Name: Frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su Comunità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Impara un protocollo rapido per il frazionamento del sangue intero e l'isolamento di DNA, RNA, plasma e PBMC in contesti non clinici. Questo metodo ottimizzato migliora l'efficienza e la qualità dei campioni per analisi ad alto rendimento.

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Vorremmo ringraziare Henriette Mair-Meijers per l'inestimabile attenzione ai dettagli e le ore dedicate all'elaborazione delle raccolte di sangue. Siamo grati per l'esperienza di progettazione grafica di Natalie Jameson Kiesling. Apprezziamo anche l'approvazione dei produttori (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) menzionati nel presente documento per pubblicare l'uso dei loro prodotti come descritto. I finanziamenti per questo lavoro sono stati generosamente forniti dal National Institutes of Health con i numeri di premio DA022720, RC1MH088283 e DA022720-05-S1.

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8">http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8</a> (2010).</li>
<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
<li>Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

Abbiamo descritto un protocollo semplificato che è stato applicato con successo a elaborare più di 1.600 campioni di sangue intero in Health Study Detroit Quartiere. Sebbene molte di queste tecniche sono disponibili in letteratura, il nostro compilazione passo-passo, comprese le modifiche temporizzati precisamente ogni aumento, riflette una ottimizzata, protocollo efficiente che produce con successo una varietà di campioni biologici con una vasta gamma di applicazioni a valle, tra cui la metilazione del DNA, espressione...

