Name: Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Scopri l'analisi del profilo proteico dei macrofagi umani M1 e M2 mediante elettroforesi bidimensionale differenziale su gel. Questa tecnica sensibile rivela variazioni proteiche essenziali per studi su campioni umani.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Inserm. Marion Bouvet è membro del Ministero francese per la Ricerca e la Tecnologia. Annie Turkieh è una borsista dell'Unione Europea FP7 HOMAGE (305507).

Il protocollo segue le linee guida delle nostre istituzioni umana comitato etico di ricerca. Buffy-coat da sani donatori umani sono stati ottenuti dal Regional Blood Transfusion Center (Lille, Francia). I campioni ottenuti dai buffy coats sono dichiarati come una collezione Inserm (n ° DC2010-1209). 1. Materiale e Culture Media Preparazione <ol><li> Diluire 10x tampone fosfato salino (PBS) in acqua distillata sterile per ottenere 1x PBS. </li><li> Effettuare terreno RPMI 1640 supplementato con gentamicina (40 mcg / ml) e L-glutammina (2 mM), con e senza il 10% di siero umano pool. </li></ol> 2. Le colture primarie di macrofagi derivate da monociti (MDM) <ol><li> Diluire buffycoat (25 ml) con 1x PBS. Caricare con attenzione su un Ficoll / provetta leucosep e centrifugare a 1600 xg per 20 min a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere monociti all&#39;interfaccia in un nuovo tubo. Lavare 3x con 10 ml di PBS 1X contenente 0,1% etilendiamminotetraacido acetico (EDTA) per successive centrifugazioni a 1000 xg, 370 xg e 160 xg per 10 minuti ciascuno, e poi una volta in PBS 1x solo a 160 xg per 10 min. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno RPMI-1640 senza siero e seminare le cellule su 35 mm piatti ad una densità di 1 x 10 6 cellule per piastra. </li><li> Dopo sedimentazione per 90 min in incubatrice, scartare il surnatante contenente le cellule non aderenti. Lavare le cellule aderenti, composto da monociti, 3x con 1 ml di PBS; quindi aggiungere 1 ml di mezzo fresco contenente 10% (v / v) di siero umano per le celle libere precedenza siero. </li><li> Dopo 6 giorni di coltura, per produrre macrofagi differenziati alternativi (M2), aggiungere umana ricombinante IL-4 (15 ng / ml) e mantenere per 6 giorni. Quindi, il trattamento di macrofagi differenziati con lipopolisaccaride (100 ng / ml) al giorno 12 per 4 ore per ottenere macrofagi M1. </li></ol> 3. Estrazione di M1 e M2 macrofagi proteine ​​per elettroforesi 2D <ol><li> Lavare macrophetà tre volte con 25 mM Tris, pH 7,4, e rottami in tampone contenente 30 mM Tris pH 8, 4% 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (CHAPS), 2 M tiourea e 7 M urea. </li><li> Lisare le cellule utilizzando un mixer adatto per provette da 1,5 ml microcentrifuga per 5 min in ghiaccio e conservare a -20 ° C. </li><li> Determinare la concentrazione di proteine ​​usando un reagente commerciale Bradford. Conservare aliquote di 100 microlitri di proteine ​​a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 4. Isoelettrofocalizzazione NOTA: Eseguire tutte le procedure di etichettatura nel buio. <ol><li> Ridurre 5 mg di ciascun campione (M1 e M2 macrofagi) regolato a 9 microlitri di tampone di lisi con 2 mM Tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Aggiungere cianina 3 (Cy3) per estrarre M1 e M2 estratto sulfidrilici colorante reattivo ad una concentrazione di 0,8 nM proteina / mg. Aggiungere cianina 5 (Cy5) M1 e M2 estrae ad una concentrazione di 0,8 nM / mg proteine ​​e incubareper 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Arrestare la reazione con l&#39;aggiunta di un volume uguale di tampone campione contenente 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 130 mM ditiotreitolo (DTT) e 2% pharmalytes. </li><li> Mix Cy3-marcato campioni M1 con M2 campioni Cy5-etichettati in una mano e Cy3-marcato campioni M2 con campioni M1 Cy5-etichettati in un altro mano. </li><li> Reidratare un gradiente di pH immobilizzato (IPG) striscia (240 mm pH 3-10 gradiente lineare) con 450 ml di campioni misti etichettati in tampone contenente 7 M urea, 2 M tiourea e il 4% CHAPS su un sistema di messa a fuoco isoelettrica delle cellule (IEF) per 24 ore senza applicare alcuna corrente. </li><li> Eseguire focalizzazione a 300 volt (V) per 3 ore, e poi ad un gradiente di 1000 V per 6 ore, con una pendenza a 8000 V per 3 ore e infine a 8000 V per 3 ore. </li></ol> 5. Seconda Dimensione NOTA: Eseguire tutte le procedure di elettroforesi nel buio. <ol><li> Incubare le strisce IPG in tampone per l&#39;equilibrazione contengonoing 0,1 mM Tris-HCl (pH 8), 6 M urea, 2% (w / v) di sodio dodecil solfato (SDS) e 30% (v / v) di glicerolo per 10 min. </li><li> Trasferire le strisce IPG equilibrate per la seconda dimensione (elettroforesi su gel di SDS-poliacrilammide (PAGE)) sul 12,5% gel PAGE e sigillare con basso punto di fusione agarosio. </li><li> Effettuare elettroforesi a 20 ° C utilizzando un sistema Ettan-Daltsix ad una tensione costante di 70 V durante la notte seguita da 300 V fino alla bromofenolo blu anteriore raggiunge il fondo del gel. </li></ol> 6. Acquisizione di immagini e analisi bioinformatica <ol><li> Gel scansione espressi tra le due lastre di vetro a bassa fluorescenza con uno scanner DIGE Imager a lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione di 532/580 nm per Cy3 e Cy5 633/670 nm per cedere immagini con una dimensione di pixel di 100 micron. </li><li> Eseguire l&#39;analisi delle immagini con software commerciale come precedentemente descritto 12. </li><li> Calcolare e normalizzare i volumi pronti in ogni immagine. Assegnare un volume posto normalizzato come un oggetto di scenaortion del valore totale di ogni punto rilevato nel gel. </li><li> Analizzare le differenze di volumi di campione proteiche per ciascun tipo di macrofagi confrontando il valore del volume posto normalizzato tra i due gruppi (M1 e M2). Si consideri la differenza tra i volumi pronti ad essere significativo se il cambiamento è 1,5 volte (p &lt;0.05, unidirezionale analisi ANOVA). </li></ol>

