Name: La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: Scopri come quantificare parametri sinaptici come dimensione, frammentazione e densità proteica nella membrana postsinaptica della giunzione neuromuscolare utilizzando microscopia confocale a fluorescenza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal National Health and Medical Research Council [570930]. L'imaging è stato effettuato presso la Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Si ringraziano gli ex membri del laboratorio, il cui lavoro è citato, per il loro contributo allo sviluppo di questi metodi.

<ol><li>Schmidt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin%2FErbB+regulate+neuromuscular+junction+development+by+phosphorylation+of+%CE%B1-dystrobrevin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin.</a> J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).</li>
<li>Amenta, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biglycan+is+an+extracellular+MuSK+binding+protein+important+for+synapse+stability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biglycan is an extracellular MuSK binding protein important for synapse stability.</a> J Neurosci. 32, 2324-2334 (2012).</li>
<li>Samuel, M. A., Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrin+and+Synaptic+Laminin+Are+Required+to+Maintain+Adult+Neuromuscular+Junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Agrin and Synaptic Laminin Are Required to Maintain Adult Neuromuscular Junctions.</a> PLOS ONE. 7, e46663(2012).</li>
<li>Valdez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+age-related+changes+in+mouse+neuromuscular+synapses+by+caloric+restriction+and+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise.</a> Proc Natl Acad Sci (USA). 107, 14863-14868 (2010).</li>
<li>Yampolsky, P., Pacifici, P. G., Witzemann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+muscle-driven+synaptic+remodeling+in+the+neuromuscular+junction+after+denervation%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Differential muscle-driven synaptic remodeling in the neuromuscular junction after denervation).</a> Eur J Neurosci. 31, 646-658 (2010).</li>
<li>Li, Y., Lee, Y., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+Aging+Mouse+Neuromuscular+Junctions+Are+Explained+by+Degeneration+and+Regeneration+of+Muscle+Fiber+Segments+at+the+Synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Changes in Aging Mouse Neuromuscular Junctions Are Explained by Degeneration and Regeneration of Muscle Fiber Segments at the Synapse.</a> J Neurosci. 31, 14910-14919 (2011).</li>
<li>Zhu, H., Bhattacharyya, B. J., Lin, H., Gomez, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+IP3R1+receptors+amplify+physiological+and+pathological+synaptic+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle IP3R1 receptors amplify physiological and pathological synaptic calcium signals.</a> J Neurosci. 31, 15269-15283 (2011).</li>
<li>Valdez, G., Tapia, J. C., Lichtman, J. W., Fox, M. A., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+resistance+to+aging+and+ALS+in+neuromuscular+junctions+of+specific+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Shared resistance to aging and ALS in neuromuscular junctions of specific muscles.</a> PLoS ONE. 7, e34640(2012).</li>
<li>Perez-Garcia, M. J., Burden, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+MuSK+Activity+Delays+Denervation+and+Improves+Motor+Function+in+ALS+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Increasing MuSK Activity Delays Denervation and Improves Motor Function in ALS Mice.</a> Cell reports. 2, 1-6 (2012).</li>
<li>Klooster, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+kinase+myasthenia+gravis+IgG4+autoantibodies+cause+severe+neuromuscular+junction+dysfunction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice.</a> Brain. 135, 1081-1101 (2012).</li>
<li>Pratt, S. J., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591, 559-570 (2013).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490, 187-191 (2012).</li>
<li>Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+ratio+of+rapsyn+to+ACh+receptor+stabilizes+postsynaptic+receptors+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Increased ratio of rapsyn to ACh receptor stabilizes postsynaptic receptors at the mouse neuromuscular synapse.</a> J Physiol. 562, 673-685 (2005).</li>
<li>Gervásio, O. L., Armson, P. F., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+increase+in+the+amount+of+rapsyn+per+acetylcholine+receptor+promotes+postsynaptic+receptor+packing+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Developmental increase in the amount of rapsyn per acetylcholine receptor promotes postsynaptic receptor packing and stability.</a> Dev Biol. 305, 262-275 (2007).</li>
<li>Brockhausen, J., Cole, R. N., Gervásio, O. L., Ngo, S. T., Noakes, P. G., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+agrin+increases+postsynaptic+ACh+receptor+packing+by+elevating+rapsyn+protein+at+the+mouse+neuromuscular+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural agrin increases postsynaptic ACh receptor packing by elevating rapsyn protein at the mouse neuromuscular synapse.</a> Dev Neurobiol. 68, 1153-1169 (2008).</li>
<li>Cole, R. N., Reddel, S. W., Gervásio, O. L., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-MuSK+patient+antibodies+disrupt+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-MuSK patient antibodies disrupt the mouse neuromuscular junction.</a> Ann Neurol. 63, 782-789 (2008).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+cause+synaptic+failure+through+progressive+wastage+of+postsynaptic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies cause synaptic failure through progressive wastage of postsynaptic acetylcholine receptors.</a> Exp Neurol. 237, 237-286 (2012).</li>
<li>Cole, R. N., Ghazanfari, N., Ngo, S. T., Gervasio, O. L., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+autoantibodies+deplete+postsynaptic+Muscle+Specific+Kinase+leading+to+disassembly+of+the+ACh+receptor+scaffold+and+myasthenia+gravis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patient autoantibodies deplete postsynaptic Muscle Specific Kinase leading to disassembly of the ACh receptor scaffold and myasthenia gravis in mice.</a> J Physiol. 588, 3217-3229 (2010).</li>
