ad esempio, embrioni di pesce zebra, drosofile adulte) potrebbe richiedere aggiustamenti della superficie e dell'illuminazione.
- Limite pratico: le prestazioni potrebbero diminuire con organismi altamente traslucidi o che non entrano in contatto con la superficie, a meno che i parametri di acquisizione non vengano ottimizzati.
