Name: Regolamento nutrienti alimentando in continuo per lespansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Scopri la regolazione continua dei nutrienti per colture cellulari su larga scala usando bioreattori a sospensione agitata. Questo metodo migliora la crescita degli spheroidi cellulari e supporta le terapie cellulari umane.

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Gli autori ringraziano Michael Garwood e Sam Stein per i loro utili commenti, e Kristen M. Maynard per l'assistenza nella preparazione del manoscritto.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Generazione di prodotti cellulari di mammiferi per la produzione di agenti biologici e terapie cellulari richiede la cultura e monitoraggio di cellule di mammifero in grande scala 55 - 58. Inoltre, queste applicazioni richiedono condizioni di coltura definite e validate. Semplicemente aumentando il volume delle cellule che utilizzano tecnologie di ricerca non si incontreranno tutti questi requisiti. variazioni medie manuali provocando fluttuazioni di sostanze nutritive e l&#39;accumulo d...

Al fine di generare un gran numero di cellule umane vitali e funzionali per il trapianto, la regolamentazione delle condizioni di coltura è imperativo. L&#39;esaurimento delle sostanze nutritive, con accumulo di scorie metaboliche sono i principali contributori alla senescenza e metaboliche modifiche che riducono la qualità del prodotto cellulare 1 - 3. Questa procedura illustra un metodo per cellule di mammifero coltura in sferoidi usando un bioreattore agitata combinato con un sistema di alimentazione tasso di perfusione regolata per regolare il glucosio in un intervallo fisiologico 4 per tutta la durata della cultura. Ai fini di questi studi, l&#39;intervallo fisiologico è stato definito come tra 100 e 200 mg / dl. Gli stessi metodi possono essere usati per regolare altri nutrienti e rifiuti metabolici come lattato. culture statiche in piccoli volumi (1 - 30 ml) sono tipicamente utilizzati in ambiente di laboratorio per mantenere e differenziare le linee cellulari per experimefini ntale. Cellulare passaging viene eseguita con cambi completi medie come necessario ad intervalli regolari. Più terreno di coltura &quot;convenzionale&quot; ha una concentrazione di glucosio alto (450 mg / dl per DMEM utilizzato in questi studi) per consentire meno frequenti cambiamenti medi senza il rischio di limitazioni nutrizionali. Tuttavia, questo metodo batch alimentazione richiede ancora manipolazione frequente, introduce variabilità nell&#39;ambiente cellulare, e aumenta il rischio di contaminazione 5 - 9. Bioreattori sospensione agitata (SSB) fornire una migliore miscelazione e diminuito movimentazione 3,10 - 20, ma, come le culture statiche, richiedono cambiamenti medi manuali che contribuiscono alle fluttuazioni potenzialmente dannosi nei livelli di prodotti nutrienti e rifiuti. Perfusione alimentazione di culture SSB riduce questi problemi infusione continua e la rimozione del mezzo, ma grandi cambiamenti nei livelli di nutrienti a causa della crescita delle cellule rimangono un problema. L&#39;uso di un ra alimentazione adjustedte dai calcoli di uso di sostanze nutritive in base ai requisiti delle cellule stimato in grado di fornire l&#39;ambiente cellulare stabile necessaria per ottimizzare la vitalità delle cellule e funzionare 21 - 24. Vi è un grande corpo di letteratura che descrive i metodi per scalabili culture SSB di cellule di mammifero in particolare per la cultura e l&#39;espansione delle cellule pluripotenti 25 - 32, con gli altri focalizzata su isolotto (beta), le cellule 17,33,34, o la produzione di prodotti biologici 24, 35 - 38. Molti di questi tipi di cellule indagati può essere coltivata nelle culture sferoidali, e procedure specifiche per il tipo di cella utilizzato dovrebbe essere ottimizzato prima di implementare un sistema di alimentazione continua. In questa dimostrazione, un metodo di alimentazione di perfusione è stato usato per espandere una linea cellulare beta cresciuto come sferoidi in un bioreattore agitato 39 -. 43 Il metodo qui descritto fornisce unsemplice implementazione di alimentazione adeguamenti tariffari sulla base di misure di glucosio off-line per ottenere condizioni di coltura mirati. Regolazione della velocità di avanzamento con questo metodo per mantenere un livello di glucosio fisiologica è indicata ai rendimenti delle cellule aumenta. Le cellule di mammiferi dipendono da un nutriente chiave, glucosio, per la produzione di energia, quindi l&#39;uso di questa linea cellulare rappresenta un modello per molte cellule di mammifero in coltura 44. Inoltre, questa linea esemplifica l&#39;ulteriore complessità delle cellule beta, che sono sensibili ad elevati livelli di glucosio croniche 45. Per questo studio, le cellule beta-TC6 sono stati autorizzati a formare sferoidi nella cultura per approssimare le dimensioni medie delle isole di Langerhans in vivo. Il sistema di bioreattore perfusione 17 - 19,21,46 con una velocità di avanzamento regolata al glucosio consumo, ha determinato il mantenimento di condizioni fisiologiche e rendimenti più elevati cellulari senza cambiamenti di viabilità.