Molteplici studi hanno caratterizzato le differenze di espressione genica, la metilazione del DNA e sottoinsieme di cellule nel sangue tra gli individui con e senza mentale (o altro) malattie 1-4. Questi studi, tuttavia, sono stati ottenuti da situazioni cliniche in cui le differenze malattie associate possono essere amplificate a causa della natura generalmente più grave delle malattie per le quali pazienti stanno cercando di trattamento. Grazie ai progressi in tecnologie "omiche", l'ultimo decennio ha visto un'esplosione di interesse ad ottenere campioni biologici provenienti da comunità e / o le impostazioni epidemiologici 5-7, al fine di fornire stime basate sulla popolazione di prevalenza della malattia e di un quadro più ampio della determinanti ambientali di queste malattie mentali e / o fisici. Una sfida chiave in questo senso è il requisito per una rapida elaborazione dei campioni raccolti. Degradazione delle cellule mononucleate, componenti chiave del sistema immunitario che sono frequently utilizzato per valutare la salute di un individuo, inizia subito dopo prelievo di sangue con una diminuzione significativa recupero dopo 2 ore di raccolta 8-10. Per affrontare questa sfida, vi presentiamo un protocollo ottimizzato in cui più componenti del sangue umano intero sono contemporaneamente isolati da campioni ottenuti nelle case di soggetti che vivono in una grande area metropolitana. Il protocollo si basa sulla nostra compilazione e modifica delle tecniche attuali, compreso lo stoccaggio di tutte le frazioni "extra" in caso di tecniche future permettono di ulteriore isolamento / analisi. Mentre i metodi o kit alternativi possono essere impiegati al posto dei singoli metodi qui descritti, quelli delineati hanno dimostrato di essere un mezzo affidabile ed efficiente per la lavorazione dei campioni in maniera high-throughput. Frazioni di alta qualità (PBMC, DNA, siero, e RNA) di sangue fresco possono essere prodotti in 2 ore di raccolta e di tutti i campioni del test-ready può essere disponibile entro 2 giorni (Figura 1). Questo protocollo è stato sviluppato per consentire il trattamento efficiente dei campioni raccolti da residenti in comunità, adulti residenti della città di Detroit per la sperimentazione in Detroit Quartiere Health Study (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1) un basato sulla popolazione, studio dei determinanti sociali e biologiche del disturbo post-traumatico da stress (PTSD) e di altre malattie mentali. La prevalenza di PTSD a Detroit è più del doppio della media nazionale 11,12. Identificare determinanti biologiche di PTSD in questa popolazione può aiutare a sviluppare farmacologico adeguato e / o interventi cognitivo-comportamentali per aiutare coloro che soffrono di questo disturbo, sia in questa popolazione urbana, e in altre popolazioni ad alto rischio (ad esempio, tornando veterani militari). Il nostro laboratorio, precedentemente situato presso la Wayne State University di Detroit, Michigan, è stato selezionato per l'elaborazione sulla base della nostra esperienza nella gestione di campioni di tessuto fresche provenienti da una varietàdelle fonti, la necessità di iniziare il trattamento dei campioni in 2 ore di raccolta, e la nostra vicinanza ai siti di raccolta. Con questa opportunità unica a portata di mano, il nostro obiettivo era quello di ottimizzare il trattamento per il massimo rendimento di DNA, RNA, siero e le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da ciascun campione (per un totale di N = 1.639 campioni in 5 ondate di raccolta del campione). Le procedure descritte qui possono essere eseguite contemporaneamente in un contesto non clinico, producendo materiale (vedi Tabella 1 per rendimenti medi) di partenza per un gran numero di applicazioni a valle, tra cui microarray, epigenetica, real-time RT-PCR, e citometria a flusso analisi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700"> Figura 1. flusso di lavoro complessivo. Il processo globale raffigurato qui comprende la logistica di ottenere i campioni di sangue da identificare consenzienti particparte- al sangue disegnare sé. Di alta qualità, le frazioni (cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, DNA, siero, e RNA) di sangue intero fresco può essere prodotto in 2 ore di raccolta e di tutti i campioni del test-ready può essere disponibile entro 2 giorni. Inoltre, le frazioni preparati con questo metodo sono adatti per lo stoccaggio a lungo termine se i campioni non devono essere testati immediatamente. L'intera timeline qui delineato potrebbe essere completata in un solo giorno (~ 5 ore in totale). Tuttavia, un tale giorno sarebbe estremamente laborioso soprattutto per un singolo tecnico con esperienza sostanziale con le tecniche. Pertanto, si consiglia di dividere le procedure il giorno 1 tra almeno due tecnici e il completamento del trattamento RNA Day 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini kit QIAamp DNA Blood</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Giorno 1: Isolamento del DNA</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>Giorno 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>5 &frac34; &rdquo; Pasteur pipette</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Giorno 1: isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), inattivato a calore</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td>Giorno 1: isolamento PBMC</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>Giorno 1: isolamento PBMC</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640, liquido</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>Giorno 1: isolamento PBMC</td></tr><tr><td>0,4% colorazione blu di tripano&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Giorno 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Camera di conteggio delle cellule Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Giorno 1:</td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countess con isolamento PBMC o dispositivo di conteggio delle cellule come un microscopio e un emocitometro</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>Giorno 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Frazionamento LeukoLOCK & Kit di stabilizzazione&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>Giorno 1: Isolamento dell'RNA leucocitario</td></tr><tr><td>25&nbsp; G x 5/8 pollici aghi</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td> Giorno 1: Siringhe per <td>isolamento dell'RNA leucocitario</td></tr><tr><td>(5&nbsp; ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td> Giorni 1 e 2: Soluzione di lisi denaturante per <td>l'isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA leucocitario</td></tr><tr><td>5&nbsp; M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>Reagente TRI</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>Bromo-3-cloro-propano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td> Giorno 2: Cartucce di spin per <td>l'isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA leucocitario</td></tr><tr><td>0,1&nbsp; mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>Kit senza DNA</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td> Giorno 2: Scala RNA 6000 <td>per trattamento DNasi</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>Giorno 2: Analisi del bioanalizzatore</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II Kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Giorno 2: Analisi del bioanalizzatore</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>Giorno 2: Analisi del bioanalizzatore</td></tr><tr><td>Etanolo >99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo >99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultra pura senza nucleasi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (senza nucleasi)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter (sierologico)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter (per volumi inferiori a 1&nbsp; ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (sierologiche)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Contenitori per congelamento a velocità controllata</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox (per contenere 2&nbsp; ml e 5&nbsp; ml crioviali e 1,5&nbsp; ml provette per microcentrifuga)</td><td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Rack per provette</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp; ml tubi in polipropilene</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; provette per microcentrifuga ml e 0,65</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 e 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; ml e 5&nbsp; ml crioviali</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 e 10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp; ml CPT vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 provette</td></tr><tr><td>6&nbsp; ml K2 vacutainer EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2 provette</td></tr><tr><td>8,5&nbsp; ml SST vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367988</td><td>1 provetta</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a bagno secco con blocco riscaldante per provette per microcentrifuga</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtrazione/vuoto per l'uso all'interno della cappa per colture cellulari</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso per provette per microcentrifuga con coperchio</td> <td>a tenuta di aerosolEppendorf</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata con rotore a secchiello oscillante e tappi a tenuta di aerosol per 16 x 125&nbsp; mm vacutainers e 15&nbsp; ml di tubi in polipropilene</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2, non è necessario refrigerare</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 (consigliato per la precisione di piccoli volumi) o altro dispositivo spettrofotometrico</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalyzer Agilent</td><td>Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di azoto liquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per oggetti taglienti</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per rifiuti biologici</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>Cappa per colture cellulari certificata Biosafety Level 2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su comunità