<ol><li>van Ginderachter, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+alternative+activation+of+mononuclear+phagocytes%3A+picking+the+best+of+both+worlds+for+tumor+promotion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion.</a> Immunobiology. 211, (2006).</li>
<li>Porcheray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+an+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation.</a> Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoy+receptors%3A+a+strategy+to+regulate+inflammatory+cytokines+and+chemokines%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines.</a> Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).</li>
<li>Pinet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+homogeneity+and+functionality+of+human+monocytes-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages.</a> Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).</li>
<li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mononuclear+cells+and+granulocytes+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Isolation+of+monuclear+cells+by+one+centrifugation%2C+and+of+granulocytes+by+combining+centrifugation+and+sedimentation+at+1%22%5BJournal%5D)">Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood.</a> Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+atherosclerotic+plaque+alternative+macrophages+display+low+cholesterol+handling+but+high+phagocytosis+because+of+distinct+activities+of+the+PPAR%CE%B3+and+LXR%CE%B1+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways.</a> Circ. Res. 108, 985-995 (2011).</li>
<li>Tonge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+development+of+fluorescence+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+proteomics+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology.</a> Proteomics. 1, 377-396 (2001).</li>
<li>Shaw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+saturation+labelling+two-dimensional+difference+gel+electrophoresis+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes.</a> Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+saturation+dye+2D+DIGE+proteomics+to+characterize+proteins+modulated+by+oxidized+low+density+lipoprotein+treatment+of+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages.</a> J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).</li>
<li>Dupont, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+maps+and+databases+of+the+human+macrophage+proteome+and+secretome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome.</a> Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+incomplete+DNase+I+treatment+on+human+macrophage+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis.</a> Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).</li>
<li>Acosta-Martin, A. E., Lane, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+bioinformatics+and+MS-based+proteomics%3A+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications.</a> Expert Rev Proteomics. , (2014).</li>
<li>Boytard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proinflammatory+CD68%2BMR-+macrophages+in+peroxiredoxin-1+expression+and+in+abdominal+aortic+aneurysms+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).</li>
</ol>

