Name: Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Impara a isolare miofibroblasti primari da esofago murino e umano. Questo metodo utilizza digestione con collagenasi e coltura selettiva per studiare le interazioni epitelio-stromali in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo per eseguire esperimenti sugli animali, le motivazioni e gli obiettivi della ricerca, sono stati presentati e approvati dalla University of Southern California Istituzionale Animal Care and Use Committee. Il protocollo per la creazione di colture primarie da campioni esofagectomia umani de-identificati è stato approvato dalla University of Southern California Institutional Review Board. 1. Ottenere Mouse o Esofago umano <ol><li> Ottenere mouse Esofago: <ol><li> Euthanize il 8-12 giorno vecchio mouse con 2% isoflurano overdose inalanti seguita da dislocazione cervicale. </li><li> Pin dell&#39;animale con la pancia rivolta verso l&#39;alto e bagnare la superficie ventrale con il 70% di etanolo. Con pinze, afferrare e sollevare la pelle anteriori all&#39;apertura uretrale con una pinza. Usare le forbici chirurgiche standard, dritto per tagliare lungo la linea mediana ventrale dall&#39;apertura uretrale al mento. Fare attenzione a tagliare solo la pelle. &lt;/ Li&gt; <li> Fare un&#39;incisione dall&#39;apertura verso il basso per il ginocchio su entrambi i lati di un animale uretrale, formando una testa in giù &quot;Y&quot;. Fare un&#39;altra incisione su entrambi i lati di un animale lungo la gabbia toracica. </li><li> Sbucciare con cura la pelle su entrambi i lati, al largo del peritoneo sottostante e la gabbia toracica, e porre ai lati. Esaminate la gabbia toracica sovrastante la cavità toracica e il peritoneo sovrastante la cavità addominale. <ol><li> Sollevare il peritoneo con una pinza e tagliare fino alla gabbia toracica e diaframma, che punta verso l&#39;alto le forbici per evitare danni al contenuto addominale. Sollevare delicatamente il lobo sinistro del fegato, esporre lo stomaco sottostante, la giunzione esofago-gastrica e la porzione addominale dell&#39;esofago. </li></ol></li><li> Usare le forbici chirurgiche in autoclave per tagliare lo sterno e costole lungo la linea mediana fino alla cintura cervicale. Forbici Point verso l&#39;alto per evitare di danneggiare il contenuto del torace. Esporre completamente il contenuto delcavità toracica tirando la gabbia toracica ai lati. </li><li> Rimuovere delicatamente il cuore e entrambi i lobi dei polmoni. Assorbire il sangue in eccesso con Q-punte. L&#39;esofago toracico è una stretta, tubo mentire posteriore flessibile alla trachea e anteriore al vertebra toracica. NOTA: L&#39;esofago può essere difficile da individuare nei neonati murini. La localizzazione della giunzione esofago-gastrica rende identificazione esofageo semplice. </li><li> Seguire attentamente l&#39;esofago dallo stomaco, sezionando il circostante vascolare, grasso e mesentere tutta la strada fino all&#39;origine esofagea nella cavità cervicale. Forbici chirurgiche con punta smussata funzionano meglio per questo scopo. </li><li> Resecare l&#39;intera lunghezza dell&#39;esofago e posto in soluzione salina bilanciata Hanks &#39;(HBSS) per l&#39;ulteriore elaborazione descritto di seguito. Rimuovere una porzione dello stomaco per orientazione se desiderato. NOTA: A causa delle dimensioni piccole del tessuto, la separazione di muscolare propria del muscoloè mucosa non è realizzabile in murino neonato esofago e l&#39;intero esofago è sottoposto al trattamento descritto di seguito. </li></ol></li><li> Ottenere Esofago umano: <ol><li> Lavare i campioni di resezione esofagea (in genere 5 cm o meno) con HBSS e rimuovere qualsiasi tessuto connettivo, il grasso, o vascolare allegato. </li><li> Resecare una porzione del campione e porre in formalina per futuro esame istologico se desiderato. </li><li> Separare i restanti mucosa dal sottostante muscolare propria da dissezione tagliente. </li><li> Tagliare mucosa in frammenti sub centimetri e soggetti al protocollo descritto di seguito. NOTA: resezioni esofago umani può essere conservato in PBS per un massimo di 6 ore prima del trattamento descritto di seguito. Fonte di esemplari esofagectomia detterà le dimensioni del campione e sarà dipendente da laboratorio. </li></ol></li></ol> 2. Isolare murini ed umani esofageo stromali Cells <ol><li> Isolare cellule stromali esofagee from murino e tessuti umani da una combinazione di digestione enzimatica e meccanica. <ol><li> Meccanicamente digerire sminuzzando il tessuto con le forbici e molteplici lavaggi con HBSS. Enzimaticamente digerire incubando il tessuto con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi per 25 min (tessuto murino) o fino a 6 ore (tessuti umani). Assicurarsi che gli strumenti utilizzati per la macinazione sono stati autoclavato e sterilizzato. NOTA: collagenasi sono enzimi che degradano il collagene, una proteina della matrice extracellulare responsabile per lo svolgimento di tessuti animali insieme. Collagenase XI ha un&#39;elevata attività collagenasi e ha visto il successo in questo protocollo isolamento. Dispasi è un enzima batterico con lieve attività proteolitica dissociazione