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Raccolta e lavorazione di campioni di sangue intero in un contesto non clinico offre un&#39;opportunità unica per valutare residenti in comunità gli individui con e senza condizioni preesistenti. Elaborazione rapida di questi campioni è essenziale per evitare la degradazione dei componenti cellulari chiave. Vi sono incluse le modalità di simultanea periferico delle cellule mononucleate del sangue (PBMC), DNA, RNA e l&#39;isolamento del siero da un unico prelievo di sangue effettuato nelle case dei partecipanti consentendo all&#39;interno delle aree metropolitane, con l&#39;elaborazione iniziata entro 2 ore di raccolta. Abbiamo usato queste tecniche per elaborare oltre 1.600 campioni di sangue cedevole, materiale costante qualità elevata, che è stato successivamente utilizzato in metilazione del DNA, la genotipizzazione, espressione genica successo e citometria a flusso analisi. Alcuni dei metodi utilizzati sono di serie; tuttavia, se combinati nel modo descritto, consentono un&#39;efficiente elaborazione dei campioni di partecipanti di population- e / o community-studi basati che normalmente non verrebbero valutati in un ambiente clinico. Pertanto, questo protocollo ha il potenziale per ottenere campioni (e, successivamente, dati) che sono più rappresentativi della popolazione generale.

È essenziale che la procedura generale produrre materiale di alta qualità per l'analisi in una moltitudine di applicazioni a valle compresa l'espressione genica tramite microarray e l'analisi RT-PCR, rilevazione di modificazioni epigenetiche, e variazioni subset cellulare. Tabella 1 indica la resa media e qualità dei materiali da ciascuno dei processi. La figura 3 fornisce un esempio dell'output qualità dell'isolamento leucociti RNA e filtri metodi di lavorazione. L'imm...

Delineiamo una metodologia per il trattamento del sangue intero per ottenere una varietà di componenti per ulteriori analisi. Abbiamo ottimizzato un protocollo semplificato che consente l'elaborazione simultanea rapida e ad alta produttività di campioni di sangue intero in un contesto non clinico.

Frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su Comunità

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un protocollo semplificato che consenta un rapido flusso oculare e l'elaborazione simultanea di campioni di sangue intero. In un contesto non clinico, il processamento del vacutainer viene eseguito in modo sovrapposto per consentire l'isolamento efficiente di frazioni di alta qualità di cellule mononucleate del sangue periferico D-N-A-R-N-A o siero pbmc e frazioni residue di plasma e globuli rossi. Il processo inizia con la centrifugazione del vacutainer sierico, la rimozione di un'aliquota da un vacutainer contenente fial per l'isolamento del DNA, la centrifugazione delle provette fial.Quindi può verificarsi il completamento dell'isolamento del DNA dopo l'isolamento del DNA, l'isolamento dell'RNA derivato dai leucociti dal vacutainer K due EDTA. Il sangue di ciascun vacutainer viene fatto passare attraverso un rispettivo filtro e lavato con PBS, quindi trattato con un agente di stabilizzazione dell'RNA che ritorna al vacutainer contenente il fiale. Il plasma residuo viene prelevato e lo strato mononucleare viene lavato con PBS.Durante la centrifugazione delle provette, i globuli rossi residui vengono raccolti e il siero separato viene aliquotato. Infine, i pbmc sono conservati in terreno di congelamento cellulare. In definitiva, frazioni di sangue fresco di alta qualità possono essere prodotte entro due ore dalla raccolta e tutti i campioni pronti per il test possono essere disponibili entro due giorni.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le procedure possono essere eseguite simultaneamente in un contesto non clinico, producendo così materiale di partenza entro due giorni per una moltitudine di applicazioni a valle, tra cui analisi epigenetiche in tempo reale di microarray R-T-P-C-R e citometria a flusso. A dimostrare la procedura sarà Amy Weckl, la mia responsabile di laboratorio per iniziare l'elaborazione del campione di sangue intero. Assicurarsi che i tamponi, la centrifuga e il blocco termico siano stati preparati.Documentare l'orario di consegna del vacutainer sul foglio di tracciamento del campione. Dopo aver ricevuto i campioni, documentare l'isolamento del siero. Tempo di avvio sul registro del campione, iniziare immediatamente l'elaborazione centrifugando il vacutainer di siero da sette millilitri con il freno e l'accelerazione disattivati.Utilizzando un rotore a secchiello oscillante con tappi aerosol per 20 minuti a 1300 GS a quattro gradi Celsius mentre il vacutainer del siero viene centrifugato. Documentare l'ora di inizio dell'isolamento del DNA in una cappa di coltura a due cellule BSL. Capovolgere cinque volte i contenitori del vuoto contenenti il gel fial e aggiungere 200 microlitri di sangue intero dalla parte superiore di uno dei vacutainer in ciascuna delle due aliquote da 20 microlitri di proteasi.Lasciare le provette per proteasi e microcentrifuga del sangue nella cappa e continuare con la centrifugazione della chiamata contenente contenitori vacu. Prima della centrifugazione. Documentare l'ora di inizio dell'isolamento PBMC, che deve essere entro due ore dal prelievo di sangue.Invertire la chiamata FI contenente contenitori vacu già nei contenitori a tenuta di aerosol da otto a 10 volte. Quindi centrifugare il vacutainer con la pausa e l'accelerazione disattivate per 30 minuti a 1600 Gs 22 gradi Celsius. Rimettere i campioni di isolamento del DNA nella cappa e aggiungere 200 microlitri di tampone a ciascuna delle provette per proteasi e microcentrifuga del sangue.Tappate i tubi e rimuoveteli dalla cappa. Quindi farli vorticare per 15 secondi. Dopo il vortice lampeggia immediatamente, far girare i campioni.Procedere con l'isolamento del DNA come descritto nel protocollo di testo allegato fino a quando il DNA non viene alluso dalla colonna su Ellucian. Ha raccolto il DNA delle due colonne per partecipante per una resa totale di 800 microlitri per partecipante. Documentare l'ora di inizio dell'isolamento dell'RNA dei leucociti.Forare il setto di gomma del vacutainer K due EDTA con una punta di trasferimento. Conservare la guaina e il tappo a vite per un uso successivo dopo l'assemblaggio del sistema di tubi K due EDTA. Utilizzare l'estremità di una spatola metallica per sbloccare in sicurezza l'ago e inserire l'ago in una provetta vuota per la raccolta del sangue sottovuoto da 10 millilitri.Capovolgere il gruppo del tubo del ricevitore del filtro vacutainer K due EDTA per completare la configurazione Dopo la filtrazione e il lavaggio PBS, prelevare tre millilitri di agente di stabilizzazione dell'RNA utilizzando una nuova siringa da 10 millilitri. Lavare il filtro assicurandosi che l'agente di stabilizzazione dell'RNA rimanga attaccato. Quindi staccare la siringa dal filtro senza ritrarre lo stantuffo.Sigillare l'ingresso e l'uscita del filtro con la guaina e il tappo a vite trattenuti dalla punta di trasferimento e lasciare il filtro saturo con l'agente di stabilizzazione dell'RNA. Conservare il filtro a meno 80 gradi Celsius per almeno due ore fino a quando il tempo non lo consente per il completamento dell'isolamento dell'artrite reumatoide. Una volta che il vacutainer è stato rimesso nella cappa BSL two, rimuovere il tappo e utilizzare una pipetta sierologica per prelevare 1,5 millilitri dello strato di plasma superiore senza avvicinarsi allo strato mononucleare.Trasferire il plasma dai due vacutainer a una fiala criogenica da cinque millilitri. Registrare quindi il volume raccolto. Trasferire il plasma rimanente e lo strato mononucleare utilizzando una pipetta sierologica in una provetta conica da 15 millilitri.Quindi aggiungere abbastanza XPBS precedentemente preparato per portare il volume totale nel tubo conico fino a 15 millilitri. Tappare il tubo e capovolgerlo cinque volte. Quindi centrifugare la provetta con la rottura e l'accelerazione disattivate per 15 minuti a 300 GS 22 gradi Celsius.Rimettere i contenitori di vuoto fial nel cappuccio e raccogliere i globuli rossi o globuli rossi. Utilizzare una pipetta pastier da cinque e tre quarti di pollice per agitare e allentare l'esterno dello strato di gel fial e rimuoverlo. Utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere e trasferire i globuli rossi in una fiala criogenica da cinque millilitri.Quindi registrare il volume. Successivamente, trasferire le fiale criogeniche di plasma e globuli rossi in un contenitore di congelamento a velocità controllata e conservarle a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire i campioni in una scatola criogenica e riportarli a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.Al termine della centrifugazione, riposizionare il tubo conico nella cappa e aspirare il liquido, lasciando 500 microlitri di PBS senza disturbare il pellet. Aggiungere un XPBS per portare il volume a 10 millilitri e risospendere il pellet. Chiudere delicatamente il tubo e capovolgerlo cinque volte.Quindi centrifugare il campione con il freno e l'accelerazione disattivati per 10 minuti a 300 GS a 22 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aliquotare lo strato superiore di siero dal vacutainer in fiale criogeniche da due millilitri e documentare il volume. Utilizzare quattro fiale criogeniche e aliquotare 200 microlitri in fiala criogenica.Uno da 1000 microlitri in fiala criogenica due. Quindi dividere il volume rimanente in fiale criogeniche tre e quattro. Trasferisci le fiale criogeniche in una scatola criogenica e conservale a meno 80 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine.E documenta l'ora di inizio del congelatore. Continuare con l'isolamento PBMC. Rimettendo i campioni nella cappa dopo la centrifugazione, aspirare quanto più surnatante possibile senza disturbare il pellet.Sospendiamo il pellet in 2,5 millilitri di PBMC. Medio. Aggiungere 2,5 millilitri di PBMC, mezzo di congelamento due contenente DMSO e RPMI.Mezzo alla soluzione cellulare precedentemente preparata e agitare delicatamente il campione. Quindi aliquotare 10 microlitri della soluzione cellulare in una provetta per microcentrifuga. Aggiungere 10 microlitri di colorante blu per vaschetta allo 0,4% nella provetta per microcentrifuga e mescolare la soluzione pipettando più volte.Quindi, pipettare 10 microlitri di miscela in una camera di conteggio delle cellule. Far scorrere e posizionare il vetrino nel contacellule entro tre minuti dalla miscelazione. Ingrandisci e concentrati sulle celle.Quindi selezionare le celle di conteggio per ottenere il conteggio APBM. Se il numero di PBMC vitali è superiore a 3 milioni di cellule per millilitro, aliquotare il campione in un massimo di cinque fiale criogeniche a una concentrazione di almeno 3 milioni di cellule per millilitro. Ciascuno di essi documenta il conteggio delle cellule per fiala criogenica sul registro dei campioni.Vedere il protocollo di testo allegato per informazioni su come procedere se il numero di PBMC vitale è inferiore a 3 milioni di cellule per millilitro. Infine, trasferire le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento a velocità controllata e posizionarle a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire le fiale criogeniche in una scatola criogenica e posizionare la scatola nella fase vapore di un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.Documentare l'ora di inizio del congelatore sul registro dei campioni. L'isolamento dell'RNA leucocitario e i metodi di elaborazione del filtro hanno prodotto questa immagine su gel risultante dall'elettroforesi capillare. Sono state prodotte due bande distinte con degradazione minima che rappresentano l'RNA ribosomiale di ATT e 28.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che mantenere registri accurati è fondamentale. Si consiglia di sviluppare un database per archiviare tutte le informazioni sulla fiala criogenica, inclusi il volume, la concentrazione, la qualità, il codice a barre e il luogo di conservazione all'inizio. E ulteriori raccomandazioni sull'organizzazione del campione possono essere trovate nel protocollo di testo.

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