Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano
18 gennaio 2015
Presentiamo un protocollo per generare colture primarie di cellule stromali esofagee murine e umane con un fenotipo di miofibroblasto. Le cellule in coltura hanno una morfologia a forma di fuso, esprimono α-SMA e vimentina e mancano di marcatori di superficie delle cellule epiteliali, ematopoietiche ed endoteliali. Le cellule stromali caratterizzate possono essere utilizzate negli studi funzionali delle interazioni epitelio-stromale.
L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i miofibroblasti primari dall'esofago di topo e umano. Ciò si ottiene prelevando prima l'intero esofago dal topo neonato donatore con tessuto umano. La mucosa è separata dalla muscolo propria.
Il secondo passo consiste nel tritare il fazzoletto e lavarlo più volte in HBSS. Successivamente, il tessuto viene digerito con collagenasi diss e ulteriormente tritato rilasciando le cellule mesenchimali insieme all'epitelio attaccato. La popolazione cellulare eterogenea viene quindi coltivata in terreni di coltura per miofibroblasti in cui i miofibroblasti aderiscono mentre le cellule epiteliali non sopravvivono e vengono lavate via.
In definitiva, l'immunochimica e la citometria a flusso vengono utilizzate per confermare che le cellule in coltura primaria sono miofibroblasti. A dimostrare le procedure saremo io, Matthew Gargas, un tecnico, e chow new, un postdoc del mio laboratorio, Tori. Dopo l'eutanasia di un topo di 8-12 giorni, fissare il lato dorsale dell'animale e bagnare la superficie ventrale con etanolo al 70%.
Quindi, usando una pinza, afferra e solleva la pelle anteriormente all'apertura uretrale. Taglia lungo la linea mediana ventrale dall'apertura uretrale al mento. Tagliare solo la pelle.
Quindi praticare incisioni dall'apertura uretrale alle ginocchia, formando una Y capovolta.Dopo le incisioni alle ginocchia, praticare incisioni su entrambi i lati della gabbia toracica. Dopo aver completato le incisioni, staccare con cura la pelle e metterla da parte. Ora solleva il peritoneo e taglialo fino al diaframma e alla gabbia toracica.
Tenere le forbici rivolte verso l'alto per evitare danni al contenuto intratoracico e addominale. Quindi sollevare delicatamente il lobo sinistro del fegato per esporre lo stomaco sottostante, la giunzione gastrica esofagea e la porzione addominale dell'esofago utilizzando forbici chirurgiche tagliate lungo la linea mediana dello sterno e della gabbia toracica fino al cingolo cervicale. Di nuovo. Nel fare ciò, tieni le forbici angolate lontano dagli organi sottostanti.
Quindi tirare da parte la gabbia toracica per esporre il contenuto della cavità toracica. Ora rimuovi delicatamente il cuore ed entrambi i lobi dei polmoni. Utilizzare applicatori di cotone per assorbire il sanguinamento secondo necessità.
L'esofago toracico è un tubo stretto e flessibile posteriore alla trachea e anteriore alla vertebra toracica. Nei neonati, trovare la giunzione gastrica esofagea per identificare l'esofago dallo stomaco. Senza mezzi termini, sezionare la vascolarizzazione che circonda l'esofago, compreso il tessuto adiposo e mesenterario, fino all'origine esofagea nella cavità cervicale.
Ora reseca l'intera lunghezza dell'esofago e trasferiscilo in HBSS raffreddato, se lo desideri. Inoltre, rimuovere una parte dello stomaco a scopo di orientamento. Inizia questo protocollo tritando frammenti di mucosa ottenuti da tessuto di topo o umano in HBSS rispettivamente in un tubo micro fuge da 1,7 millilitri o in un tubo da cinque millilitri.
Ora, quando si ottengono cellule stromali esofagee umane, è importante separare la mucosa dalla muscolo propria sottostante mediante dissezione brusca. Ora nel tubo conia ulteriormente il tessuto in pezzi da due a tre millimetri usando le forbici sottili. Dopo che il sedimento del frammento della mucosa esofagea ha decantato lentamente l'HBSS, facendo attenzione a non scartare inavvertitamente il tessuto.
È inoltre possibile utilizzare una pipetta con puntale grande per rimuovere l'HBSS aggiuntivo. Quindi aggiungere l'HBSS fresco. Mescolare il tubo con una leggera agitazione e lasciare che il tessuto si depositi.