che conserva l&#39;attività membrana cellulare ed è utilizzato in combinazione con collagenasi come un enzima secondario. </li><li> Mettere i frammenti della mucosa ottenuti da mouse o tessuti umani in 1,7 ml di micro-centrifuga o 5 ml provette contenenti rispettivamente, HBSS. Tessuto Mince ulteriormentein 2-3 pezzi mm con le forbici con una larghezza punta aperta che si adatta in rispettive provette. Lasciare tempo sufficiente per consentire frammenti mucosa esofagea a sedimentare sul fondo della provetta. </li><li> Lentamente decantare HBSS, facendo attenzione a non eliminare inavvertitamente il tessuto. Sostituire con fresco HBSS seguito da un leggero scuotimento. In alternativa, rimuovere HBSS con una pipetta 1 ml. </li><li> Lavare il tessuto in questo modo un totale di 8 volte con agitando delicatamente tra lavaggi permettendo tempo per frammenti esofagee a sedimentare tra ogni lavaggio. NOTA: il tessuto umano richiederà più tritare che il tessuto del mouse neonato. </li></ol></li><li> Incubare tessuto murino con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi per 25 minuti su un agitatore dondolo impostato a velocità ridotta a temperatura ambiente. <ol><li> Incubare tessuto umano con 300 U / ml di collagenasi XI e 0,1 mg / ml dispasi fino a 6 ore, su un agitatore dondolo impostato a velocità ridotta a temperatura ambiente. NOTA: la disponibilità di esopha umanaGus è variabile. Mucosa esofagea umana incubate con enzimi per un massimo di 6 risultati h in successo generazione di colture primarie. </li></ol></li><li> Dopo la digestione enzimatica, tritare il tessuto ulteriormente con le forbici e centrifugare a 200 xg per 10 min. </li><li> Scartare il surnatante. Trasferire il pellet, costituito da una sospensione cellulare mista in una provetta 5 ml e lavare 5 volte a Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) addizionato con 2% sorbitolo di eliminare le cellule non vitali e detriti. </li><li> Cellule seme in 6 pozzetti e la cultura in DMEM con siero fetale bovino al 10% (FB), 10 mg / ml di insulina, 10 mcg / ml transferrina, 10 mg / ml gentamicina, e 2 ng / ml il fattore di crescita epidermico (EGF) . Filtro sottovuoto (0,22 micron) tutti i componenti ad eccezione del FEG, che possono essere aggiunti dopo la filtrazione. Distribuire cellule ottenute da campioni di resezione umani tra più 6 pozzetti, a seconda delle dimensioni di resezione. </li><li> Una volta che i pozzi sono 80% confluenti, passaggio cellule aderenti a T25 noi Borraccieing 0,05% tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA). Neutralizzare con i media e far girare a 400 x g. <ol><li> Per un passaggio 6 e ad un pallone T25, cellule di passaggio in un rapporto 1: 1. Fiasche T25 Confluent possono essere diversi passaggi in un rapporto 1: 3: 2 o 1. Per passare da un pallone in un pallone T25 T75, utilizzare un rapporto 1: 1. Cambia i media ogni 2-3 giorni, indipendentemente della nave. </li><li> Crescere le cellule a 37 ° C in un umidificata al 5% CO 2 incubatore e la cultura nei media miofibroblasti sopra descritti. NOTA: le cellule epiteliali non sopravvivono in queste condizioni di coltura o di passaggio. Le cellule utilizzate per la caratterizzazione e negli studi descritti di seguito sono tra i passaggi 5 e 15. </li><li> Cryo-conservare le cellule in N liquido 2 aggiungendo 10% dimetilsolfossido ai media miofibroblasti. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzare murini ed umani esofageo stromali Cells <ol><li> Esaminate la morfologia delle cellule con un microscopio invertito. Osservare il fusiformemorfologia delle cellule aderenti (Figura 1). </li><li> Caratterizzare cellule in coltura per la valutazione dei seguenti marcatori del citoscheletro: α-SMA, vimentina, desmina, e citocheratina. Cellule stromali con fenotipo miofibroblasti simile esprimono marcatori miofibroblasti citoscheletro α-SMA e vimentina (Figura 2). <ol><li> Per distinguere ulteriormente cellule stromali coltivate da cellule muscolari, immunostain per desmina. Per eseguire immunoistochimica su cellule in coltura, piatto 1,5 x 10 4 cellule diapositive da camera a 4 così e crescere in mezzi miofibroblasti per 24 ore. Cellule stromali con fenotipo miofibroblasti simile avranno espressione desmin debole o assente. Cellule stromali mancano espressione del marcatore epiteliale pan-citocheratina (dati non mostrati). NOTA: La valutazione di culture include la valutazione dei marcatori del citoscheletro mediante immunocitochimica e superficie cellulare marcatori di citometria a flusso. Immunocitochimica viene utilizzato come metodo primario di caratterizzazione come exProfilo pressione di proteine ​​del citoscheletro è unico per la fibroblasti, miofibroblasti e cellule muscolari. Stabilisce citometria a flusso cultura purezza valutando l&#39;espressione di superficie cellulare epiteliale, endoteliale, e cellule ematopoietiche marcatori. CD90 è utile come un metodo aggiuntivo di identificare cellule stromali umane si esprime su entrambi i fibroblasti umani e miofibroblasti. CD90 non è utile per la caratterizzazione di cellule stromali murine come anche espresso dalle cellule T murine. </li></ol></li><li> Dopo cellule raggiungono il 60% di confluenza, risciacquare diapositive con tampone fosfato salino (PBS) e fissare con metanolo. Incubare le cellule in metanolo per 10 min a -20 ° C, quindi memorizzare in PBS a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Seguire protocollo immunostaining standard. </li><li> Brevemente, prima di applicare l&#39;anticorpo primario, bloccare le cellule fissate con 5% goatserum in PBS. Diluire gli anticorpi primari e secondari nel siero di capra 5% pure. <ol><li> Per il rilevamento di α-SMA e vimentina, utilizzare ilseguenti anticorpi e concentrazioni: mouse mAB di α-SMA a 1: 250 diluizione e coniglio pAB a vimentin a 1: 500 di diluizione. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo primario a temperatura ambiente per una notte a 4 ° C, lavare 3 volte con PBS e aggiungere anticorpi secondari Rodamina capra coniugato anti-topo a una diluizione di 1: 200 e Cy2 capra coniugato anti- coniglio ad una diluizione di 1: 1000 per 1 hr a temperatura ambiente. </li><li> Nuclei di contrasto con 4 &#39;, 6-Diamidino-2Phenylindole (DAPI) ad una concentrazione di 1 mg / ml per 1 min e poi lavare con PBS. Analizzare vetrini con un microscopio invertito. </li></ol></li><li> Stabilire purezza delle culture esame delle cellule esofagee murine e umane per ematopoietiche (CD45) e endoteliale (CD31) marcatori di superficie cellulare mediante citometria di flusso (Figura 3). Caratterizzare cellule umane ulteriormente espressione del cellule stromali marcatore di superficie CD90. NOTA: CD90 non può essere utilizzato per identificare le cellule stromali murine come murine T cells esprimono CD90. <ol><li> Staccare coltivate cellule stromali del mouse esofageo dalle beute di coltura mediante trattamento con cellule non-enzimatica dissociazione soluzione a 37 ° C per 10 minuti, lavate con tampone FACS due volte, contate e colorati con FITC-CD45 e CD31-APC con relativi controlli isotipici, secondo alle procedure standard di colorazione. </li><li> Raccogliere cellule utilizzando FACS Calibur e analizzare i dati con il software FlowJo. Prima di cellule colorazione, ottimizzare gli anticorpi e titolare concentrazioni con controlli isotipici, normale milza del mouse, e le cellule del midollo osseo. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Stappenbeck, T. S., Miyoshi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+stromal+stem+cells+in+tissue+regeneration+and+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The role of stromal stem cells in tissue regeneration and wound repair.</a> Science. 324 (5935), 1666-1669 (2009).</li>
<li>Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+of+the+intestinal+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria.</a> Annu Rev Physiol. 73, 213-237 (2011).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Helper+2+Cytokines%2C+Transforming+Growth+Factor+beta1%2C+and+Eosinophil+Products+Induce+Fibrogenesis+and+Alter+Muscle+Motility+in+Patients+With+Eosinophilic+Esophagitis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">T-Helper 2 Cytokines, Transforming Growth Factor beta1, and Eosinophil Products Induce Fibrogenesis and Alter Muscle Motility in Patients With Eosinophilic Esophagitis.</a> Gastroenterology. 146 (5), 1266-1277 (2014).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+cells+important+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Paracrine cells important in health and disease.</a> The American Journal of Physiology. 277 (1 Pt. 1), C1-9 (1999).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+subepithelial+myofibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Intestinal subepithelial myofibroblasts.</a> The American Journal of Physiology. 277 (2 Pt. 1), C183-201 (1999).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cells+participate+in+the+murine+esophageal+mucosal+injury+response%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stromal cells participate in the murine esophageal mucosal injury response.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 304 (7), 662-672 (2013).</li>
<li>Shaker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphin+deletion+protects+mice+from+inflammation-induced+colon+carcinogenesis+and+alters+stem+cell+niche+myofibroblast+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Epimorphin deletion protects mice from inflammation-induced colon carcinogenesis and alters stem cell niche myofibroblast secretion.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (6), 2081-2093 (2010).</li>
<li>Kalabis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+and+human+esophageal+epithelial+cells+in+3D+organotypic+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture.</a> Nature Protocols. 7 (2), 235-246 (2012).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
<li>Rieder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastroesophageal+reflux+disease-associated+esophagitis+induces+endogenous+cytokine+production+leading+to+motor+abnormalities%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gastroesophageal reflux disease-associated esophagitis induces endogenous cytokine production leading to motor abnormalities.</a> Gastroenterology. 132 (1), 154-165 (2007).</li>
</ol>

Questo lavoro è supportato da NIH / NCI K08CA153036-01A1 (AS), AGA-General Mills Campana Institute of Health e Nutrition Research Scholar Award in Gut Fisiologia e la salute (AS) e Wright Foundation Pilot Award (AS).

Le tecniche per la generazione di colture primarie sono generalmente simile usando il tessuto murino o umano con tritare e digestione volte adattati per dimensioni del tessuto. La nostra esperienza con il tessuto murino suggerisce che con i metodi sopra descritti costantemente comporta successo creazione di colture primarie. Passaggi critici nel protocollo comprendono la sterilizzazione di attrezzature chirurgiche e seguendo le tecniche sterili standard di coltura di tessuti. L&#39;età dei topi è anche un passaggio crit...

Interazioni epiteliali-stromale sono coinvolti nella regolazione di una varietà di funzioni del tratto gastrointestinale, tra cui la rigenerazione della mucosa, la riparazione, la fibrosi e la carcinogenesi 1,2. Queste interazioni sono state meglio studiate nel piccolo intestino e colon e possono svolgere un ruolo simile in alterazioni della mucosa esofagea 3. Una sottopopolazione di cellule stromali miofibroblasti intestinali e del colon chiamati è stata dimostrata a partecipare a mediare lesioni dei tessuti, l&#39;infiammazione e la riparazione di 4,5. Nel tratto GI distale, queste cellule fusiformi sono adiacenti alla membrana basale all&#39;interfaccia tra l&#39;epitelio e lamina propria e sono definiti come α-SMA e vimentina positivo, pan-citocheratina negative, e debolmente positivo o negativo desmina 5. Lo stroma esofagea non è stato rigorosamente caratterizzato a livello cellulare o molecolare. Il nostro lavoro in esofago murino ha demonstrated α-SMA cellule e vimentina nello stroma esofageo, di tanto in tanto soggiacenti alla epitelio squamoso 6. Interazioni epiteliali-stromale sono stati implicati in alterazioni della mucosa esofagea quali gastro-esofageo danno mediato 6 e esofagite eosinofila 3. Stenosi fibrotiche sono anche una complicanza nota di cellule stromali e lesioni esofagee sono stati implicati nella patogenesi della fibrosi gastrointestinale. L&#39;isolamento di queste cellule aiuterà compiere gli studi necessari per indagare vie di segnalazione squilibrati. Questa presentazione fornisce le tecniche necessarie per stabilire colture primarie di α-SMA positive, miofibroblasti positivi vimentina tale che le lacune esistenti nella conoscenza per quanto riguarda le vie di segnalazione che mediano queste interazioni possono essere affrontati. La tecnica descritta è stata utilizzata con successo dagli autori per stabilire miofibroblasti primari murini colon 7 e further adattato per l&#39;istituzione di murine 6 e cellule stromali esofagee miofibroblasti come umani. Qui descriviamo le condizioni necessarie per realizzare e caratterizzare queste culture stabilite dal mouse o esofago umano prima dell&#39;uso in studi funzionali futuri. Le culture possono essere coltivate e utilizzate fino a 15 passaggi. Isolamento e la creazione di colture primarie tramite le modalità descritte di seguito genera cellule stromali con fenotipo miofibroblasti; α-SMA, vimentina positivo, e debolmente positivo o negativo per la desmina, e citocheratina negativo. Questo fenotipo è distinto dal fenotipo del fibroblasto esofageo che è prevalentemente vimentina positivo, α-SMA negative 3 o α-SMA positive, vimentina fenotipo negativo della muscolaris mucosae 6.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenti per colture tissutali</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9407</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F42442</td><td></td></tr><tr><td>Transferrina</td><td>Roche</td><td>10-652-202-001</td><td></td></tr><tr><td>tripsina/EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita epidermico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Reagenti per l'immunocolorazione del</td></tr><tr><td>siero di capra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>MAB di topo a &alpha;-SMA&nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab7817</td><td></td></tr><tr><td>Coniglio pAB a vimentina</td><td>abcam</td><td>ab45939</td><td></td></tr><tr><td>Cy2 coniugato Capra anti Coniglio</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-225-144</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td></td></tr><tr><td>CD31 coniugato a eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>CD90 coniugato a APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0909-41</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V e 7AAD</td><td>BD Pharmigen</td><td>559763</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Fc per topo per CD16/CD32</td><td>BD Pharmigen</td><td>2136662</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Attrezzatura</td></tr><tr><td>Provetta da 5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Motic</td><td>AE31</td><td></td></tr><tr><td>Armadio e incubatori di biosicurezza</td><td>Nuaire</td><td></td><td><a href="http://www.nuaire.com/products/" target="_blank">http://www.nuaire.com/products/</a></td></tr><tr><td>4 vetrini a camera</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Sistema di filtraggio a vuoto</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE300</td><td></td></tr><tr><td>Piastre a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>T25 Palloni</td><td>TRP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T75 Fiasche</td><td>Corning</td><td>43064</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td><td></td>da dissezione</tr><tr><td>Pinze per dissezione Cotton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tips a punta singola</td><td>Kendall</td><td>540500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>Software Metamorph (Molecular Devices)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSCAlibur</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento di miofibroblasti da mouse e esofago umano

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine e umane esofagea miofibroblasti sono generati tramite digestione enzimatica. Neonato (8-12 giorni di età) murino esofago viene raccolto, tritata, lavata, e sottoposto a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per 25 min. I campioni di resezione esofagea umani sono spogliati di muscolare propria e avventizia e la mucosa restante viene macinata, e sottoposti a digestione enzimatica con collagenasi e dispasi per un massimo di 6 ore. Cellule in coltura esprimono α-SMA e vimentina e desmina espresso debolmente o per niente. Condizioni di coltura non sono favorevole alla crescita di epiteliale, ematopoietiche o cellule endoteliali. Cultura purezza è ulteriormente confermata da una valutazione citometria a flusso di espressione marcatore superficie cellulare del potenziale contaminante ematopoietiche ed endoteliali. La tecnica descritta è semplice e si traduce nella generazione coerente non hematopoieitc, cellule stromali non endoteliali. Limitazioni di questa tecnica sono inerenti all&#39;uso dicolture primarie di studi di biologia molecolare, cioè, la variabilità inevitabile incontrato tra le culture stabilite in diversi topi e nell&#39;uomo. Colture primarie, tuttavia, sono una riflessione più rappresentativo dello stato in vivo rispetto alle linee cellulari. Questi metodi forniscono anche gli investigatori la possibilità di isolare e cellule stromali cultura di diverse condizioni cliniche e sperimentali, permettendo il confronto tra gruppi. Cellule stromali esofagee caratterizzato possono essere utilizzati anche in studi funzionali in relazione alle interazioni epiteliali-stroma nei disturbi esofagei.

Cellule stromali esofagee isolate mediante digestione meccanica ed enzimatica sono inizialmente placcati e coltivate in 6 pozzetti. Esame di cellule con un microscopio invertito entro ore di placcatura dimostra una sospensione cellulare mista vagamente aderente alla piastra inferiore (Figura 1A). Nel prossimo 24 ore, le cellule fusiformi saldamente aderenti al fondo piatto sono osservate ripresa dalla sospensione cellulare mista (Figura 1B) .Questi cellule germinali coprono l'intera are...