<table><tbody><tr><td>&#946; TC-6 Cells</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>CRL-11506</td><td>Linea cellulare di insulinoma di topo (tipo di cellula aderente)</td></tr><tr><td>DPBS No Ca, No Mg</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>14190-144</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144? ICID=search-14190144</a></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagles Medium</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td></td><td>Vedi sotto per i numeri di prodotto&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM Alto glucosio (500 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11965-092</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092</a></td></tr><tr><td>DMEM Basso contenuto di glucosio (100 mM)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11885-084</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084%20(note%20that%20this%20medium%20already%20contains%20pyruvate)">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (notare che questo medium contiene già piruvato)</a></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25030081</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=prodotto-ricerca">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081? ICID=prodotto-ricerca</a></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>11360070</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=prodotto-ricerca">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>Siero di suino inattivato a caldo</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>10082147</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147</a></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>25200056</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=prodotto-ricerca">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056? ICID=search-product</a></td></tr><tr><td>T-150 Fiasche trattate con coltura tissutale</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430825</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) & categoryname=</td></tr><tr><td>NuAire Incubatore per colture cellulari</td><td>Princeton, MN</td><td></td><td>US Autoflow. È possibile utilizzare qualsiasi incubatore per colture cellulari con regolazione CO2 con camicia d'acqua.</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td>Sorvall RT 7 (Può essere utilizzata qualsiasi centrifuga da banco simile)</td></tr><tr><td>Frigorifero</td><td></td><td></td><td>È possibile utilizzare qualsiasi frigorifero da laboratorio (per questi studi è stata utilizzata una piccola versione da tavolo)</td></tr><tr><td>Bottiglia di vetro da 1 litro</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-1L</td><td>Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Scienze della vita) & categoryname=</td></tr><tr><td>Bottiglia di vetro da 2 L</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>1395-2L</td><td>Qualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato</td></tr><tr><td>Bioreattori agitati da 250 ml&nbsp;</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>4500-250</td><td>http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Scienze della vita) & categoryname=</td></tr><tr><td>Piastra di agitazione</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-496-104A</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi piastra di agitazione sicura per incubatrice, qualsiasi fornitore</td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali 100 mm di diametro</td><td>Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific)</td><td>1256598&nbsp;</td><td>Qualsiasi fornitore può essere utilizzato (ordinato tramite Fisher Sci)</td></tr><tr><td>FALCON 50 ml Tubi conici</td><td>Falcon, San Jose, CA</td><td>1256598</td><td>Qualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato</td></tr><tr><td>Delran Plastica utilizzata per parti personalizzate</td><td>McMaster Carr</td><td>Vari</td><td>Qualsiasi materiale a scelta potrebbe essere utilizzato, ma Deran è scelto perché è sicuro per l'autoclave, non reattivo e facile da lavorare. http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac</td></tr><tr><td>Tubo in acciaio inossidabile per coperchi personalizzati</td><td>McMaster Carr</td><td>Vari</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91</td></tr><tr><td>Coperchi per bioreattori Delran modificati personalizzati per alimentazione continua</td><td>Realizzati su</td><td></td> misura <td>Non a conoscenza di fornitori che producono un prodotto simile</td></tr><tr><td>Coperchi per bottiglie in vetro modificati personalizzati per alimentazione continua</td><td>Realizzati su</td><td></td> misura <td>Alcuni fornitori (ad es, Fischer Sci, Corning) realizzano prodotti simili nei link sottostanti.</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica digitale Masterflex</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>EW-77919-25</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi pompa peristaltica di precisione. http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25</td></tr><tr><td>Connettori per tubi PVDF (vari)</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>vedere il link</td><td>Qualsiasi fornitore potrebbe essere utilizzato. http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889</td></tr><tr><td>Tubi BPT Pharmed L/S 16</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-16</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16</td></tr><tr><td>Pharmed BPT Tubing L/S 14</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-14</td><td>Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14</td></tr><tr><td>Pharmed BPT Tubing L/S 13</td><td>Cole Parmer, Vernon Hills, IL</td><td>WU-06508-13</td><td>Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore. http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/ WU-06508-13</td></tr><tr><td>Membrana Millipore Millex GP PES 0.22 &#181; l. filtro per siringa sterile (utilizzato per lo sfiato e la filtrazione media)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLGP033RS</td><td>Qualsiasi fornitore può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Pipetta graduata da 25 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore e possono essere utilizzate varie dimensioni</td></tr><tr><td>Pipettatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-15E</td><td>Qualsiasi fornitore o prodotto simile può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-6</td><td>Qualsiasi fornitore o prodotto simile potrebbe essere utilizzato</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco - Life Technologies</td><td>15250-061</td><td>Potrebbe essere utilizzato qualsiasi fornitore o prodotto simile. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061</td></tr><tr><td>Microscopio a luce invertita</td><td>Leica</td><td></td><td>Qualsiasi fornitore o prodotto simile potrebbe essere utilizzato</td></tr><tr><td>One Touch Ultra Blood Glucose Meter</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-293</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore o prodotto simile (ad es. , Bayer)</td></tr><tr><td>One Touch Ultra-Strips</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-292&nbsp;</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi fornitore o prodotto simile (ad es. , Bayer)</td></tr></tbody></table>

regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in spheroids

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In questa dimostrazione, gli sferoidi formati dalla linea cellulare di insulinoma β-TC6 sono stati coltivati come modello di produzione di un prodotto cellulare di isole di mammifero per dimostrare come la regolazione dei livelli di nutrienti possa migliorare la resa cellulare. In studi precedenti, i bioreattori hanno facilitato l'aumento dei volumi di coltura rispetto alle colture statiche, ma non è stato osservato alcun aumento delle rese cellulari. Le limitazioni di nutrienti chiave come il glucosio, che sono stati consumati tra le poppate in batch, possono portare a limitazioni nell'espansione cellulare. Sono state osservate grandi fluttuazioni nei livelli di glucosio, nonostante l'aumento delle concentrazioni di glucosio nei mezzi. L'uso di sistemi di alimentazione continua ha eliminato le fluttuazioni dei livelli di glucosio e ha migliorato i tassi di crescita cellulare rispetto ai metodi di coltura statica e SSB alimentati in batch. Ulteriori aumenti dei tassi di crescita sono stati osservati regolando la velocità di alimentazione in base al consumo di nutrienti calcolato, che ha permesso il mantenimento del glucosio fisiologico per tre settimane in coltura. Questo metodo può essere adattato anche ad altri tipi di cellule.

I livelli di glucosio medio e fluttuazioni Limitare cellulare espansione in Culture standard SSB I livelli di glucosio fluttuano nelle culture statiche e culture SSB per tutto il periodo di coltura 3. Queste fluttuazioni intensificano con l'aumentare il numero delle cellule durante il periodo di coltura di 21 giorni ed erano quasi identici in entrambe le culture statiche e SSB. Queste osservazioni sono presentati nella nostra precedente pubblicazione 3....

La regolazione dei nutrienti che utilizza l'alimentazione continua aggiustata per la crescita migliora i tassi di crescita degli sferoidi delle cellule di mammifero rispetto all'alimentazione intermittente per colture in bioreattori in sospensione agitata. Questo studio dimostra i metodi necessari per stabilire semplici colture alimentate a tasso aggiustato.