<li>Viegas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passive+and+active+immunization+models+of+MuSK-Ab+positive+myasthenia%3A+Electrophysiological+evidence+for+pre+and+postsynaptic+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Passive and active immunization models of MuSK-Ab positive myasthenia: Electrophysiological evidence for pre and postsynaptic defects.</a> Exp Neurol. 234, 506-512 (2012).</li>
<li>Morsch, M., Reddel, S. W., Ghazanfari, N., Toyka, K. V., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyridostigmine+but+not+3%2C4-diaminopyridine+exacerbates+ACh+receptor+loss+and+myasthenia+induced+in+mice+by+Muscle+Specific+Kinase+autoantibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pyridostigmine but not 3,4-diaminopyridine exacerbates ACh receptor loss and myasthenia induced in mice by Muscle Specific Kinase autoantibody.</a> J Physiol. 591, 2747-2762 (2013).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Reddel, S. W., Liang, S. X., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase+autoantibodies+suppress+the+MuSK+pathway+and+ACh+receptor+retention+at+the+mouse+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase autoantibodies suppress the MuSK pathway and ACh receptor retention at the mouse neuromuscular junction.</a> J Physiol. 592, 2881-2897 (2014).</li>
<li>Cheng, A., Morsch, M., Murata, Y., Ghazanfari, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+age-associated+changes+to+the+mouse+neuromuscular+junction+and+the+protective+effects+of+voluntary+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Sequence of age-associated changes to the mouse neuromuscular junction and the protective effects of voluntary exercise.</a> PLoS One. 8, e67970(2013).</li>
<li>Schaefer, A. M., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compensatory+subpopulation+of+motor+neurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">A compensatory subpopulation of motor neurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Comp Neurol. 490, 209-219 (2005).</li>
<li>Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+bioscience+research+reporting%3A+the+ARRIVE+guidelines+for+reporting+animal+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLos+Biol%22%5BJournal%5D)">Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research.</a> PLos Biol. 8, e1000412(2010).</li>
<li>Shimizu, S. Routes of Administration. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Hedrich, H. J., Bullock, G. , Elsevier. (2004).</li>
<li>Chiasson, R. B. Laboratory anatomy of the white rat. , Brown. Dubuque, Iowa. (1988).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Mitra, A. K., Stroud McCarthy, M. P., M, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+location+of+the+major+associated+43-kD+cytoskeletal+protein%2C+determined+at+22A+by+low+dose+electron+microscopy+and+x-ray+diffraction+to+12.5A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structure of the nicotinic acetylcholine receptor and location of the major associated 43-kD cytoskeletal protein, determined at 22A by low dose electron microscopy and x-ray diffraction to 12.5A.</a> J Cell Biol. 109, 755-774 (1989).</li>
<li>Paas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopic+evidence+for+nucleation+and+growth+of+3D+acetylcholine+receptor+microcrystals+in+structured+lipid-detergent+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Electron microscopic evidence for nucleation and growth of 3D acetylcholine receptor microcrystals in structured lipid-detergent matrices.</a> Proc. Natl Acad. Sci. (USA). 100, 11309-11314 (2003).</li>
<li>Samson, A. O., Scherf, T., Eisenstein, M., Chill, J. H., Anglister, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+for+acetylhcoline+receptor+inhibition+by+%CE%B1-neurotoxins+and+species-specific+resistance+to+%CE%B1-bungarotoxin+revealed+by+NMR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mechanism for acetylhcoline receptor inhibition by α-neurotoxins and species-specific resistance to α-bungarotoxin revealed by NMR).</a> Neuron. 35, 319-332 (2002).</li>
<li>Ghazanfari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+Specific+Kinase%3A+Organiser+of+synaptic+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle Specific Kinase: Organiser of synaptic membrane domains.</a> Int J Biochem Cell Biol. 43, 295-298 (2011).</li>
<li>Ghazanfari, N., Morsch, M., Tse, N., Reddel, S. W., Phillips, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+%CE%B22-adrenoceptor+agonist%2C+albuterol%2C+in+a+mouse+model+of+anti-MuSK+myasthenia+gravis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Effects of the β2-adrenoceptor agonist, albuterol, in a mouse model of anti-MuSK myasthenia gravis.</a> PLoS ONE. 9, e87840(2014).</li>
<li>Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+diaphragm+neuromuscular+junctions+on+different+fibre+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types.</a> J Neurocytol. 25, 88-100 (1996).</li>
<li>Salpeter, M. M., Harris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+turnover+rate+of+acetylcholine+receptors+throughout+the+junction+folds+at+a+vertebrate+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and turnover rate of acetylcholine receptors throughout the junction folds at a vertebrate neuromuscular junction.</a> J Cell Biol. 96, 1781-1785 (1983).</li>
<li>Soper, S. A., Nutter, H. L., Keller, R. A., Davis, L. M., Shera, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photophysical+constants+of+several+fluorescent+dyes+pertaining+to+ultrasensitive+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">The photophysical constants of several fluorescent dyes pertaining to ultrasensitive fluorescence spectroscopy.</a> Photochem Photobiol. 57, 972-977 (1993).</li>
<li>Panchuk-Voloshina, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alexa+dyes%2C+a+series+of+new+fluorescent+dyes+that+yield+exceptionally+bright%2C+photostable+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates.</a> J Histochem Cytochem. 47, 1179-1188 (1999).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I protocolli descritti qui ci hanno permesso di misurare in modo affidabile e quantificare i cambiamenti nelle proprietà del NMJ tutta una serie di condizioni, tra cui l&#39;invecchiamento e le malattie normali stati. I metodi descritti per en face immagini NMJ consentiranno ai ricercatori di confrontare l&#39;area di specializzazioni pre- e post-sinaptici e la zona di sinaptica sovrapposizione / allineamento. Per confrontare l&#39;intensità relativa di proteine ​​pre- e post-sinaptici il secondo protocollo, che utilizz...