Non vi sono conflitti di interesse dichiarati.

Il protocollo qui descritto dettaglio un metodo per analizzare l&#39;impatto di vari stimoli dei due sottotipi di macrofagi M1 (pro-infiammatori) e M2 (anti-infiammatori). Colture primarie di M1 e M2 macrofagi sono stati ottenuti dalla differenziazione dei monociti come precedentemente pubblicato 7. La procedura di elettroforesi su gel 2D DIGE richiede materiali e delle attrezzature speciali, come le batterie IEF per piatti isoelettrofocalizzazione, a bassa fluorescenza per l&#39;...

I macrofagi sono cellule eterogenee e plastica che sono in grado di acquisire fenotipi funzionali distinti. In vivo, queste cellule rispondono ad una grande varietà di micro signalssuch ambientale come prodotti microbici, citochine, ecc. 1. In vitro, il fenotipo pro-infiammatorio (M1) di macrofagi può essere indotta da lipopolisaccaride (LPS) e il fenotipo antinfiammatorio (M2) da alcune citochine come l&#39;interleuchina-4 (IL-4). Inoltre, i macrofagi possono passare da una M1 M2 fenotipo attivato, e viceversa, sui segnali specifici 2. A seconda del fenotipo, macrofagi avranno diverse funzioni. Macrofagi M1 sono cellule che producono citochine pro-infiammatorie, come il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), per uccidere i microrganismi o cellule tumorali 3. Al contrario, i macrofagi M2 evitare che queste risposta infiammatoria come nella guarigione delle ferite e la fibrosi producendo anti-inflammatorfattori y, come TGF-β 3,4. Cellule mononucleate del sangue periferico umani di donatori sani sono stati isolati da Ficoll centrifugazione in gradiente di densità come descritto in precedenza 5 utilizzando una tecnica adattata da Boyum 6. I macrofagi in coltura possono essere differenziati in M1 o M2 fenotipo dopo 6 giorni di coltura primaria 7. Analisi di espressione della proteina o modifiche proteina tra i due sottotipi di macrofagi sotto vari stimoli controllati, quali patogenicità host o tossine microbiche, sarà utile per decifrare la funzionalità del pro- e macrofagi antinfiammatori. Proteomica sono strumenti unici per il monitoraggio diretto di proteine ​​che sono specificamente up- o down-regolato nei macrofagi in coltura umani sotto vari stimoli. Coloranti fluorescenti hanno risolto alcune delle limitazioni di elettroforesi su gel 2D, come la bassa sensibilità e analisi d&#39;immagine 8 &lt;<html> / Sup&gt;. I coloranti reagiscono con residui di cisteina hanno aumentato la sensibilità di rilevamento rispetto a quelli reagire con residui di lisina 9. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato l&#39;utilità di etichettatura saturazione DIGE per l&#39;analisi di campioni scarse 10 rispetto al classico argento macchiato elettroforesi 2D 11. Questa tecnologia è utile per analizzare rapidamente modificazioni proteiche tra i due sottotipi di macrofagi o tra macrofagi non trattati e trattati dallo stesso sottotipo. I vantaggi di questa tecnica proteomica stanno avendo accesso alle informazioni di formato proteine ​​e modificazioni post-traduzionali analizzando il gel 2D 12. Si deve tenere conto che questa non è una tecnica elevata produttività, limitando il numero di campioni che possono essere analizzati. Lo sviluppo di saggi high throughput basato su spettrometria di massa come rivisto recentemente 13 può migliorare questa. _content &quot;&gt; Qui vi presentiamo come eseguire l&#39;analisi 2D DIGE dall&#39;estrazione di proteine ​​di macrofagi in coltura attraverso i processi di elettroforesi, isoelettrofocalizzazione, e SDS-PAGE e informazioni sull&#39;utilità di un adeguato software 2D.