Regolamento nutrienti alimentando in continuo per l'espansione su larga scala di cellule di mammifero in Spheroids

L'obiettivo generale di questo processo è quello di coltivare un gran numero di cellule in condizioni di nutrienti controllate. Utilizzando apparecchiature convenzionali che si trovano in un laboratorio di coltura cellulare. Gli algoritmi associati consentono il controllo e la manipolazione dei nutrienti all'interno di intervalli sperimentali.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave per applicazioni di coltura cellulare su larga scala. Come le terapie cellulari umane. Il vantaggio principale di questa tecnica è che facilita la coltura di cellule su larga scala con distribuzione uniforme di nutrienti e gas.

Ciò consente densità cellulari più elevate rispetto alle colture cellulari statiche o alimentate in massa, aumenta la resa e riduce la perdita di cellule. Questo può essere fatto con le apparecchiature che si trovano comunemente nella maggior parte dei laboratori di colture cellulari. La dimostrazione visiva di questo metodo può essere utile per i nuovi ricercatori in quanto queste tecniche utilizzate possono essere difficili da padroneggiare, a causa del gran numero di passaggi che devono essere eseguiti in un ordine specifico in condizioni sterili.

Raccogli i cinque componenti primari necessari per il sistema di alimentazione. Un serbatoio medio, una pompa peristaltica, un bioreattore agitato, un serbatoio di scarico e un set di campionamento dei tubi progettato su misura. Stabilire il serbatoio del mezzo utilizzando una bottiglia di vetro da un litro.

Il serbatoio dei rifiuti utilizza una bottiglia di vetro da due litri. Il bioreattore agitato utilizza un reattore in vetro da 250 ml di volume. Utilizzare una pompa peristaltica digitale o una pompa simile con una testa della pompa a otto canali per controllare lo scambio del fluido.

Assemblare il serbatoio e i coperchi del bioreattore modificati in plastica dura e autoclavabile. Con porte passanti per tubi in acciaio inossidabile per fornire ventilazione attraverso filtri sterili e consentire il trasferimento del fluido tra serbatoi e bioreattori. Collegare un tubo di deflusso fabbricato con tubi di aerazione in vetro poroso al coperchio del bioreattore a sospensione agitata modificato.

Assemblare set di tubi di perfusione autoclavabili da connettori per tubi in fluoruro di polivinilidene e tubi per pompe peristaltiche durevoli. La lunghezza della sezione dipende dalla distanza tra i diversi componenti. Assemblare la linea di alimentazione utilizzando due diametri di tubo.

Utilizzare L/S 14 per il tubo primario che coprirà la distanza dal bioreattore al serbatoio del fluido. Inserire una sorta di lunghezza di tubo L/S 13 al centro della lunghezza del tubo per la sezione della pompa, utilizzando gli adattatori PVDF appropriati. Utilizzare adattatori per tubi flessibili spinati in PVDF standard per unire due pezzi di tubo L/S 14 su entrambi i lati del tubo della sezione della pompa più corta.

Assemblare la sezione del tubo per la rimozione dei rifiuti utilizzando un tubo L/S 16 di diametro maggiore e inserire una breve sezione di tubo L/S 14 al centro per la sezione di pompaggio. Questa operazione viene eseguita allo stesso modo dell'assemblaggio della linea di alimentazione utilizzando adattatori spinati per tubi flessibili in PVDF. Assemblare il componente finale del set di tubi costruendo il set da tre lunghezze di tubo corte L/S 14.

Collegato insieme con un connettore HVDF di tipo T e due piccole fascette stringitubo su due delle lunghezze del tubo. Collegare il gruppo campione al connettore del campione in acciaio inossidabile fissato sul coperchio del bioreattore. Dopo la sterilizzazione, verrà collegato un filtro per gas sterile per lo sfiato del gas a una delle lunghezze bloccate.

L'altro viene utilizzato per il collegamento a una siringa di campionamento sterile. Autoclavare il gruppo di campionamento mentre è collegato al bioreattore, prima di iniziare l'esperimento come descritto nel protocollo di testo. Utilizzare questo gruppo per raccogliere campioni sterili dal bioreattore secondo necessità, senza disturbare il processo di alimentazione continua.

Fissare gli sfiati sterili nelle posizioni appropriate sui coperchi del pallone rotante, del recipiente medio, dei recipienti di scarto e delle porte del campione. Coltivare e raccogliere le cellule come descritto nel protocollo di testo. Lasciare incubare le cellule a temperatura ambiente in tripsina per due o tre minuti in una cappa di biosicurezza, quindi raccoglierle in una provetta conica.

Un campione di piccole cellule viene quindi raccolto e colorato con blu di tripano. Contare la densità cellulare utilizzando un microscopio e un emocitometro standard con colorazione con blu di tripano come descritto nel protocollo di testo. Aggiungere il numero desiderato di cellule totali ai bioreattori sterili in sospensione agitata per ogni condizione.

Aggiungere il terreno al bioreattore in sospensione agitata utilizzando una pipetta per raggiungere il volume totale di coltura desiderato. Spostare il bioreattore in sospensione agitata con cellule su una piastra di agitazione all'interno di un incubatore per colture cellulari. Colture di cellule nei bioreattori senza alimentazione per tre giorni a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica, il 100% di umidità relativa e una velocità di agitazione di 70 giri/min per consentire la formazione di sferoidi.

Dopo la formazione di sferoidi, rimuovere il bioreattore in sospensione agitata dall'incubatore. Assemblare i componenti per il sistema di alimentazione continua in una cabina di sicurezza biologica. Riempire prima un serbatoio di terreno fresco con il terreno di coltura desiderato, quindi collegarlo a un lato della linea di alimentazione.

Assicurarsi inoltre che il serbatoio del mezzo fresco sia adeguatamente ventilato con un filtro sterile. È necessario sostituire un filtro sterile sulla porta di ingresso del bioreattore per filtrare il fluido prima che entri nel bioreattore. Collegare la linea di scarico al serbatoio di scarico del fluido e assicurarsi che il serbatoio di scarico sia adeguatamente sfiatato con un filtro sterile.

Mettere il bioreattore a sospensione agitata sulla piastra di agitazione all'interno dell'incubatore utilizzando gli stessi parametri di coltura della formazione degli sferoidi. Metti il serbatoio del mezzo fresco all'interno di un mini-frigorifero vicino. Assicurarsi che le linee di alimentazione siano in grado di uscire dal frigorifero senza impedire la chiusura delle porte.

È inoltre fondamentale che le linee di alimentazione non vengano chiuse dalle porte del frigorifero o dell'incubatrice. Il serbatoio del liquido di scarico può essere posizionato sul piano di lavoro all'esterno dell'incubatrice in una posizione comoda. Passare le estremità rimanenti del tubo nell'incubatore e collegare la linea di alimentazione al filtro sulla porta di ingresso del bioreattore.

Quindi collegare la linea di scarico alla porta del tubo di deflusso. Quindi posizionare la sezione della pompa delle linee di alimentazione e di scarico nella testa della pompa, assicurandosi del corretto orientamento in modo che le linee di alimentazione il fluido dal serbatoio del mezzo fresco nel bioreattore a sospensione agitata e le linee di scarico il fluido dal bioreattore e al serbatoio del mezzo di scarto. Calcolare la velocità di avanzamento utilizzando l'equazione della velocità di alimentazione regolata come descritto nel protocollo di testo.

Utilizzare il campione più recente con le informazioni sulla conta cellulare, insieme alla previsione del tasso di crescita e alle misurazioni del glucosio medio per stimare la velocità di alimentazione necessaria per mantenere la concentrazione di glucosio desiderata nella coltura. Impostare la velocità della pompa in base alla velocità di avanzamento calcolata. Ripetere il calcolo della velocità di avanzamento e regolare la velocità della pompa per ogni punto di campionamento.

Le misurazioni del glucosio medio sono mostrate da colture di sferoidi di insulinoma Beta-TC6 utilizzando bioreattori statici in sospensione agitata e metodi di coltura di bioreattori in sospensione agitata alimentati in continuo. Alimentazione con medio standard ad alto contenuto di glucosio. L'alimentazione continua è in grado di eliminare le fluttuazioni del glucosio, ma i livelli medi di glucosio nel substrato cambiano drasticamente durante il periodo di coltura e sono molto al di sopra dell'intervallo fisiologico.

L'alimentazione regolata è in grado di eliminare le fluttuazioni e di mantenere le concentrazioni di glucosio vicino ai livelli fisiologici per tutta la durata del periodo di coltura. Qui la crescita cellulare riportata come variazione di piega nel numero di cellule durante il periodo di coltura di 21 giorni viene confrontata per bioreattori in sospensione agitata con variazioni regolari del mezzo, colture di bioreattori in sospensione agitata con velocità di alimentazione costante e colture di bioreattori in sospensione agitata con velocità di alimentazione regolata. Seguendo questa procedura, altri metodi, come la variazione delle condizioni, possono essere preformati per rispondere a ulteriori domande, come i requisiti nutrizionali per nuove linee cellulari o risultati sperimentali specifici.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia cellulare per esplorare i requisiti metabolici nelle cellule umane con cancro o altri disturbi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assemblare un sistema di coltura cellulare a profusione per controllare meglio le condizioni di coltura e massimizzare la resa cellulare. Non dimenticare che lavorare con le cellule umane può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come la protezione dagli agenti patogeni trasmessi per via ematica.