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi relè critico che media la comunicazione tra il sistema nervoso e muscolo scheletrico. E &#39;richiesto per tutti i movimenti volontari. La microscopia a fluorescenza è stato a lungo utilizzato per studiare gli effetti della transgeni del mouse NMJ 1-3 o per confrontare gli effetti di età, la dieta, esercizio fisico e le malattie sul NMJs roditori 4-11. Tali studi hanno insegnato molto sulla fisiologia e fisiopatologia della NMJ, ma i diversi parametri segnalati (ad esempio, zona AChR, zona endplate, la lunghezza del perimetro, indici di frammentazione) spesso rendono difficile il confronto dei risultati di questi studi. C&#39;è un&#39;aspettativa crescente per i ricercatori pre-clinici per essere in grado di dimostrare la riproducibilità, in particolare in studi con modelli di roditori di malattia 12. I protocolli descritti qui sono state affinate attraverso una serie di studi che ha indagato sviluppo, fisiologico e fisiopatologico changes al NMJ. Tali studi richiedono misurazione della zona di specializzazioni sinaptiche alla placca motore mouse e la densità relativa di imballaggio, di proteine ​​sinaptiche all&#39;interno specializzazioni postsinaptici 13-15. L&#39;utilità di questi metodi è illustrato da studi recenti in un modello murino di anti-MuSK miastenia gravis. Iniezioni giornaliere di IgG da miastenia anti-MuSK-positivi gravis pazienti in topi adulti hanno causato loro di diventare deboli entro 2 settimane 16. Confocale immagini di massima proiezione di sezioni muscolari che sono stati doppio etichettati per sinaptofisina (in nervosi terminali) e post-sinaptici AChRs rivelato un progressivo declino nella zona del recettore colorazione come il cambiamento primario. È importante sottolineare che il tasso di declino è stato sufficiente a spiegare calo comparabili in ampiezza dei potenziali sinaptici, il fallimento della trasmissione sinaptica e debolezza muscolare 17,18. Qualitativamente Risultati simili sono stati riportati da altri gruppi di ricerca10,19. Gli stessi metodi di misurazione NMJ allora sono stati utilizzati per valutare l&#39;impatto di tre farmaci per il trattamento anti-MuSK miastenia grave in questo modello di topo 20,21. Invecchiamento sedentario può portare alla perdita di connessioni neuromuscolari. I protocolli descritti hanno rivelato un declino associato all&#39;età in materia di terminazione nervosa synaptophysin a placche motrici come topi progrediscono in età avanzata. Gli stessi metodi hanno rivelato che l&#39;esercizio fisico volontario potrebbe in gran parte prevenire la riduzione della zona terminale nervoso presinaptico 22, in linea con il lavoro precedente di altri gruppi 4. La perdita delle connessioni neuromuscolari si verifica anche nel modello murino SOD1G93A di sclerosi laterale amiotrofica 9,23. Gli studi di cui sopra dimostrano che una varietà di condizioni di salute può portare a riduzioni in materia di specializzazioni sia pre o post-sinaptici al NMJ. Ciò può comportare divertimento sinaptica alterataction o può preannunciare la perdita completa della connessione neuromuscolare. Tre protocolli sono descritte che permettono quantificazione della superficie e la densità di specializzazioni sinaptici. Lo scopo del primo protocollo è quello di fornire una misura pratica e riproducibile delle aree di pre e post-sinaptici specializzazioni e il loro allineamento a NMJs di mammifero, utilizzando microscopia a fluorescenza. Bidimensionali immagini massimi proiezione confocale e analisi di immagine con NIH ImageJ è utilizzato per rilevare i cambiamenti nel settore della sinaptofisina colorazione (vescicole sinaptiche), AChRs post-sinaptici e area di sovrapposizione sinaptica. Parametri confocale (gain e offset di livello) sono ottimizzati per ogni NMJ in modo da massimizzare le informazioni visive utilizzate per discernere l&#39;area di specializzazione sinaptica. Insufficienza neuromuscolare può anche derivare da variazioni di densità del recettore postsynaptic e / o di altre proteine ​​sinaptiche. Il secondo protocollo può essere applicata per rilevare variazioni nella densità relativa di proteine ​​postsinaptici talicome muschio, rapsyn, distroglicano, fosforilata Src chinasi e fosforilata AChR 18,21. In miastenia grave, una densità ridotta del recettore nella membrana post-sinaptica è la causa immediata del fallimento sinaptica e debolezza muscolare. Il terzo protocollo descrive un metodo Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per valutare i cambiamenti in prossimità di AChRs adiacenti all&#39;interno delle membrane postsinaptiche 14,15. Questo metodo rileva il trasferimento di energia tra AChRs vicini etichettati con fluorescenti-α-bungarotossina (BGT). FRET avviene solo quando le sonde donatore e accettore fluorescenti sono meno di 10 nm a parte. Questo può rivelare (submicroscopiche) delle modifiche, la tenuta di AChR imballaggio che possono riguardare direttamente l&#39;ampiezza dei potenziali sinaptici. Questi tre protocolli, raffinati negli ultimi dieci anni, prevedono misure complementari di integrità NMJ in modo coerente e riproducibile. L&#39;utilizzo di protocolli standardizzati unParametri nd dovrebbero facilitare il confronto degli effetti di geni e interventi ambientali su mammifero NMJ.

