Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

I macrofagi sono le cellule chiave coinvolte nella patogenicità dell'ospite. I macrofagi mostrano una diversità fenotipica e funzionale che può essere analizzata e rilevata mediante analisi proteomica. Questo articolo descrive come eseguire l'elettroforesi 2D di colture primarie di macrofagi umani differenziati in fenotipo M1 o M2.

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare il fenotipo dei sottogruppi di macrofagi M1 pro-infiammatori umani e M 2 anti-infiammatori mediante differenziale 2D nell'elettroforesi su gel. Ciò si ottiene marcando prima le proteine estratte da due colture primarie di macrofagi M1 e M con coloranti sinusoidali. Nella seconda fase, le proteine vengono mescolate insieme e sui campioni viene eseguita l'elettrofocalizzazione ISO mediante reidratazione.

Successivamente, la seconda dimensione, l'elettroforesi viene eseguita con un gradiente di pH mobilizzato o strisce IPG al buio, quindi i gel vengono scansionati con il differenziale nello scanner per elettroforesi su gel. Infine, viene eseguita l'analisi delle immagini numerate per rilevare le differenze nelle macchie peptiche dei polipi tra i sottogruppi di due macrofagi M1 e M. Il vantaggio principale di questa tecnica, tra i metodi esistenti, come la classica elettroforesi su gel di todi, è che questa tecnica è più sensibile, richiedendo solo cinque microgrammi di proteine, il che è molto importante per i campioni ottenuti da pazienti umani.

A dimostrare la procedura saranno Mario Bove, uno studente di dottorato, Olivia Beza e il tecnico Magac del mio laboratorio. Per preparare colture primarie di macrofagi derivati da monociti, iniziare diluendo 25 millilitri di Buffy coat in 25 millilitri di PBS. Quindi caricare con cura il sangue diluito su un gradiente di separazione e centrifugare le cellule per 20 minuti a 1600 Gs e temperatura ambiente quando le cellule hanno finito di girare. Raccogliere i monociti allo strato di interfaccia, seguiti da tre lavaggi successivi delle cellule raccolte in 10 millilitri di PBS contenente lo 0,1% di EDTA dopo il terzo lavaggio.

Far girare le cellule ancora una volta in PBS da solo, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno RPMI 1640 senza semi di siero. Le cellule in piastre da 35 millimetri ad una densità di una volta 10 per le sei cellule per piatto, e poi dopo una sedimentazione di 90 minuti nell'incubatore, scartare il surnatante e lavare i monociti aderenti tre volte con un millilitro di PBS. La coltura successiva, le cellule in 10 millilitri di terreno fresco contenente il 10% in volume per volume di siero umano per sei giorni a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica.

Quindi, per produrre macrofagi M 2 antinfiammatori, integrare alcune colture con 15 nanogrammi per millilitro di IL quattro il sesto giorno di coltura per produrre macrofagi pro-infiammatori il giorno 12. Trattare le altre colture di macrofagi differenziati con 100 nanogrammi per millilitro di LPS per quattro ore per isolare i sottogruppi di macrofagi per l'elettroforesi 2D. Successivamente, lavare la coltura di interesse tre volte con tris da 25 millimolari, quindi rilasciare le cellule dal fondo delle piastre con il tampone di estrazione delle crespature.

Quindi, trasferisci le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e allacciale a quattro gradi Celsius. Dopo cinque minuti, trasferire le cellule in aliquote da 100 microlitri a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi della concentrazione proteica per l'elettrofocalizzazione ISO dei sottogruppi di macrofagi. Per prima cosa, regolare i campioni a nove aliquote da microlitri, quindi ridurre le soluzioni cellulari con tampone di lisi integrato con due millimolari di TCEP a 37 gradi Celsius.

Dopo un'ora, incubare gli estratti con S SI three e S SI five a 37 gradi Celsius, interrompendo la reazione dopo 30 minuti con l'aggiunta di un uguale volume di tampone campione. Quindi creare due miscele separate di volumi uguali di proteine S SI tre marcate M1 con SCI cinque marcate M due proteine. Successivamente, reidratare una striscia di IPG con 450 microlitri di campioni misti marcati in un tampone di estrazione chaps su un sistema di celle di focalizzazione isoelettriche per 24 ore senza applicare alcuna corrente.

Il giorno successivo, iniziare la messa a fuoco a 300 volt per tre ore, quindi impostare un gradiente a 1000 volt per sei ore, seguito da due gradienti da 8.000 volt per tre ore ciascuno per eseguire l'elettroforesi di seconda dimensione incubare le strisce IPG in un tampone di equilibrio. Dopo 10 minuti, trasferire le strisce su gel da 12,5% di pagina e sigillarle con aros a basso punto di fusione. Quindi utilizzare un sistema edin dsic a una tensione costante di 70 volt per eseguire l'elettroforesi a 20 gradi Celsius durante la notte, seguita da una corsa a 300 volt fino a quando il fronte blu di bromo fenolo raggiunge il fondo del gel per acquisire immagini dei gel.

Posizionarli tra le due lastre di vetro a bassa fluorescenza di uno scanner imager per elettroforesi differenziale e gel e scansionare i gel a lunghezze d'onda di emissione di eccitazione di 5 32, 5 80 nanometri per tre e 6 33 6 70 nanometri per cinque per produrre immagini con una dimensione dei pixel di 100 micrometri. Analizza con il software appropriato e quindi calcola e normalizza i volumi degli spot in ogni immagine, assegnando un volume spot normalizzato in proporzione al valore totale di ogni spot rilevato nel gel. Analizzare le differenze nei volumi spot proteici per ciascun tipo di macrofago confrontando il valore normalizzato del volume spot tra i due gruppi di macrofagi, considerando che la differenza tra i volumi spot è significativa se la variazione è di 1,5 volte.

In questo esperimento. I pattern proteici 2D dei due sottotipi di macrofagi, M1 pro-infiammatorio e M 2 anti-infiammatorio, sono stati determinati mediante 2D differenziale. Nell'elettroforesi su gel, lo stesso modello di proteine è stato osservato per M1 o M 2 indipendentemente dai coloranti ciano utilizzati.

È interessante notare che l'analisi bioinformatica del gel ha rivelato che 20 aree contenenti macchie, aumenti e diminuzioni tra i volumi delle macchie sono stati quantificati come visualizzato dalle macchie coloranti gialle, blu e verdi sono state considerate avere un'espressione differenziale significativa se la variazione di piega del volume dello spot normalizzato era maggiore di 1,5 con un valore P inferiore a 0,05. A seguito di questo CHE, è possibile eseguire metodi di offerta come la quantitativa, la spettrometria di massa o l'analisi proteomica aggiuntiva per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quale tipo di proteine sono espresse in modo differenziale tra i due sottogruppi di macrofagi in risposta a vari stimoli.