La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare oggettivamente i parametri sinaptici, tra cui la dimensione delle sinapsi, la frammentazione e la densità relativa delle proteine nella membrana postsinaptica. Ciò si ottiene sezionando prima il muscolo di interesse dagli animali da esperimento. Successivamente, il muscolo sezionato viene criosezionato e le sezioni vengono colorate immuno per la microscopia a fluorescenza.

Quindi, su phos, le immagini delle giunzioni neuromuscolari dei diversi gruppi di trattamento vengono campionate oggettivamente e viene quantificata l'intensità relativa della colorazione per le specializzazioni sinaptiche. In definitiva, la microscopia confocale ottiene misure quantitative riproducibili degli effetti di un trattamento o di una modificazione genetica sull'organizzazione strutturale della giunzione neuromuscolare. Ebbene, questo metodo fornisce protocolli oggettivi standardizzati utilizzando la microscopia confocale per valutare i cambiamenti nella struttura della giunzione neuromuscolare in modelli murini di disturbi come la miastenia grave e la malattia del motoneurone.

In generale, le persone che tentano questo metodo possono avere difficoltà perché il campionamento delle NPLS al microscopio confocale in modo imparziale e oggettivo richiede una pianificazione Dopo il campionamento, l'analisi delle NPLS deve essere condotta in modo coerente e riproducibile, laddove la variabilità da animale ad animale tra i parametri nplate può rendere difficile questa operazione. Dopo aver isolato la criosezione e la colorazione immunofluorescente, le giunzioni neuromuscolari del topo o njs, secondo il protocollo di testo, accecano i vetrini etichettando ciascuno di essi con un numero casuale che rimane noto solo a un secondo ricercatore fino al completamento della quantificazione dei parametri NMJ. Posizionare un vetrino sul tavolino del microscopio e utilizzare un filtro trit C per visualizzarlo con illuminazione ad ampio campo.

Spostarsi progressivamente attraverso i campi da sinistra a destra e indietro fino a quando non appare una piastra terminale nel campo con il foro stenopeico confocale impostato su 1.0 unità ariosa e, utilizzando una bassa potenza laser, ottimizzare i livelli di guadagno e offset per trit C rosso BGT sulla piastra terminale da riprendere. Successivamente, utilizzando il laser a 488 nanometri, ottimizzare la fluorescenza C di adattamento, che rappresenta la sinaptofisina, quindi raccogliere una pila Z della piastra terminale con un intervallo di 0,7 micron tra ciascuna fetta ottica. Salvare le immagini con un nome file che includa la data della sessione di imaging, il nome in codice del vetrino e il numero della piastra terminale.

Ripetere la procedura di campionamento e imaging appena dimostrata fino a quando non vengono raccolte 20 piastre terminali dal vetrino o dal campione. E poi ripetere il processo per i vetrini codificati rimanenti con le stesse impostazioni confocali. Scatta alcune immagini dalla diapositiva di controllo.

Usa l'immagine J freeware per aprire uno Zack e in un canale fluorescente, prepara un'immagine di massima proiezione. Salva le proiezioni come file TIF con il nome del file, inclusa la data della sessione dell'immagine, il codice di campionamento, il numero della piastra finale e il canale fluorescente. Ora usa l'immagine J per aprire la proiezione Z.

Seleziona il recettore dell'acetilcolina o il canale dell'immagine A CHR e seleziona il tipo di immagine a otto bit per convertire l'immagine colorata RGB a 24 bit in un'immagine in scala di grigi a otto bit sullo schermo con lo strumento poligono. Nel canale rosso della colorazione BGT, disegnare un contorno approssimativo attorno alla piastra terminale di interesse, escludendo qualsiasi colorazione che non abbia origine dalla piastra terminale di interesse. Selezionare la soglia di regolazione dell'immagine per applicare una soglia di intensità minima all'immagine.

Regolare il livello di soglia per isolare le parti macchiate A CHR escludendo il segnale di fondo circostante come sottosoglia. Quindi apri una seconda finestra con l'immagine originale a toni pieni per il confronto. Per confermare le impostazioni di soglia con il contorno del poligono ancora presente, selezionare analizza, analizza particelle nel menu a comparsa.

Specificare l'intervallo di dimensioni in numero di pixel da 50 a infinito, eliminando la selezione di piccoli artefatti derivanti dal rumore elettrico. Nel moltiplicatore di foto, fare clic su analizza particelle per generare una finestra con un elenco di aree sopra soglia discrete e i loro valori di intensità di fluorescenza numerati come appaiono nell'immagine binaria. Copia questi dati in un foglio di calcolo etichettato per misurare l'area totale della piastra terminale.

All'interno del poligono, selezionare Analizza misura, copiare e incollare i dati per le aree e le intensità CHR A in un foglio di calcolo con colonne etichettate. Passa al canale della sinaptofisina. Preparare un'immagine di massima proiezione.