<table><tbody><tr><td>Microscopio confocale a scansione</td><td>Leica</td><td>DM 2000 con&nbsp; Sistema TCS SP2</td><td>La maggior parte dei microscopi confocali a scansione dovrebbe essere adatta.</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>LSM 510 Meta&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SPE-II</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555-a-bungarotossina (rosso-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35451</td><td>Utilizzato per l'etichettatura AChRs</td></tr><tr><td>Alexa647-&alpha;-bungarotossina (far-red-BGT)</td><td>Life technologies</td><td>B35450</td><td>Fluorescenza rossa lontana: appena visibile attraverso l'oculare&nbsp;</td></tr><tr><td>coniglio anti-sinaptofisina</td><td>Life technologies</td><td>18-0130</td><td>Diversi lotti di anticorpi primari differiscono per l'efficace diluizione di lavoro</td></tr><tr><td>FITC-anti-rapsyn mab1234</td><td>Milipore</td><td>FCMAB134F</td><td>Anticorpo monoclonale coniugato a FITC</td></tr><tr><td>FITC-asino anti-coniglio IgG</td><td>Jackson</td><td>711-095-152</td><td>Gli anticorpi policlonali secondari possono variare in qualità a seconda della fonte e del lotto</td></tr><tr><td>Temperatura di taglio ottimale composto (O.T.C.)</td><td>ProSciTech</td><td>IA018</td><td>Matrice di inclusione del criostato per il congelamento dei muscoli</td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Sigma</td><td>10981</td><td>Mezzo di montaggio che rallenta il fotosbiancamento dei fluorofori</td></tr></tbody></table>