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l&#39;espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

L'obiettivo generale di questo processo è quello di coltivare un gran numero di cellule in condizioni di nutrienti controllate. Utilizzando apparecchiature convenzionali che si trovano in un laboratorio di coltura cellulare. Gli algoritmi associati consentono il controllo e la manipolazione dei nutrienti all'interno di intervalli sperimentali.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave per applicazioni di coltura cellulare su larga scala. Come le terapie cellulari umane. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita la coltura di cellule su larga scala con distribuzione uniforme di nutrienti e gas.Ciò consente densità cellulari più elevate rispetto alle colture cellulari statiche o alimentate in massa, aumenta la resa e riduce la perdita di cellule. Questo può essere fatto con le apparecchiature che si trovano comunemente nella maggior parte dei laboratori di colture cellulari. La dimostrazione visiva di questo metodo può essere utile per i nuovi ricercatori in quanto queste tecniche utilizzate possono essere difficili da padroneggiare, a causa del gran numero di passaggi che devono essere eseguiti in un ordine specifico in condizioni sterili.Raccogli i cinque componenti primari necessari per il sistema di alimentazione. Un serbatoio medio, una pompa peristaltica, un bioreattore agitato, un serbatoio di scarico e un set di campionamento dei tubi progettato su misura. Stabilire il serbatoio del mezzo utilizzando una bottiglia di vetro da un litro.Il serbatoio dei rifiuti utilizza una bottiglia di vetro da due litri. Il bioreattore agitato utilizza un reattore in vetro da 250 ml di volume. Utilizzare una pompa peristaltica digitale o una pompa simile con una testa della pompa a otto canali per controllare lo scambio del fluido.Assemblare il serbatoio e i coperchi del bioreattore modificati in plastica dura e autoclavabile. Con porte passanti per tubi in acciaio inossidabile per fornire ventilazione attraverso filtri sterili e consentire il trasferimento del fluido tra serbatoi e bioreattori. Collegare un tubo di deflusso fabbricato con tubi di aerazione in vetro poroso al coperchio del bioreattore a sospensione agitata modificato.Assemblare set di tubi di perfusione autoclavabili da connettori per tubi in fluoruro di polivinilidene e tubi per pompe peristaltiche durevoli. La lunghezza della sezione dipende dalla distanza tra i diversi componenti. Assemblare la linea di alimentazione utilizzando due diametri di tubo.Utilizzare L/S 14 per il tubo primario che coprirà la distanza dal bioreattore al serbatoio del fluido. Inserire una sorta di lunghezza di tubo L/S 13 al centro della lunghezza del tubo per la sezione della pompa, utilizzando gli adattatori PVDF appropriati. Utilizzare adattatori per tubi flessibili spinati in PVDF standard per unire due pezzi di tubo L/S 14 su entrambi i lati del tubo della sezione della pompa più corta.Assemblare la sezione del tubo per la rimozione dei rifiuti utilizzando un tubo L/S 16 di diametro maggiore e inserire una breve sezione di tubo L/S 14 al centro per la sezione di pompaggio. Questa operazione viene eseguita allo stesso modo dell'assemblaggio della linea di alimentazione utilizzando adattatori spinati per tubi flessibili in PVDF. Assemblare il componente finale del set di tubi costruendo il set da tre lunghezze di tubo corte L/S 14.Collegato insieme con un connettore HVDF di tipo T e due piccole fascette stringitubo su due delle lunghezze del tubo. Collegare il gruppo campione al connettore del campione in acciaio inossidabile fissato sul coperchio del bioreattore. Dopo la sterilizzazione, verrà collegato un filtro per gas sterile per lo sfiato del gas a una delle lunghezze bloccate.L'altro viene utilizzato per il collegamento a una siringa di campionamento sterile. Autoclavare il gruppo di campionamento mentre è collegato al bioreattore, prima di iniziare l'esperimento come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare questo gruppo per raccogliere campioni sterili dal bioreattore secondo necessità, senza disturbare il processo di alimentazione continua.Fissare gli sfiati sterili nelle posizioni appropriate sui coperchi del pallone rotante, del recipiente medio, dei recipienti di scarto e delle porte del campione. Coltivare e raccogliere le cellule come descritto nel protocollo di testo. Lasciare incubare le cellule a temperatura ambiente in tripsina per due o tre minuti in una cappa di biosicurezza, quindi raccoglierle in una provetta conica.Un campione di piccole cellule viene quindi raccolto e colorato con blu di tripano. Contare la densità cellulare utilizzando un microscopio e un emocitometro standard con colorazione con blu di tripano come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere il numero desiderato di cellule totali ai bioreattori sterili in