Presentiamo un protocollo per generare colture primarie di cellule stromali esofagee murine e umane con un fenotipo di miofibroblasto. Le cellule in coltura hanno una morfologia a forma di fuso, esprimono α-SMA e vimentina e mancano di marcatori di superficie delle cellule epiteliali, ematopoietiche ed endoteliali. Le cellule stromali caratterizzate possono essere utilizzate negli studi funzionali delle interazioni epitelio-stromale.

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i miofibroblasti primari dall'esofago di topo e umano. Ciò si ottiene prelevando prima l'intero esofago dal topo neonato donatore con tessuto umano. La mucosa è separata dalla muscolo propria.Il secondo passo consiste nel tritare il fazzoletto e lavarlo più volte in HBSS. Successivamente, il tessuto viene digerito con collagenasi diss e ulteriormente tritato rilasciando le cellule mesenchimali insieme all'epitelio attaccato. La popolazione cellulare eterogenea viene quindi coltivata in terreni di coltura per miofibroblasti in cui i miofibroblasti aderiscono mentre le cellule epiteliali non sopravvivono e vengono lavate via.In definitiva, l'immunochimica e la citometria a flusso vengono utilizzate per confermare che le cellule in coltura primaria sono miofibroblasti. A dimostrare le procedure saremo io, Matthew Gargas, un tecnico, e chow new, un postdoc del mio laboratorio, Tori. Dopo l'eutanasia di un topo di 8-12 giorni, fissare il lato dorsale dell'animale e bagnare la superficie ventrale con etanolo al 70%.Quindi, usando una pinza, afferra e solleva la pelle anteriormente all'apertura uretrale. Taglia lungo la linea mediana ventrale dall'apertura uretrale al mento. Tagliare solo la pelle.Quindi praticare incisioni dall'apertura uretrale alle ginocchia, formando una Y capovolta.Dopo le incisioni alle ginocchia, praticare incisioni su entrambi i lati della gabbia toracica. Dopo aver completato le incisioni, staccare con cura la pelle e metterla da parte. Ora solleva il peritoneo e taglialo fino al diaframma e alla gabbia toracica.Tenere le forbici rivolte verso l'alto per evitare danni al contenuto intratoracico e addominale. Quindi sollevare delicatamente il lobo sinistro del fegato per esporre lo stomaco sottostante, la giunzione gastrica esofagea e la porzione addominale dell'esofago utilizzando forbici chirurgiche tagliate lungo la linea mediana dello sterno e della gabbia toracica fino al cingolo cervicale. Di nuovo. Nel fare ciò, tieni le forbici angolate lontano dagli organi sottostanti.Quindi tirare da parte la gabbia toracica per esporre il contenuto della cavità toracica. Ora rimuovi delicatamente il cuore ed entrambi i lobi dei polmoni. Utilizzare applicatori di cotone per assorbire il sanguinamento secondo necessità.L'esofago toracico è un tubo stretto e flessibile posteriore alla trachea e anteriore alla vertebra toracica. Nei neonati, trovare la giunzione gastrica esofagea per identificare l'esofago dallo stomaco. Senza mezzi termini, sezionare la vascolarizzazione che circonda l'esofago, compreso il tessuto adiposo e mesenterario, fino all'origine esofagea nella cavità cervicale.Ora reseca l'intera lunghezza dell'esofago e trasferiscilo in HBSS raffreddato, se lo desideri. Inoltre, rimuovere una parte dello stomaco a scopo di orientamento. Inizia questo protocollo tritando frammenti di mucosa ottenuti da tessuto di topo o umano in HBSS rispettivamente in un tubo micro fuge da 1,7 millilitri o in un tubo da cinque millilitri.Ora, quando si ottengono cellule stromali esofagee umane, è importante separare la mucosa dalla muscolo propria sottostante mediante dissezione brusca. Ora nel tubo conia ulteriormente il tessuto in pezzi da due a tre millimetri usando le forbici sottili. Dopo che il sedimento del frammento della mucosa esofagea ha decantato lentamente l'HBSS, facendo attenzione a non scartare inavvertitamente il tessuto.È inoltre possibile utilizzare una pipetta con puntale grande per rimuovere l'HBSS aggiuntivo. Quindi aggiungere l'HBSS fresco. Mescolare il tubo con una leggera agitazione e lasciare che il tessuto si depositi.Una volta sistemato, decantare nuovamente l'HBSS e ripetere questo lavaggio. Passo otto volte in tutto. Dopo gli otto lavaggi, incubare il tessuto con collagenasi 11 e incubare il tessuto murino fino a 25 minuti su un agitatore a dondolo impostato a bassa velocità e a temperatura ambiente.Nelle stesse condizioni, incubare il tessuto umano per sei ore. Dopo la digestione, mescolare ulteriormente il fazzoletto con le forbici sottili, quindi centrifugare il fazzoletto a 200 g per 10 minuti. Scartare il surnatante e travasare il tessuto pellettato in una provetta pulita da 1,7 millilitri.Quindi, sotto la cappa di coltura tissutale, lavare le cellule cinque volte in DMEM con sorbitolo al 2% per eliminare le cellule non vitali e altri detriti. Per ogni lavaggio, lasciare che le celle si depositino per gravità e decantare la soluzione di lavaggio. Dopo i lavaggi, seminare le cellule in tre pozzetti da sei.Piastra a pozzetto e coltivali in DMEM integrato filtrato sottovuoto. Il tessuto umano può richiedere più pozzetti o piastre, a seconda delle dimensioni della coltura del campione, le cellule, fino a quando i pozzetti non sono confluenti all'80%. Quindi passare prima le cellule di aderenza in fiasche T 25, utilizzare lo 0,05% di tripsina in EDTA per rimuovere le cellule.Quindi aggiungi i media per neutralizzare la reazione. Raccogliere le cellule rimosse in una provetta da centrifuga. Quindi centrifugare le cellule a 400 G per raccoglierle al microscopio.Osservare la morfologia a forma di fuso delle cellule aderenti per distinguere le cellule stromali coltivate dalle cellule muscolari colorarle immunologicamente per Desmond. Utilizzando un protocollo standard, è possibile piastrare brevemente 15.000 cellule in vetrini a quattro pozzetti e farle crescere in terreno di coltura per miofibroblasti per 24 ore. Il giorno successivo, fissare le cellule e poi, prima di applicare l'anticorpo primario, bloccare le cellule fissate con il 5% di siero di capra in PBS, sia gli anticorpi primari che quelli secondari devono essere diluiti in siero di capra al 5%.Incubare con anticorpo primario a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Quindi sciacquare le celle tre volte con PBS dopo i lavaggi. Aggiungere gli anticorpi secondari e incubare le cellule per un'ora.A temperatura ambiente, utilizzare tre lavaggi in PBS per rimuovere gli anticorpi secondari. Quindi le cellule colorate possono essere analizzate dopo i lavaggi. Applicare DPI con il mezzo di montaggio e il vetrino coprioggetti per stabilire la purezza delle cellule esofagee.Controllali per i marcatori della superficie delle cellule ematopoietiche ed endoteliali. Utilizzo della citometria a flusso. Coltiva un numero sufficiente di fiasche di coltura fino a quando non sono pronte per essere raccolte.Quindi staccare le cellule stromali esofagee di topo in coltura utilizzando una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica a 37 gradi Celsius per 10 minuti. A seguito della loro raccolta. Lavare due volte le celle con il buffer fax e contare le celle.Ora utilizzando una procedura di colorazione standard, colorare con CD 45 per identificare le cellule immunitarie e colorare con CD 31 per identificare le cellule endoteliali, quindi far passare le cellule attraverso il citometro a flusso. Le cellule stromali esofagee sono state isolate mediante digestione meccanica ed enzimatica e coltivate in piastre a sei pozzetti entro poche ore dalla piastra. Le celle erano in una sospensione mista che aderisceva liberamente alla piastra.Nelle successive 24 ore, le cellule a forma di fuso sono spuntate dalla sospensione cellulare e hanno aderito saldamente al fondo della piastra. Queste celle hanno coperto l'intero pozzetto entro cinque giorni e sono state attraversate mantenendo con successo la loro morfologia per almeno 15 passaggi visti qui, le celle sono a bassa densità. Queste sono le cellule a forma di fuso vicino alla cofluenza, colorazione immunologica di colture primarie di cellule stromali esofagee.I vetrini coltivati in camera hanno dimostrato un'abbondante espressione dei marcatori citoscheletrici dei miofibroblasti. La purezza delle colture di alfa, SMA e mentone è stata valutata mediante citometria a flusso. La dispersione diretta e laterale è stata stabilita per le cellule stromali esofagee murn primarie, seguita dal gating e dall'analisi delle cellule vive per le proteine della superficie cellulare.Le cellule stromali esofagee primarie murn mancavano di espressione di CD 45 ematopoietica e mancavano di espressione dei marcatori di superficie cellulare CD-31 endoteliale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire colture primarie di miofibroblasti da topo ed esofago umano. Sì.

isolation-of-myofibroblasts-from-mouse-and-human-esophagus

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video dimostra l'isolamento di singole miofibre dal muscolo estensore lungo delle dita (EDL) murino. Le miofibre isolate possono essere coltivate per studiare l'attività delle cellule staminali muscolari associate alle miofibre.

Isolamento delle miofibre: una tecnica per ottenere singole miofibre dal muscolo estensore lungo delle dita (EDL) di topo raccolto

L'isolamento e la cultura della miofibre è il gold...

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Il miofibroblasti è una cellula stromale influente del tratto gastrointestinale che regola importanti processi fisiologici in stati normali e patologici. Descriviamo una tecnica che consente l'isolamento dei miofibroblasti primarie sia da mouse e tessuti del colon umano, che può essere utilizzato per la sperimentazione in vitro.

Isolamento di primaria miofibroblasti da mouse e Colon Tessuto umano

Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all'interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano.

Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

Qui, viene presentato un protocollo per isolare e stabilire colture primarie di fibroblasti/miofibroblasti (MF) da cellule gastriche, piccole cellule intestinali e di tessuto del colon congelate con un fenotipo MF. Queste cellule esprimono CD90, α-SMA e vimentina. Le MF possono essere utilizzate per una varietà di saggi funzionali, tra cui l'attività enzimatica e la produzione di citochine.

Isolamento di CD 90+ fibroblasti / miofibroblasti da umani congelati gastrointestinali campioni

Ottenere una popolazione pura di fibroblasti è fondamentale per studiare il loro ruolo nella riparazione delle ferite e nella fibrosi. Descritto qui è un metodo dettagliato per isolare i fibroblasti e i miofibroblasti da cuori di topo feriti e feriti, seguiti dalla caratterizzazione della loro purezza e funzionalità da immunofluorescence, RTPCR, smistamento delle cellule assistite dalla fluorescenza, e contrazione del gel di collagene.

Isolamento e caratterizzazione di fibroblasti cardiaci adulti e miofibroblasti

Questo protocollo illustra 1) l'isolamento e la coltura di fibroblasti primari dal muscolo gastrocnemio di topo adulto e 2) la purificazione e la caratterizzazione degli esosomi utilizzando un metodo di ultracentrifugazione differenziale combinato con gradienti di densità del saccarosio seguito da analisi western blot.

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Qui, proponiamo un metodo per ottenere in modo efficiente le singole fibre muscolari nelle prime fasi dello sviluppo post-natale dal mutante omozygoso lamin modello murino 8, un modello molto severo per la distrofia muscolare Emery-Dreifuss (EDMD).

Isolamento e cultura della miofibra singola da un modello Murine della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss nei primi sviluppi post-Natal

Qui, presentiamo un protocollo per isolare il mesenchima intestinale murino, compresi i telocytes. Questi possono essere utilizzati per diverse applicazioni, come la co-coltura con topo o organoidi di derivazione umana, per sostenere la crescita e riflettere meglio la situazione nel tessuto originale.

Isolamento del mesenchima intestinale murino con conseguente alta resa di telociti

Le co-colture organoide-fibroblasti forniscono un modello per studiare la nicchia delle cellule staminali in vivo . Qui viene descritto un protocollo per le co-colture organoide-fibroblasti esofagee. Inoltre, l'imaging a montaggio intero viene utilizzato per visualizzare l'interazione fibroblasto-organoide.

Caratterizzazione funzionale e visualizzazione di fibroblasti esofagei mediante co-colture organoidi

Qui viene fornito un protocollo per la coltura di organoidi esofagei umani e la coltura dell'interfaccia aria-liquido. La coltura dell'interfaccia aria-liquido degli organoidi esofagei può essere utilizzata per studiare l'impatto delle citochine sulla barriera epiteliale esofagea.

Modelli tridimensionali di coltura cellulare per studiare la barriera epiteliale nell'esofagite eosinofila 

Impara a isolare miofibroblasti primari da esofago murino e umano. Questo metodo utilizza digestione con collagenasi e coltura selettiva per studiare le interazioni epitelio-stromali in vitro.

Isolamento di miofibroblasti da mouse e Esofago umano

Esplora altri video