la giunzione neuromuscolare: synapse misurazione circonferenza, la frammentazione e variazioni synaptic proteine ​​densità uso confocale microscopia a fluorescenza

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è il grande, sinapsi relè colinergici attraverso cui i neuroni motori mammiferi controllano la contrazione muscolare volontaria. I cambiamenti strutturali del NMJ possono causare insufficienza neurotrasmissione, con conseguente debolezza, atrofia e persino la morte della fibra muscolare. Molti studi hanno indagato come modificazioni genetiche o malattie possono alterare la struttura del NMJ mouse. Purtroppo, può essere difficile confrontare direttamente i risultati di questi studi, perché spesso utilizzati diversi parametri e metodi analitici. Tre protocolli sono descritte qui. Il primo utilizza massima intensità di proiezione immagini confocale per misurare l&#39;area di acetilcolina recettore (AChR) ricchi di domini di membrana postsinaptici alla placca e la zona della vescicola sinaptica colorazione nella terminazione nervosa presinaptica sovrastante. Il secondo protocollo confronta le intensità relative di immunocolorazione per proteine ​​sinaptiche nella membrana postsinaptica. Il terzo protocol utilizza Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per rilevare i cambiamenti nel confezionamento di AChRs postsinaptici alla placca. Sono stati sviluppati e raffinato in una serie di studi I protocolli. I fattori che influenzano la qualità e la coerenza dei risultati vengono discussi e dati normativi sono previste NMJs in soggetti sani giovani topi adulti.

Misura di Synaptic Area al NMJ Qualsiasi stima della zona si basa sul disegno di un contorno per definire l'estensione di specializzazioni sinaptici. Nei giovani adulti sani muscoli immagini NMJ dovrebbero visualizzare i confini ben definiti sia per AChR e synaptophysin colorazione (Figura 2A e B). Intensità di fluorescenza sia per AChR e synaptophysin aumenta sensibilmente al confine tra la porzione peri-sinaptica e sinaptica del endplate m...

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è alterata in una varietà di condizioni che a volte possono culminare in un fallimento sinaptico. Questo rapporto descrive i metodi basati sul microscopio a fluorescenza per quantificare tali cambiamenti strutturali.