Una volta sistemato, decantare nuovamente l'HBSS e ripetere questo lavaggio. Passo otto volte in tutto. Dopo gli otto lavaggi, incubare il tessuto con collagenasi 11 e incubare il tessuto murino fino a 25 minuti su un agitatore a dondolo impostato a bassa velocità e a temperatura ambiente.
Nelle stesse condizioni, incubare il tessuto umano per sei ore. Dopo la digestione, mescolare ulteriormente il fazzoletto con le forbici sottili, quindi centrifugare il fazzoletto a 200 g per 10 minuti. Scartare il surnatante e travasare il tessuto pellettato in una provetta pulita da 1,7 millilitri.
Quindi, sotto la cappa di coltura tissutale, lavare le cellule cinque volte in DMEM con sorbitolo al 2% per eliminare le cellule non vitali e altri detriti. Per ogni lavaggio, lasciare che le celle si depositino per gravità e decantare la soluzione di lavaggio. Dopo i lavaggi, seminare le cellule in tre pozzetti da sei.
Piastra a pozzetto e coltivali in DMEM integrato filtrato sottovuoto. Il tessuto umano può richiedere più pozzetti o piastre, a seconda delle dimensioni della coltura del campione, le cellule, fino a quando i pozzetti non sono confluenti all'80%. Quindi passare prima le cellule di aderenza in fiasche T 25, utilizzare lo 0,05% di tripsina in EDTA per rimuovere le cellule.
Quindi aggiungi i media per neutralizzare la reazione. Raccogliere le cellule rimosse in una provetta da centrifuga. Quindi centrifugare le cellule a 400 G per raccoglierle al microscopio.
Osservare la morfologia a forma di fuso delle cellule aderenti per distinguere le cellule stromali coltivate dalle cellule muscolari colorarle immunologicamente per Desmond. Utilizzando un protocollo standard, è possibile piastrare brevemente 15.000 cellule in vetrini a quattro pozzetti e farle crescere in terreno di coltura per miofibroblasti per 24 ore. Il giorno successivo, fissare le cellule e poi, prima di applicare l'anticorpo primario, bloccare le cellule fissate con il 5% di siero di capra in PBS, sia gli anticorpi primari che quelli secondari devono essere diluiti in siero di capra al 5%.
Incubare con anticorpo primario a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi sciacquare le celle tre volte con PBS dopo i lavaggi. Aggiungere gli anticorpi secondari e incubare le cellule per un'ora.
A temperatura ambiente, utilizzare tre lavaggi in PBS per rimuovere gli anticorpi secondari. Quindi le cellule colorate possono essere analizzate dopo i lavaggi. Applicare DPI con il mezzo di montaggio e il vetrino coprioggetti per stabilire la purezza delle cellule esofagee.
Controllali per i marcatori della superficie delle cellule ematopoietiche ed endoteliali. Utilizzo della citometria a flusso. Coltiva un numero sufficiente di fiasche di coltura fino a quando non sono pronte per essere raccolte.
Quindi staccare le cellule stromali esofagee di topo in coltura utilizzando una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica a 37 gradi Celsius per 10 minuti. A seguito della loro raccolta. Lavare due volte le celle con il buffer fax e contare le celle.
Ora utilizzando una procedura di colorazione standard, colorare con CD 45 per identificare le cellule immunitarie e colorare con CD 31 per identificare le cellule endoteliali, quindi far passare le cellule attraverso il citometro a flusso. Le cellule stromali esofagee sono state isolate mediante digestione meccanica ed enzimatica e coltivate in piastre a sei pozzetti entro poche ore dalla piastra. Le celle erano in una sospensione mista che aderisceva liberamente alla piastra.
Nelle successive 24 ore, le cellule a forma di fuso sono spuntate dalla sospensione cellulare e hanno aderito saldamente al fondo della piastra. Queste celle hanno coperto l'intero pozzetto entro cinque giorni e sono state attraversate mantenendo con successo la loro morfologia per almeno 15 passaggi visti qui, le celle sono a bassa densità. Queste sono le cellule a forma di fuso vicino alla cofluenza, colorazione immunologica di colture primarie di cellule stromali esofagee.
I vetrini coltivati in camera hanno dimostrato un'abbondante espressione dei marcatori citoscheletrici dei miofibroblasti. La purezza delle colture di alfa, SMA e mentone è stata valutata mediante citometria a flusso. La dispersione diretta e laterale è stata stabilita per le cellule stromali esofagee murn primarie, seguita dal gating e dall'analisi delle cellule vive per le proteine della superficie cellulare.