Selezionare un'area di interesse e impostare la soglia minima di intensità come appena dimostrato. Per misurare l'area di sovrapposizione, applicare i seguenti passaggi. Apri il file originale contenente le due immagini del canale e seleziona le pile di immagini.

Impila le immagini per dividerle in due immagini separate. Utilizzando il plug-in di colocalizzazione dell'immagine J, selezionare la colocalizzazione del plug-in e inserire i valori di soglia precedentemente registrati per il CHR A e i canali nervi nella rispettiva casella di query del canale. Il risultato è un'immagine sovrapposta in pixel bianchi.

Converti l'immagine di sovrapposizione appena creata in un formato in scala di grigi e applica una soglia al valore massimo, che selezionerà solo i pixel bianchi corrispondenti all'area di sovrapposizione dei due canali precedenti. Registra nel foglio di calcolo il valore dell'area risultante della colocalizzazione, che rappresenta l'area di sovrapposizione in pixel, prepara un foglio di calcolo dei dati. I mezzi campionari calcolano e tracciano le deviazioni standard e gli errori standard come istogrammi o grafici a dispersione.

Tracciare e tracciare le aree CHR A come grafici a dispersione o istogrammi di frequenza per determinare se i dati sono normalmente distribuiti prima dei test statistici. Dopo aver preparato la colorazione immunofluorescente e l'imaging delle sezioni trasversali delle fibre muscolari come descritto nel protocollo di testo, aprire un file di immagine originale e durante la visualizzazione del canale CHR A, selezionare le pile di immagini impilare le immagini per dividere i canali selezionare il tipo di immagine a otto bit per convertire il formato della scala di grigi a otto bit sullo schermo. Fallo per entrambi i canali di fluorescenza.

Seleziona immagini impila le immagini da impilare e apre una nuova pila da due immagini a otto bit precedentemente separate, che consente di passare da un canale di fluorescenza all'altro all'interno di una singola finestra con lo strumento poligono. Tracciare una linea stretta attorno al confine della colorazione A CHR, selezionare analizza misura per misurare l'intensità media per A CHR all'interno dell'area chiusa. Copia questo valore in un foglio di calcolo etichettato mantenendo il contorno del poligono.

Passare al secondo canale di fluorescenza e selezionare Analizza misura. Ciò produrrà la colorazione media per la proteina di interesse all'interno dell'area sinaptica definita dalla colorazione A CHR. Scegliere un'area lontana dalle macchie visibili della placca terminale.

Quindi selezionare analizza misura per misurare l'intensità media della fluorescenza di fondo. Ripetere la misurazione per gli altri canali di fluorescenza e copiare i valori di fondo nel foglio di calcolo dei valori di fluorescenza. Sottrarre i valori medi di fondo dai valori della placca terminale per ottenere le intensità corrette per A CHR e la proteina di interesse in ciascuna placca terminale.

Infine, dividere i valori corretti di intensità nplate per la proteina di interesse per l'intensità di fluorescenza BGT corretta per ottenere i rapporti di intensità di fluorescenza come mostrato qui. L'intensità della fluorescenza sia per l'A CHR che per la sinaptofisina aumenta bruscamente al confine tra la porzione sinaptica e sinaptica PERS della piastra terminale del motore. Per tali immagini, una soglia minima isolerà facilmente l'area ricca di CHR A o ricca di sinaptofisina della piastra terminale.

Come dimostrato in questa figura in topi anziani e in alcuni stati patologici, la colorazione della placca terminale per la sinaptofisina può essere meno intensa. I bordi di un cluster CHR possono apparire sfocati e possono esserci livelli più elevati di livelli extra sinaptici I grafici a dispersione di autofluorescenza rivelano un intervallo considerevole nell'area ricca di A CHR tra le placche terminali del muscolo tibiale anteriore di ogni singolo topo. Tuttavia, l'area CHR media A basata su 15-20 immagini della placca frontale era simile tra sette topi campione Nelle sezioni trasversali, l'achr della placca terminale appare tipicamente come una forma a mezzaluna, ma questa forma è spesso irregolare come illustrato qui.

La fluorescenza di fondo a bassa intensità, come mostrato qui sul canale della sinaptofisina, di solito rivela se una macchia di colorazione A CHR rappresenta una singola placca terminale o due placche terminali separate situate su fibre muscolari adiacenti. Inoltre, molte proteine sinaptiche come rapson, muschio e beta distro glicano sono co-localizzate con un CHR a livello della nplate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante che gli sperimentatori rimangano ciechi ai gruppi di trattamento e genotipo durante il campionamento e l'analisi delle immagini nplate.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere, campionare e analizzare le immagini fluorescenti confocali delle giunzioni neuromuscolari. In definitiva, i ricercatori dovrebbero essere in grado di confrontare in modo coerente e oggettivo diversi parametri strutturali della nplate tra diversi gruppi di trattamento e genotipi.