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare oggettivamente i parametri sinaptici, tra cui la dimensione delle sinapsi, la frammentazione e la densità relativa delle proteine nella membrana postsinaptica. Ciò si ottiene sezionando prima il muscolo di interesse dagli animali da esperimento. Successivamente, il muscolo sezionato viene criosezionato e le sezioni vengono colorate immuno per la microscopia a fluorescenza.Quindi, su phos, le immagini delle giunzioni neuromuscolari dei diversi gruppi di trattamento vengono campionate oggettivamente e viene quantificata l'intensità relativa della colorazione per le specializzazioni sinaptiche. In definitiva, la microscopia confocale ottiene misure quantitative riproducibili degli effetti di un trattamento o di una modificazione genetica sull'organizzazione strutturale della giunzione neuromuscolare. Ebbene, questo metodo fornisce protocolli oggettivi standardizzati utilizzando la microscopia confocale per valutare i cambiamenti nella struttura della giunzione neuromuscolare in modelli murini di disturbi come la miastenia grave e la malattia del motoneurone.In generale, le persone che tentano questo metodo possono avere difficoltà perché il campionamento delle NPLS al microscopio confocale in modo imparziale e oggettivo richiede una pianificazione Dopo il campionamento, l'analisi delle NPLS deve essere condotta in modo coerente e riproducibile, laddove la variabilità da animale ad animale tra i parametri nplate può rendere difficile questa operazione. Dopo aver isolato la criosezione e la colorazione immunofluorescente, le giunzioni neuromuscolari del topo o njs, secondo il protocollo di testo, accecano i vetrini etichettando ciascuno di essi con un numero casuale che rimane noto solo a un secondo ricercatore fino al completamento della quantificazione dei parametri NMJ. Posizionare un vetrino sul tavolino del microscopio e utilizzare un filtro trit C per visualizzarlo con illuminazione ad ampio campo.Spostarsi progressivamente attraverso i campi da sinistra a destra e indietro fino a quando non appare una piastra terminale nel campo con il foro stenopeico confocale impostato su 1.0 unità ariosa e, utilizzando una bassa potenza laser, ottimizzare i livelli di guadagno e offset per trit C rosso BGT sulla piastra terminale da riprendere. Successivamente, utilizzando il laser a 488 nanometri, ottimizzare la fluorescenza C di adattamento, che rappresenta la sinaptofisina, quindi raccogliere una pila Z della piastra terminale con un intervallo di 0,7 micron tra ciascuna fetta ottica. Salvare le immagini con un nome file che includa la data della sessione di imaging, il nome in codice del vetrino e il numero della piastra terminale.Ripetere la procedura di campionamento e imaging appena dimostrata fino a quando non vengono raccolte 20 piastre terminali dal vetrino o dal campione. E poi ripetere il processo per i vetrini codificati rimanenti con le stesse impostazioni confocali. Scatta alcune immagini dalla diapositiva di controllo.Usa l'immagine J freeware per aprire uno Zack e in un canale fluorescente, prepara un'immagine di massima proiezione. Salva le proiezioni come file TIF con il nome del file, inclusa la data della sessione dell'immagine, il codice di campionamento, il numero della piastra finale e il canale fluorescente. Ora usa l'immagine J per aprire la proiezione Z.Seleziona il recettore dell'acetilcolina o il canale dell'immagine A CHR e seleziona il tipo di immagine a otto bit per convertire l'immagine colorata RGB a 24 bit in un'immagine in scala di grigi a otto bit sullo schermo con lo strumento poligono. Nel canale rosso della colorazione BGT, disegnare un contorno approssimativo attorno alla piastra terminale di interesse, escludendo qualsiasi colorazione che non abbia origine dalla piastra terminale di interesse. Selezionare la soglia di regolazione dell'immagine per applicare una soglia di intensità minima all'immagine.Regolare il livello di soglia per isolare le parti macchiate A CHR escludendo il segnale di fondo circostante come sottosoglia. Quindi apri una seconda finestra con l'immagine originale a toni pieni per il confronto. Per confermare le impostazioni di soglia con il contorno del poligono ancora presente, selezionare analizza, analizza particelle nel menu a comparsa.Specificare l'intervallo di dimensioni in numero di pixel da 50 a infinito, eliminando la selezione di piccoli artefatti derivanti dal rumore elettrico. Nel moltiplicatore di foto, fare clic su analizza particelle per generare una finestra con un elenco di aree sopra soglia discrete e i loro valori di intensità di fluorescenza numerati come appaiono nell'immagine binaria. Copia questi dati in un foglio di calcolo etichettato per misurare l'area totale della piastra terminale.All'interno del poligono, selezionare Analizza misura, copiare e incollare i dati per le aree e le intensità CHR A in un foglio di calcolo con colonne etichettate. Passa al canale della sinaptofisina. Preparare un'immagine di massima proiezione.Selezionare un'area di interesse e impostare la