Le cellule stromali esofagee primarie murn mancavano di espressione di CD 45 ematopoietica e mancavano di espressione dei marcatori di superficie cellulare CD-31 endoteliale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire colture primarie di miofibroblasti da topo ed esofago umano. Sì.
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Panoramica
Questo protocollo delinea l'isolamento di miofiobroblasti primari dall'esofago murino e umano. Le cellule coltivate mostrano un fenotipo di miofiobroblasti, caratterizzato da una morfologia a forma di fuso e l'espressione di marcatori specifici.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Ingegneria tissutale
Sfondo
- I miofiobroblasti svolgono un ruolo cruciale nella riparazione dei tessuti e nella fibrosi.
- Comprendere le interazioni epitelio-stroma è essenziale per vari studi biologici.
- Le colture primarie forniscono un modello rilevante per studiare queste interazioni.
- L'isolamento dei miofiobroblasti può migliorare la ricerca sulle malattie esofagee.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'isolamento di miofiobroblasti primari.
- Caratterizzare le cellule isolate per studi funzionali.
- Facilitare la ricerca sulle interazioni epitelio-stroma nell'esofago.
Metodi utilizzati
- Prelievo dell'esofago da topi neonati donatori.
- Separazione della mucosa dalla propria muscolare.
- Tritatura e lavaggio del tessuto in HBSS.
- Digezione del tessuto con collagenasi per rilasciare le cellule mesenchimali.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di miofiobroblasti con morfologia a forma di fuso.
- L'espressione di α-SMA e vimentina ha confermato il fenotipo di miofiobroblasto.
- Assenza di marcatori epiteliali, ematopoietici ed endoteliali nelle cellule coltivate.
- Le cellule sono adatte per studi funzionali delle interazioni epitelio-stroma.
Conclusioni
- Il protocollo isola efficacemente i miofiobroblasti primari dal tessuto esofageo.
- Le cellule caratterizzate possono essere utilizzate in ulteriori ricerche.
- Questo metodo contribuisce alla comprensione del ruolo dei miofiobroblasti nella biologia esofagea.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and characterization of primary esophageal myofibroblasts enables disease-relevant modeling of stromal-epithelial interactions, a critical inflection point for target validation in fibrosis and tissue remodeling research. This protocol supports predictive confidence in early discovery by providing primary cell systems that closely reflect in vivo biology, reducing mechanistic ambiguity compared to immortalized lines. Consistent generation of pure stromal cultures facilitates cross-study and cross-condition comparisons, enhancing translational continuity across the R&D pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stromal cell contributions to esophageal disease mechanisms.
- Supports functional target validation by providing primary, non-hematopoietic, non-endothelial stromal cells.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct study of epithelial-stromal interactions.
- Improves predictive confidence for pathway and target selection in fibrotic disease research.
Screening & Assay Development
- Provides validated primary cell systems for downstream functional assays.
- Ensures assay reproducibility and standardization by confirming cell purity via flow cytometry and immunostaining.
- Enables quantitative assessment of stromal cell responses to candidate compounds.
- Supports development of disease-relevant screening platforms for esophageal disorders.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with in vivo disease states by using primary human and murine cells.
- Facilitates translational biomarker discovery through comparative studies across clinical and experimental conditions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing physiologically relevant data for preclinical validation.
- Enables functional studies of stromal-epithelial crosstalk relevant to fibrosis and tissue repair.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, providing a foundation for target validation, assay development, and translational studies in esophageal disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating pure stromal populations for mechanistic studies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation using primary myofibroblast cultures.
- Analytics: Enables robust measurement of cell marker expression and purity via flow cytometry and immunostaining.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by modeling disease-relevant stromal-epithelial interactions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for isolating primary stromal cells from diverse clinical and experimental sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes primary cell isolation and characterization for reproducible results across studies.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing physiologically relevant data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on disease-relevant functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, primary cell culture, and flow cytometry analysis.
- Needs access to specialized instrumentation for cell sorting and immunostaining.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of primary cultures.
- Adaptation may be necessary for different tissue sources or disease contexts.
- Primary culture variability across donors must be managed for consistent experimental outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:22
Isolating Murine Esophagi
3:51
Isolating Murine and Human Esophageal Stromal Cells
6:58
Characterizing Murine and Human Esophageal Stromal Cells
9:23
Results: Morphology, Cytochemistry and Purity of Cultured Esophageal Stromal Cells
10:56
Conclusion
