Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo In Vitro

L'obiettivo generale della seguente procedura è valutare gli effetti di una gamma di lunghezze d'onda e intensità della terapia con luce rossa nel vicino infrarosso sullo stress ossidativo in vitro. Per fare ciò, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per fornire la luce in cui possiamo manipolare la lunghezza d'onda e l'intensità fornite. Montiamo una sorgente luminosa allo xeno o a banda larga in un alloggiamento su una base metallica, quindi posizioniamo una lente di rivestimento, un filtro per l'acqua e un'apertura d'ingresso davanti alla luce.

Il passo successivo della procedura consiste nel guidare la luce generata dalla sorgente luminosa a banda larga attraverso l'ingresso, l'apertura e la guida della luce liquida e attraverso una seconda lente di rivestimento. Quindi vengono montati filtri a larghezza di banda e densità neutra per ottenere la lunghezza d'onda e l'intensità della luce desiderate. Si noti che i filtri consentono il passaggio di una gamma ristretta di lunghezze d'onda denominata banda d'onda.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti di somministrazione della terapia della luce rossa nel vicino infrarosso, come i LED o i laser, è che consente una manipolazione precisa e calibrata su parametri di lunghezza d'onda e intensità. Questo ci permette quindi di ottimizzare l'erogazione della luce per i migliori risultati biologici che l'attuale studio somministra come alle cellule dissociate. Inoltre, può essere applicato anche ad altri sistemi come organotipici, modelli di neurotrauma.

Quando si lavora con qualsiasi sorgente luminosa a banda larga, assicurarsi di non guardare direttamente la fonte di luce in quanto potrebbe causare danni visivi permanenti. Per preparare l'apparato di erogazione della luce, collegare una sorgente luminosa a banda larga, come una lampada allo xeno o al tungsteno, a un alimentatore appropriato. Posizionare una lente di fascicolazione davanti alla sorgente luminosa per produrre un fascio di luce fascicolato.

Far passare la luce attraverso un filtro termico liquido per rimuovere la maggior parte del calore dal fascio di luce. Posizionare una lente di fascicolazione davanti alla sorgente luminosa per produrre un fascio di luce fascicolato. Far passare la luce attraverso un filtro termico liquido per rimuovere la maggior parte del calore dal fascio di luce.

A seconda dell'applicazione, focalizzare il fascio fascio fascio verso l'arture d'ingresso di una guida di luce liquida per fornire un'erogazione più flessibile della luce. All'altra estremità del conduttore di luce liquida posizionare una seconda lente di rivestimento e quindi un supporto per i filtri di interferenza e a densità neutra. Questa disposizione dovrebbe produrre un punto di luce illuminato in modo uniforme della banda d'onda e dell'intensità desiderate.

Potrebbe essere necessario variare la distanza tra l'estremità della guida di luce e il piano del campione a seconda dell'area che deve essere illuminata. È importante ricordare che, in conformità con la legge dell'inverso del quadrato, all'aumentare della distanza dall'estremità della guida luminosa, l'intensità della luce diminuirà nel presente studio. Questa distanza è di 14 centimetri, il che si traduce nella produzione di una sezione trasversale del fascio che illumina uniformemente un'area di tre pozzetti per tre su una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti.

Assicurarsi che la luce diffusa proveniente dalla lampada e dai componenti ottici associati non sia in grado di raggiungere altri campioni, ad esempio utilizzando un cartone nero. Una volta costruito il dispositivo, accendere il refrigeratore d'acqua per il filtro di calore del liquido e assicurarsi che ci sia uno scambio d'acqua attraverso la camicia del filtro. Accendere la fonte di alimentazione della lampada e attendere almeno cinque minuti per la sorgente luminosa a banda larga.

Per stabilizzare, selezionare un filtro di interferenza a banda stretta Per generare la banda d'onda di illuminazione desiderata. Misurare la luce prodotta dalla lampada sul piano in cui deve essere posizionato il campione. Durante il trattamento.

La luce viene misurata utilizzando una sonda di irraggiamento calibrata collegata a uno spettro adatto. Radiometro. Utilizzare filtri a densità neutra per regolare l'intensità della luce fino ad ottenere l'output desiderato. Nel presente studio, l'intensità della luce passata da ciascun filtro di interferenza è regolata per fornire un'uscita di qualità uguale in ciascuna delle quattro bande d'onda di trattamento.

Il metodo di somministrazione della terapia della luce nel vicino infrarosso descritto può essere applicato a qualsiasi tipo di cellula o sistema modello in vitro. Qui mostriamo la nostra tecnica di consegna della luce alle cellule utilizzando feocromocitoma o cellule PC 12. Ad esempio, colture di cellule in terreni di crescita.

Nel 96, i vassoi sono stati rivestiti con poliolo lisina fino a quando non sono confluenti dal 70 all'80%. Preparare la concentrazione desiderata di glutammato o fattore di stress alternativo in terreni di coltura a crescita completa. Qui usiamo 10 millimolari di glutammato.

Rimuovere il terreno dalle cellule e lavarle delicatamente tre volte con soluzione salina tampone fosfato. Dopo il lavaggio, aggiungere il terreno contenente glutammato fino a un volume totale di cento microlitri per pozzetto. Immediatamente dopo l'aggiunta di glutammato O del fattore di stress preferito, esporre le cellule al trattamento con luce alle lunghezze d'onda e alle intensità desiderate posizionando la piastra di coltura sotto l'apparato di erogazione della luce preparato.

Assicurarsi di modificare l'emissione qualitativa del fascio di luce utilizzando le combinazioni stabilite di filtri a densità neutra. A seconda della lunghezza d'onda somministrata. Dopo aver completato il trattamento con la luce, posizionare le cellule su una superficie piana e incubare a 37 gradi Celsius in condizioni regolate dall'anidride carbonica per 24 ore.

Possono essere somministrate anche dosi aggiuntive di terapia con luce rossa nel vicino infrarosso. Prima di eseguire il ciclo finale di trattamento con la luce, preparare i reagenti da utilizzare per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno come indicatore di stress ossidativo. Qui utilizziamo diete indicate che emettono fluorescenza quando reagiscono con una gamma di specie reattive, tra cui dilu, fluoresceina D acetato, somministriamo un trattamento alla luce alle cellule come descritto nel passaggio quattro, ci assicuriamo che le cellule vengano trattate con le influenze e le lunghezze d'onda della luce desiderate.

Subito dopo il trattamento con la luce, rimuovere il terreno contenente glutammato e lavare due volte con PBS. Procedere con i saggi utilizzando coloranti indicatori che emettono fluorescenza quando reagiscono con specie reattive secondo le istruzioni del produttore. Misurare la fluorescenza generata dai coloranti indicatori utilizzando un lettore di piastre impostato sulle impostazioni di eccitazione ed emissione appropriate.

Utilizzare il colore del kit metrico per quantificare la concentrazione di proteine nei pozzetti secondo le istruzioni del produttore. Esprimi gli output di fluorescenza relativi alla concentrazione proteica per ogni singolo pozzetto e analizza i risultati utilizzando il software statistico. Lo sviluppo di questa tecnica apre la strada ai ricercatori che studiano gli effetti di più lunghezze d'onda e intensità della terapia della luce rossa nel vicino infrarosso sullo stress ossidativo.

Questa tecnica può essere utilizzata in una serie di sistemi modello, tra cui cellule dissociate o colture organotipiche.