soglia minima di intensità come appena dimostrato. Per misurare l'area di sovrapposizione, applicare i seguenti passaggi. Apri il file originale contenente le due immagini del canale e seleziona le pile di immagini.Impila le immagini per dividerle in due immagini separate. Utilizzando il plug-in di colocalizzazione dell'immagine J, selezionare la colocalizzazione del plug-in e inserire i valori di soglia precedentemente registrati per il CHR A e i canali nervi nella rispettiva casella di query del canale. Il risultato è un'immagine sovrapposta in pixel bianchi.Converti l'immagine di sovrapposizione appena creata in un formato in scala di grigi e applica una soglia al valore massimo, che selezionerà solo i pixel bianchi corrispondenti all'area di sovrapposizione dei due canali precedenti. Registra nel foglio di calcolo il valore dell'area risultante della colocalizzazione, che rappresenta l'area di sovrapposizione in pixel, prepara un foglio di calcolo dei dati. I mezzi campionari calcolano e tracciano le deviazioni standard e gli errori standard come istogrammi o grafici a dispersione.Tracciare e tracciare le aree CHR A come grafici a dispersione o istogrammi di frequenza per determinare se i dati sono normalmente distribuiti prima dei test statistici. Dopo aver preparato la colorazione immunofluorescente e l'imaging delle sezioni trasversali delle fibre muscolari come descritto nel protocollo di testo, aprire un file di immagine originale e durante la visualizzazione del canale CHR A, selezionare le pile di immagini impilare le immagini per dividere i canali selezionare il tipo di immagine a otto bit per convertire il formato della scala di grigi a otto bit sullo schermo. Fallo per entrambi i canali di fluorescenza.Seleziona immagini impila le immagini da impilare e apre una nuova pila da due immagini a otto bit precedentemente separate, che consente di passare da un canale di fluorescenza all'altro all'interno di una singola finestra con lo strumento poligono. Tracciare una linea stretta attorno al confine della colorazione A CHR, selezionare analizza misura per misurare l'intensità media per A CHR all'interno dell'area chiusa. Copia questo valore in un foglio di calcolo etichettato mantenendo il contorno del poligono.Passare al secondo canale di fluorescenza e selezionare Analizza misura. Ciò produrrà la colorazione media per la proteina di interesse all'interno dell'area sinaptica definita dalla colorazione A CHR. Scegliere un'area lontana dalle macchie visibili della placca terminale.Quindi selezionare analizza misura per misurare l'intensità media della fluorescenza di fondo. Ripetere la misurazione per gli altri canali di fluorescenza e copiare i valori di fondo nel foglio di calcolo dei valori di fluorescenza. Sottrarre i valori medi di fondo dai valori della placca terminale per ottenere le intensità corrette per A CHR e la proteina di interesse in ciascuna placca terminale.Infine, dividere i valori corretti di intensità nplate per la proteina di interesse per l'intensità di fluorescenza BGT corretta per ottenere i rapporti di intensità di fluorescenza come mostrato qui. L'intensità della fluorescenza sia per l'A CHR che per la sinaptofisina aumenta bruscamente al confine tra la porzione sinaptica e sinaptica PERS della piastra terminale del motore. Per tali immagini, una soglia minima isolerà facilmente l'area ricca di CHR A o ricca di sinaptofisina della piastra terminale.Come dimostrato in questa figura in topi anziani e in alcuni stati patologici, la colorazione della placca terminale per la sinaptofisina può essere meno intensa. I bordi di un cluster CHR possono apparire sfocati e possono esserci livelli più elevati di livelli extra sinaptici I grafici a dispersione di autofluorescenza rivelano un intervallo considerevole nell'area ricca di A CHR tra le placche terminali del muscolo tibiale anteriore di ogni singolo topo. Tuttavia, l'area CHR media A basata su 15-20 immagini della placca frontale era simile tra sette topi campione Nelle sezioni trasversali, l'achr della placca terminale appare tipicamente come una forma a mezzaluna, ma questa forma è spesso irregolare come illustrato qui.La fluorescenza di fondo a bassa intensità, come mostrato qui sul canale della sinaptofisina, di solito rivela se una macchia di colorazione A CHR rappresenta una singola placca terminale o due placche terminali separate situate su fibre muscolari adiacenti. Inoltre, molte proteine sinaptiche come rapson, muschio e beta distro glicano sono co-localizzate con un CHR a livello della nplate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante che gli sperimentatori rimangano ciechi ai gruppi di trattamento e genotipo durante il campionamento e l'analisi delle immagini nplate.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere, campionare e analizzare le immagini fluorescenti confocali delle giunzioni neuromuscolari. In definitiva, i ricercatori dovrebbero essere in grado di confrontare in modo coerente e oggettivo diversi parametri strutturali della nplate tra diversi gruppi di trattamento e genotipi.