sospensione agitata per ogni condizione.Aggiungere il terreno al bioreattore in sospensione agitata utilizzando una pipetta per raggiungere il volume totale di coltura desiderato. Spostare il bioreattore in sospensione agitata con cellule su una piastra di agitazione all'interno di un incubatore per colture cellulari. Colture di cellule nei bioreattori senza alimentazione per tre giorni a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica, il 100% di umidità relativa e una velocità di agitazione di 70 giri/min per consentire la formazione di sferoidi.Dopo la formazione di sferoidi, rimuovere il bioreattore in sospensione agitata dall'incubatore. Assemblare i componenti per il sistema di alimentazione continua in una cabina di sicurezza biologica. Riempire prima un serbatoio di terreno fresco con il terreno di coltura desiderato, quindi collegarlo a un lato della linea di alimentazione.Assicurarsi inoltre che il serbatoio del mezzo fresco sia adeguatamente ventilato con un filtro sterile. È necessario sostituire un filtro sterile sulla porta di ingresso del bioreattore per filtrare il fluido prima che entri nel bioreattore. Collegare la linea di scarico al serbatoio di scarico del fluido e assicurarsi che il serbatoio di scarico sia adeguatamente sfiatato con un filtro sterile.Mettere il bioreattore a sospensione agitata sulla piastra di agitazione all'interno dell'incubatore utilizzando gli stessi parametri di coltura della formazione degli sferoidi. Metti il serbatoio del mezzo fresco all'interno di un mini-frigorifero vicino. Assicurarsi che le linee di alimentazione siano in grado di uscire dal frigorifero senza impedire la chiusura delle porte.È inoltre fondamentale che le linee di alimentazione non vengano chiuse dalle porte del frigorifero o dell'incubatrice. Il serbatoio del liquido di scarico può essere posizionato sul piano di lavoro all'esterno dell'incubatrice in una posizione comoda. Passare le estremità rimanenti del tubo nell'incubatore e collegare la linea di alimentazione al filtro sulla porta di ingresso del bioreattore.Quindi collegare la linea di scarico alla porta del tubo di deflusso. Quindi posizionare la sezione della pompa delle linee di alimentazione e di scarico nella testa della pompa, assicurandosi del corretto orientamento in modo che le linee di alimentazione il fluido dal serbatoio del mezzo fresco nel bioreattore a sospensione agitata e le linee di scarico il fluido dal bioreattore e al serbatoio del mezzo di scarto. Calcolare la velocità di avanzamento utilizzando l'equazione della velocità di alimentazione regolata come descritto nel protocollo di testo.Utilizzare il campione più recente con le informazioni sulla conta cellulare, insieme alla previsione del tasso di crescita e alle misurazioni del glucosio medio per stimare la velocità di alimentazione necessaria per mantenere la concentrazione di glucosio desiderata nella coltura. Impostare la velocità della pompa in base alla velocità di avanzamento calcolata. Ripetere il calcolo della velocità di avanzamento e regolare la velocità della pompa per ogni punto di campionamento.Le misurazioni del glucosio medio sono mostrate da colture di sferoidi di insulinoma Beta-TC6 utilizzando bioreattori statici in sospensione agitata e metodi di coltura di bioreattori in sospensione agitata alimentati in continuo. Alimentazione con medio standard ad alto contenuto di glucosio. L'alimentazione continua è in grado di eliminare le fluttuazioni del glucosio, ma i livelli medi di glucosio nel substrato cambiano drasticamente durante il periodo di coltura e sono molto al di sopra dell'intervallo fisiologico.L'alimentazione regolata è in grado di eliminare le fluttuazioni e di mantenere le concentrazioni di glucosio vicino ai livelli fisiologici per tutta la durata del periodo di coltura. Qui la crescita cellulare riportata come variazione di piega nel numero di cellule durante il periodo di coltura di 21 giorni viene confrontata per bioreattori in sospensione agitata con variazioni regolari del mezzo, colture di bioreattori in sospensione agitata con velocità di alimentazione costante e colture di bioreattori in sospensione agitata con velocità di alimentazione regolata. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la variazione delle condizioni, possono essere preformati per rispondere a ulteriori domande, come i requisiti nutrizionali per nuove linee cellulari o risultati sperimentali specifici.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare i requisiti metabolici nelle cellule umane con cancro o altri disturbi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare un sistema di coltura cellulare a profusione per controllare meglio le condizioni di coltura e massimizzare la resa cellulare. Non dimenticare che lavorare con le cellule umane può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come la protezione dagli agenti patogeni trasmessi per via ematica.

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Gli sferoidi sono un tipo di modello di coltura cellulare 3D utilizzato per rappresentare in modo più accurato l'ambiente di una cellula rispetto ai modelli monostrato di coltura cellulare 2D. Nel protocollo di esempio, vedremo gli scienziati generare sferoidi da una linea cellulare di cancro del colon-retto e applicare l'imaging di cellule vive per monitorare la crescita degli sferoidi.

Generazione di sferoidi da linee cellulari: un metodo di coltura cellulare tridimensionale (3D)

Vi presentiamo un protocollo per la generazione di numeri di grandi dimensioni (migliaia a centinaia di migliaia) di taglia e sferoidi tumorali uniformi di composizione controllata, utilizzando micropiastra disponibili in commercio.

Produzione di grandi numeri di-Size controllata Tumore Spheroids Uso micropiastra

Qui, descriviamo un protocollo rapido e flessibile per la formazione di sferoidi cellulari 3D attraverso l'aggregazione cellulare. Questo è facilmente adattabile a più tipi di cellule ed è adatto per l'uso in una varietà di applicazioni, tra cui la migrazione cellulare, l'invasione o i saggi anoikis e per l'imaging e la quantificazione delle interazioni cellula-matrice.

Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Qui descriviamo un metodo per generare colture sferoide tridimensionale di cellule epiteliali nasali umane. Sferoidi quindi sono stimolati a regolatore di conduttanza del Transmembrane fibrosi cistica (CFTR) in auto-dipendente dello ione e secrezione fluida, quantificare il cambiamento nella dimensione del luminal sferoide come proxy per funzione CFTR.

Generazione di cellule epiteliali nasali umane sferoidi per studio di regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica individualizzato

Presentiamo qui un metodo che combina l'uso della cancellazione epigenetica chimica con segnali correlati al meccanosensing per generare in modo efficiente cellule pluripotenti di mammiferi, senza la necessità di trasfezione genica o vettori retrovirali. Questa strategia è, quindi, promettente per la medicina traslazionale e rappresenta un notevole progresso nella tecnologia degli organoidi delle cellule staminali.

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l'appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.

Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

Questi protocolli aiuteranno gli utenti a sondare il metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi derivati dalla linea cellulare del cancro 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare di Cavalluccio marino.

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

Presentiamo un protocollo per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità e la loro caratterizzazione fenotipica utilizzando l'acquisizione di immagini e la proteomica.

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

Gli organoidi rivoluzionano la modellazione tissutale personalizzata per lo sviluppo di organi, la scoperta di farmaci e la ricerca sulle malattie. L'ingegneria degli organoidi avanza nella creazione di tessuti sintetici intricati. L'obiettivo è quello di integrare la morfogenesi, la tecnologia assembloide e le biomatrici per far progredire l'ingegneria tissutale. Questo protocollo aiuta a modellare l'organogenesi epatica e a stabilire linee guida per la costruzione di tessuti sintetici.

Tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dell'organogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane

Qui, descriviamo diversi metodi di formazione di sferoidi multicellulari per eseguire la microscopia multiparametrica su cellule vive di follow-up. Utilizzando la microscopia a fluorescenza (FLIM), l'autofluorescenza cellulare, i coloranti di colorazione e le nanoparticelle, viene dimostrato l'approccio per l'analisi del metabolismo cellulare, dell'ipossia e della morte cellulare nel cancro tridimensionale (3D) vivo e negli sferoidi derivati da cellule staminali.

Produzione e microscopia multiparametrica per imaging a fluorescenza su cellule vive (FLIM) di sferoidi multicellulari

Scopri la regolazione continua dei nutrienti per colture cellulari su larga scala usando bioreattori a sospensione agitata. Questo metodo migliora la crescita degli spheroidi cellulari e supporta le terapie cellulari umane.

Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l'espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

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