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>31870-074</td><td></td></tr><tr><td>PBX 10 X</td><td>Invitrogen</td><td>14200-083</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina-200 mM-100X</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina 10 mg/ml</td><td>Invitrogen</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>siero umano</td><td>Invitrogen</td><td>34005100</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll d = 1,077</td><td>ATGC</td><td>L6115</td><td></td></tr><tr><td>Leucosep</td><td>Dutscher</td><td>16760</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; piastra a 6 pozzetti PRIMARIA&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>353846</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>Promocell</td><td>B-61410</td><td></td></tr><tr><td>lipopolisaccaride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2654</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Fluka</td><td>48900</td><td></td></tr><tr><td>EDTA MM372,2</td><td>Research Organics&nbsp;</td><td>3.00E+01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro 0.22 &; micro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPTORE</td><td></td></tr><tr><td>100 ml cilindro</td><td>Corning</td><td>430182</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Interchim</td><td>UP242214</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagente</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>Cy3+Cy5-reattivo</td><td>colorante GE Healthcare</td><td>25-8009-83</td><td></td></tr><tr><td>striscia IPG 3-10 24cm</td><td>GE Healthcare</td><td>17-6002-44</td><td></td></tr><tr><td>Protean Cellula IEF</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4000</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio a basso punto di fusione</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Sistema Ettan-Daltsix</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DIGE Imager scanner</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Progenesis Samespot</td><td>Dinamica</td><td></td><td></td>non lineare</tr><tr><td>Provette da 50 ml</td><td>qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Tubi da 15 ml</td><td>qualsiasi fornitore</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5070</td><td></td></tr><tr><td>ur&eacute; e</td><td>Merk</td><td>108484-500</td><td></td></tr><tr><td>Thiour&eacute; e</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7875</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Bio-Rad</td><td>1610611</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Pharmalytes 3-10</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0456-01</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3773</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide 40%</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Pulizia 2D GE</td><td>Healthcare</td><td>80-6454-51</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>Dim&eacute; tilformammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22705-6</td><td></td></tr><tr><td>stoppini per elettrodi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-4071</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomica profiling dei macrofagi da 2d elettroforesi

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

L'obiettivo del protocollo di elettroforesi bidimensionale (2D) qui descritto è mostrare come analizzare il fenotipo dei macrofagi umani coltivati. Il ruolo chiave dei macrofagi è stato dimostrato in vari disturbi patologici come malattie infiammatorie, immunologiche e infettive. In questo protocollo, utilizziamo colture primarie di macrofagi umani derivati da monociti che possono essere differenziati nel fenotipo M1 (pro-infiammatorio) o M2 (anti-infiammatorio). Questo modello in vitro è affidabile per lo studio delle attività biologiche dei macrofagi M1 e M2 e anche per un approccio proteomico. Le tecniche proteomiche sono utili per confrontare il fenotipo e il comportamento dei macrofagi M1 e M2 durante la patogenicità dell'ospite. L'elettroforesi su gel 2D è una potente tecnica proteomica per la mappatura simultanea di un gran numero di proteine o polipeptidi. Descriviamo il protocollo dell'elettroforesi 2D utilizzando coloranti fluorescenti, denominato Elettroforesi su Gel Differenziale 2D (DIGE). Le proteine macrofagiche M1 e M2 sono marcate con coloranti cianina prima della separazione mediante focalizzazione isoelettrica, in base al loro punto isoelettrico nella prima dimensione, e alla loro massa molecolare, nella seconda dimensione. Macchie proteiche o polipeptidiche separate vengono quindi utilizzate per rilevare le differenze nei livelli di espressione di proteine o polipeptidi. Gli approcci proteomici qui descritti consentono di studiare i cambiamenti delle proteine dei macrofagi associati a vari disturbi come la patogenicità dell'ospite o le tossine microbiche.

Per eseguire un'adeguata analisi proteomica differenziale, il trattamento dei campioni da analizzare vanno verificate. Nell'esempio presentato, è richiesta la qualità di coltura cellulare di macrofagi per aspetti morfologici e molecolari come precedentemente pubblicato 5. La differenziazione dei monociti in macrofagi e l'omogeneità della cultura è stata seguita da fase microscopio. Figura 1 ha mostrato un esempio di colture primarie di M1 e M2 macrofagi. Come most...

I macrofagi sono le cellule chiave coinvolte nella patogenicità dell'ospite. I macrofagi mostrano una diversità fenotipica e funzionale che può essere analizzata e rilevata mediante analisi proteomica. Questo articolo descrive come eseguire l'elettroforesi 2D di colture primarie di macrofagi umani differenziati in fenotipo M1 o M2.

Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare il fenotipo dei sottogruppi di macrofagi M1 pro-infiammatori umani e M 2 anti-infiammatori mediante differenziale 2D nell'elettroforesi su gel. Ciò si ottiene marcando prima le proteine estratte da due colture primarie di macrofagi M1 e M con coloranti sinusoidali. Nella seconda fase, le proteine vengono mescolate insieme e sui campioni viene eseguita l'elettrofocalizzazione ISO mediante reidratazione.Successivamente, la seconda dimensione, l'elettroforesi viene eseguita con un gradiente di pH mobilizzato o strisce IPG al buio, quindi i gel vengono scansionati con il differenziale nello scanner per elettroforesi su gel. Infine, viene eseguita l'analisi delle immagini numerate per rilevare le differenze nelle macchie peptiche dei polipi tra i sottogruppi di due macrofagi M1 e M. Il vantaggio principale di questa tecnica, tra i metodi esistenti, come la classica elettroforesi su gel di todi, è che questa tecnica è più sensibile, richiedendo solo cinque microgrammi di proteine, il che è molto importante per i campioni ottenuti da pazienti umani.A dimostrare la procedura saranno Mario Bove, uno studente di dottorato, Olivia Beza e il tecnico Magac del mio laboratorio. Per preparare colture primarie di macrofagi derivati da monociti, iniziare diluendo 25 millilitri di Buffy coat in 25 millilitri di PBS. Quindi caricare con cura il sangue diluito su un gradiente di separazione e centrifugare le cellule per 20 minuti a 1600 Gs e temperatura ambiente quando le cellule hanno finito di girare. Raccogliere i monociti allo strato di interfaccia, seguiti da tre lavaggi successivi delle cellule raccolte in 10 millilitri di PBS contenente lo 0,1% di EDTA dopo il terzo lavaggio.Far girare le cellule ancora una volta in PBS da solo, quindi risospendere il pellet in cinque millilitri di terreno RPMI 1640 senza semi di siero. Le cellule in piastre da 35 millimetri ad una densità di una volta 10 per le sei cellule per piatto, e poi dopo una sedimentazione di 90 minuti nell'incubatore, scartare il surnatante e lavare i monociti aderenti tre volte con un millilitro di PBS. La coltura successiva, le cellule in 10 millilitri di terreno fresco contenente il 10% in volume per volume di siero umano per sei giorni a 37 gradi Celsius e il 5% di anidride carbonica.Quindi, per produrre macrofagi M 2 antinfiammatori, integrare alcune colture con 15 nanogrammi per millilitro di IL quattro il sesto giorno di coltura per produrre macrofagi pro-infiammatori il giorno 12. Trattare le altre colture di macrofagi differenziati con 100 nanogrammi per millilitro di LPS per quattro ore per isolare i sottogruppi di macrofagi per l'elettroforesi 2D. Successivamente, lavare la coltura di interesse tre volte con tris da 25 millimolari, quindi rilasciare le cellule dal fondo delle piastre con il tampone di estrazione delle crespature.Quindi, trasferisci le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e allacciale a quattro gradi Celsius. Dopo cinque minuti, trasferire le cellule in aliquote da 100 microlitri a meno 20 gradi Celsius fino all'analisi della concentrazione proteica per l'elettrofocalizzazione ISO dei sottogruppi di macrofagi. Per prima cosa, regolare i campioni a nove aliquote da microlitri, quindi ridurre le soluzioni cellulari con tampone di lisi integrato con due millimolari di TCEP a 37 gradi Celsius.Dopo un'ora, incubare gli estratti con S SI three e S SI five a 37 gradi Celsius, interrompendo la reazione dopo 30 minuti con l'aggiunta di un uguale volume di tampone campione. Quindi creare due miscele separate di volumi uguali di proteine S SI tre marcate M1 con SCI cinque marcate M due proteine. Successivamente, reidratare una striscia di IPG con 450 microlitri di campioni misti marcati in un tampone di estrazione chaps su un sistema di celle di focalizzazione isoelettriche per 24 ore senza applicare alcuna corrente.Il giorno successivo, iniziare la messa a fuoco a 300 volt per tre ore, quindi impostare un gradiente a 1000 volt per sei ore, seguito da due gradienti da 8.000 volt per tre ore ciascuno per eseguire l'elettroforesi di seconda dimensione incubare le strisce IPG in un tampone di equilibrio. Dopo 10 minuti, trasferire le strisce su gel da 12,5% di pagina e sigillarle con aros a basso punto di fusione. Quindi utilizzare un sistema edin dsic a una tensione costante di 70 volt per eseguire l'elettroforesi a 20 gradi Celsius durante la notte, seguita da una corsa a 300 volt fino a quando il fronte blu di bromo fenolo raggiunge il fondo del gel per acquisire immagini dei gel.Posizionarli tra le due lastre di vetro a bassa fluorescenza di uno scanner imager per elettroforesi differenziale e gel e scansionare i gel a lunghezze d'onda di emissione di eccitazione di 5 32, 5 80 nanometri per tre e 6 33 6 70 nanometri per cinque per produrre immagini con una dimensione dei pixel di 100 micrometri. Analizza con il software appropriato e quindi calcola e normalizza i volumi degli spot in ogni immagine, assegnando un volume spot normalizzato in proporzione al valore totale di ogni spot rilevato nel gel. Analizzare le differenze nei volumi spot proteici per ciascun tipo di macrofago confrontando il valore normalizzato del volume spot tra i due gruppi di macrofagi, considerando che la differenza tra i volumi spot è significativa se la variazione è di 1,5 volte.In questo esperimento. I pattern proteici 2D dei due sottotipi di macrofagi, M1 pro-infiammatorio e M 2 anti-infiammatorio, sono stati determinati mediante 2D differenziale. Nell'elettroforesi su gel, lo stesso modello di proteine è stato osservato per M1 o M 2 indipendentemente dai coloranti ciano utilizzati.È interessante notare che l'analisi bioinformatica del gel ha rivelato che 20 aree contenenti macchie, aumenti e diminuzioni tra i volumi delle macchie sono stati quantificati come visualizzato dalle macchie coloranti gialle, blu e verdi sono state considerate avere un'espressione differenziale significativa se la variazione di piega del volume dello spot normalizzato era maggiore di 1,5 con un valore P inferiore a 0,05. A seguito di questo CHE, è possibile eseguire metodi di offerta come la quantitativa, la spettrometria di massa o l'analisi proteomica aggiuntiva per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio quale tipo di proteine sono espresse in modo differenziale tra i due sottogruppi di macrofagi in risposta a vari stimoli.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un metodo semplice e specifico è stato dimostrato per la marcatura fluorescente e la rilevazione maggiore di proteine ​​di superficie cellulare, senza un passo di frazionamento. Abbondanza differenziale di proteine ​​della superficie cellulare è stato analizzato mediante elettroforesi bidimensionale (2-D) e Ettan ™ tecnologia DIGE.

Etichettatura selettiva di proteine ​​della superficie cellulare utilizzando CyDye DIGE Coloranti Fluor Minimal

Questo protocollo descrive l'uso della spettrometria di massa MALDI-TOF a cellula intera su cellule eucariotiche. Qui, illustriamo l'accuratezza di questa tecnica analizzando gli stati di attivazione multipli dei macrofagi in risposta al loro microambiente.

Whole-cell MALDI-TOF spettrometria di massa è un metodo accurato e rapido per analizzare diverse modalità di attivazione dei macrofagi

Un protocollo di estrazione proteina comune con tampone di urea / tiourea / SDS per il tessuto cerebrale umano e topi permette indentification delle proteine ​​da 2D-DIGE e la loro successiva caratterizzazione mediante mini 2DE immunoblotting. Questo metodo permette di ottenere risultati più riproducibili e affidabili da biopsie umane e modelli sperimentali.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Qui si descrive un protocollo che le coppie due tecniche di proteomica, cioè 2-dimensionale elettroforesi (2DE) e spettrometria di massa (MS), per identificare differenzialmente espressi / proteine ​​modificate post-traduzionali tra due o più gruppi di campioni elementari. Questo approccio, insieme a esperimenti funzionali, permette l'identificazione e la caratterizzazione di marcatori prognostici / bersagli terapeutici.

Da un 2DE-Gel Spot Proteine ​​Funzione: Lesson Learned From HS1 nella leucemia linfocitica cronica

La riprogrammazione metabolica è una caratteristica e un prerequisito per la polarizzazione dei macrofagi M1 e M2. Questo manoscritto descrive un test per la misurazione dei parametri fondamentali della glicolisi e della funzione mitocondriale nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo. Questo strumento può essere applicato per studiare come particolari fattori influenzano il metabolismo e il fenotipo del macrofago.

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

Questo protocollo consente un ricercatore di isolare e caratterizzare residente in tessuto hallmark macrofagi in vari tessuti infiammati estratte dai modelli indotta da dieta di disordini metabolici.

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Qui, presentiamo un'elettroforesi bidimensionale (2DE) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) per separare e identificare adenoma pituitario umano tessuto proteoma, che presenta un modello 2DE buona e riproducibili. Molte proteine sono osservati in ogni spot 2DE analizzando nel complesso cancro proteoma con l'uso di MS ad alta sensibilità.

Elettroforesi bidimensionale accoppiata con spettrometria di massa per un'analisi del proteoma di tessuto umano Adenoma pituitario

Vi presentiamo un protocollo per ottenere le firme di proteomica dei macrofagi umani e da applicare per determinare l'impatto di un ambiente di ossigeno basso sulla polarizzazione del macrofago.

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Descriviamo il nostro protocollo per la misurazione dei ritmi biologici nel catabolismo proteico tramite l'autofagia e il proteasome nel fegato di topo.

Misurazione dei ritmi diurni nel flusso autofagico e proteasomico

Qui, presentiamo un protocollo per profilare l'interazione tra ospite e agente patogeno durante l'infezione da proteomica a base di spettrometria di massa. Questo protocollo utilizza la quantificazione senza etichette per misurare i cambiamenti nell'abbondanza proteica sia dell'ospite (ad esempio, macrofagi) che dell'agente patogeno (ad esempio, Cryptococcus neoformans)in un singolo esperimento.

Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

Scopri l'analisi del profilo proteico dei macrofagi umani M1 e M2 mediante elettroforesi bidimensionale differenziale su gel. Questa tecnica sensibile rivela variazioni proteiche essenziali per studi su campioni umani.

Proteomica Profiling dei macrofagi da 2D elettroforesi

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