the-neuromuscular-junction-measuring-synapse-size-fragmentation

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo protocollo dettagli come quantificare il numero delle sinapsi sia dissociato cultura neuronale e nelle sezioni cerebrali con immunocitochimica. Utilizzando vano anticorpi specifici, abbiamo etichetta terminali presinaptici così come i luoghi di specializzazione post-sinaptici. Si definiscono sinapsi come punti di colocalizzazione tra i segnali generati da questi marcatori.

Sinapsi quantificare: un Immunocitochimica basato su analisi per quantificare Numero Synapse

L'abbondanza dei recettori dei neurotrasmettitori a livello delle sinapsi cluster influenza fortemente la forza sinaptica. Questo metodo quantifica recettori dei neurotrasmettitori marcato in fluorescenza in tre dimensioni con un singolo sinapsi...

Quantificazione automatica di fluorescenza in Synaptic<em&gt; C. elegans</em

La giunzione neuromuscolare della Drosophila (NMJ) viene utilizzata come modello per studiare la morfologia e la funzione delle sinapsi. Questo video descrive importanti caratteristiche che i ricercatori quantificano per caratterizzare l'NMJ. Il protocollo di esempio mostra un software in grado di eseguire la quantificazione automaticamente.

drosofila Quantificazione della giunzione neuromuscolare (NMJ): un metodo per valutare la morfologia e la funzione sinaptica

Fonte: Marinello, M., et al. Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e a super-risoluzione. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra la preparazione, l'immunocolorazione e l'imaging delle giunzioni neuromuscolari nel tessuto muscolare di ratto utilizzando la microscopia confocale e a super-risoluzione per visualizzare e analizzare le strutture presinaptiche e postsinaptiche.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e a super-risoluzione

Un protocollo per accuratamente identificare e analizzare le sinapsi nelle fette hippocampal mediante immunofluorescenza è descritto in questo articolo.

Valutazione di densità di sinapsi nelle fette Hippocampal del cervello del roditore

Questo protocollo mostra come impiegare la microscopia super-risoluzione per studiare la co-localizzazione delle proteine nelle colture neuronali primarie.

Imaging super-risoluzione per studiare la co-localizzazione di proteine e marcatori sinaptici nei neuroni primari

La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.

Dissezione di fibre muscolari scheletriche singole per analisi immunofluorescenti e morfometriche di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero

Sono descritti due metodi correlati per visualizzare gli eventi subcellulari necessari per la trasmissione sinaptica. Questi protocolli consentono il monitoraggio in tempo reale della dinamica dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche utilizzando l'imaging a cellule vive di neuroni in coltura in vitro .

Misurazione fluorescente in tempo reale delle funzioni sinaptiche in modelli di sclerosi laterale amiotrofica

Questo protocollo descrive un metodo per l'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mediante microscopia combinata confocale e STED che viene utilizzata per quantificare i cambiamenti patologici in modelli murini di SMA e CMS correlati a ColQ.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e super-risoluzione

DetectSyn è un saggio fluorescente rapido e imparziale che misura i cambiamenti nel numero relativo di sinapsi (impegno pre e postsinaptico) tra trattamenti o stati patologici. Questa tecnica utilizza una tecnica di legatura di prossimità che può essere utilizzata sia nei neuroni in coltura che nei tessuti fissi.

DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi

Il protocollo descrive il metodo di caricamento di un colorante di calcio fluorescente attraverso il nervo tagliato nei terminali nervosi motori del topo. Inoltre, viene presentato un metodo unico per registrare i transitori di calcio veloci nelle terminazioni nervose periferiche utilizzando la microscopia confocale.

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Scopri come quantificare parametri sinaptici come dimensione, frammentazione e densità proteica nella membrana postsinaptica della giunzione neuromuscolare utilizzando microscopia confocale a fluorescenza.

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza (Video) | JoVE Journal

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine ​​Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza

Esplora altri video

La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza