Frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su Comunità

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un protocollo semplificato che consenta un rapido flusso oculare e l'elaborazione simultanea di campioni di sangue intero. In un contesto non clinico, il processamento del vacutainer viene eseguito in modo sovrapposto per consentire l'isolamento efficiente di frazioni di alta qualità di cellule mononucleate del sangue periferico D-N-A-R-N-A o siero pbmc e frazioni residue di plasma e globuli rossi. Il processo inizia con la centrifugazione del vacutainer sierico, la rimozione di un'aliquota da un vacutainer contenente fial per l'isolamento del DNA, la centrifugazione delle provette fial.

Quindi può verificarsi il completamento dell'isolamento del DNA dopo l'isolamento del DNA, l'isolamento dell'RNA derivato dai leucociti dal vacutainer K due EDTA. Il sangue di ciascun vacutainer viene fatto passare attraverso un rispettivo filtro e lavato con PBS, quindi trattato con un agente di stabilizzazione dell'RNA che ritorna al vacutainer contenente il fiale. Il plasma residuo viene prelevato e lo strato mononucleare viene lavato con PBS.

Durante la centrifugazione delle provette, i globuli rossi residui vengono raccolti e il siero separato viene aliquotato. Infine, i pbmc sono conservati in terreno di congelamento cellulare. In definitiva, frazioni di sangue fresco di alta qualità possono essere prodotte entro due ore dalla raccolta e tutti i campioni pronti per il test possono essere disponibili entro due giorni.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che le procedure possono essere eseguite simultaneamente in un contesto non clinico, producendo così materiale di partenza entro due giorni per una moltitudine di applicazioni a valle, tra cui analisi epigenetiche in tempo reale di microarray R-T-P-C-R e citometria a flusso. A dimostrare la procedura sarà Amy Weckl, la mia responsabile di laboratorio per iniziare l'elaborazione del campione di sangue intero. Assicurarsi che i tamponi, la centrifuga e il blocco termico siano stati preparati.

Documentare l'orario di consegna del vacutainer sul foglio di tracciamento del campione. Dopo aver ricevuto i campioni, documentare l'isolamento del siero. Tempo di avvio sul registro del campione, iniziare immediatamente l'elaborazione centrifugando il vacutainer di siero da sette millilitri con il freno e l'accelerazione disattivati.

Utilizzando un rotore a secchiello oscillante con tappi aerosol per 20 minuti a 1300 GS a quattro gradi Celsius mentre il vacutainer del siero viene centrifugato. Documentare l'ora di inizio dell'isolamento del DNA in una cappa di coltura a due cellule BSL. Capovolgere cinque volte i contenitori del vuoto contenenti il gel fial e aggiungere 200 microlitri di sangue intero dalla parte superiore di uno dei vacutainer in ciascuna delle due aliquote da 20 microlitri di proteasi.

Lasciare le provette per proteasi e microcentrifuga del sangue nella cappa e continuare con la centrifugazione della chiamata contenente contenitori vacu. Prima della centrifugazione. Documentare l'ora di inizio dell'isolamento PBMC, che deve essere entro due ore dal prelievo di sangue.

Invertire la chiamata FI contenente contenitori vacu già nei contenitori a tenuta di aerosol da otto a 10 volte. Quindi centrifugare il vacutainer con la pausa e l'accelerazione disattivate per 30 minuti a 1600 Gs 22 gradi Celsius. Rimettere i campioni di isolamento del DNA nella cappa e aggiungere 200 microlitri di tampone a ciascuna delle provette per proteasi e microcentrifuga del sangue.

Tappate i tubi e rimuoveteli dalla cappa. Quindi farli vorticare per 15 secondi. Dopo il vortice lampeggia immediatamente, far girare i campioni.

Procedere con l'isolamento del DNA come descritto nel protocollo di testo allegato fino a quando il DNA non viene alluso dalla colonna su Ellucian. Ha raccolto il DNA delle due colonne per partecipante per una resa totale di 800 microlitri per partecipante. Documentare l'ora di inizio dell'isolamento dell'RNA dei leucociti.

Forare il setto di gomma del vacutainer K due EDTA con una punta di trasferimento. Conservare la guaina e il tappo a vite per un uso successivo dopo l'assemblaggio del sistema di tubi K due EDTA. Utilizzare l'estremità di una spatola metallica per sbloccare in sicurezza l'ago e inserire l'ago in una provetta vuota per la raccolta del sangue sottovuoto da 10 millilitri.

Capovolgere il gruppo del tubo del ricevitore del filtro vacutainer K due EDTA per completare la configurazione Dopo la filtrazione e il lavaggio PBS, prelevare tre millilitri di agente di stabilizzazione dell'RNA utilizzando una nuova siringa da 10 millilitri. Lavare il filtro assicurandosi che l'agente di stabilizzazione dell'RNA rimanga attaccato. Quindi staccare la siringa dal filtro senza ritrarre lo stantuffo.

Sigillare l'ingresso e l'uscita del filtro con la guaina e il tappo a vite trattenuti dalla punta di trasferimento e lasciare il filtro saturo con l'agente di stabilizzazione dell'RNA. Conservare il filtro a meno 80 gradi Celsius per almeno due ore fino a quando il tempo non lo consente per il completamento dell'isolamento dell'artrite reumatoide. Una volta che il vacutainer è stato rimesso nella cappa BSL two, rimuovere il tappo e utilizzare una pipetta sierologica per prelevare 1,5 millilitri dello strato di plasma superiore senza avvicinarsi allo strato mononucleare.

Trasferire il plasma dai due vacutainer a una fiala criogenica da cinque millilitri. Registrare quindi il volume raccolto. Trasferire il plasma rimanente e lo strato mononucleare utilizzando una pipetta sierologica in una provetta conica da 15 millilitri.

Quindi aggiungere abbastanza XPBS precedentemente preparato per portare il volume totale nel tubo conico fino a 15 millilitri. Tappare il tubo e capovolgerlo cinque volte. Quindi centrifugare la provetta con la rottura e l'accelerazione disattivate per 15 minuti a 300 GS 22 gradi Celsius.

Rimettere i contenitori di vuoto fial nel cappuccio e raccogliere i globuli rossi o globuli rossi. Utilizzare una pipetta pastier da cinque e tre quarti di pollice per agitare e allentare l'esterno dello strato di gel fial e rimuoverlo. Utilizzare una pipetta sierologica per raccogliere e trasferire i globuli rossi in una fiala criogenica da cinque millilitri.

Quindi registrare il volume. Successivamente, trasferire le fiale criogeniche di plasma e globuli rossi in un contenitore di congelamento a velocità controllata e conservarle a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire i campioni in una scatola criogenica e riportarli a meno 80 gradi Celsius per la conservazione a lungo termine.

Al termine della centrifugazione, riposizionare il tubo conico nella cappa e aspirare il liquido, lasciando 500 microlitri di PBS senza disturbare il pellet. Aggiungere un XPBS per portare il volume a 10 millilitri e risospendere il pellet. Chiudere delicatamente il tubo e capovolgerlo cinque volte.

Quindi centrifugare il campione con il freno e l'accelerazione disattivati per 10 minuti a 300 GS a 22 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aliquotare lo strato superiore di siero dal vacutainer in fiale criogeniche da due millilitri e documentare il volume. Utilizzare quattro fiale criogeniche e aliquotare 200 microlitri in fiala criogenica.

Uno da 1000 microlitri in fiala criogenica due. Quindi dividere il volume rimanente in fiale criogeniche tre e quattro. Trasferisci le fiale criogeniche in una scatola criogenica e conservale a meno 80 gradi Celsius per una conservazione a lungo termine.

E documenta l'ora di inizio del congelatore. Continuare con l'isolamento PBMC. Rimettendo i campioni nella cappa dopo la centrifugazione, aspirare quanto più surnatante possibile senza disturbare il pellet.

Sospendiamo il pellet in 2,5 millilitri di PBMC. Medio. Aggiungere 2,5 millilitri di PBMC, mezzo di congelamento due contenente DMSO e RPMI.

Mezzo alla soluzione cellulare precedentemente preparata e agitare delicatamente il campione. Quindi aliquotare 10 microlitri della soluzione cellulare in una provetta per microcentrifuga. Aggiungere 10 microlitri di colorante blu per vaschetta allo 0,4% nella provetta per microcentrifuga e mescolare la soluzione pipettando più volte.

Quindi, pipettare 10 microlitri di miscela in una camera di conteggio delle cellule. Far scorrere e posizionare il vetrino nel contacellule entro tre minuti dalla miscelazione. Ingrandisci e concentrati sulle celle.

Quindi selezionare le celle di conteggio per ottenere il conteggio APBM. Se il numero di PBMC vitali è superiore a 3 milioni di cellule per millilitro, aliquotare il campione in un massimo di cinque fiale criogeniche a una concentrazione di almeno 3 milioni di cellule per millilitro. Ciascuno di essi documenta il conteggio delle cellule per fiala criogenica sul registro dei campioni.

Vedere il protocollo di testo allegato per informazioni su come procedere se il numero di PBMC vitale è inferiore a 3 milioni di cellule per millilitro. Infine, trasferire le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento a velocità controllata e posizionarle a meno 80 gradi Celsius per almeno 24 ore. Dopo 24 ore, trasferire le fiale criogeniche in una scatola criogenica e posizionare la scatola nella fase vapore di un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

Documentare l'ora di inizio del congelatore sul registro dei campioni. L'isolamento dell'RNA leucocitario e i metodi di elaborazione del filtro hanno prodotto questa immagine su gel risultante dall'elettroforesi capillare. Sono state prodotte due bande distinte con degradazione minima che rappresentano l'RNA ribosomiale di ATT e 28

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che mantenere registri accurati è fondamentale. Si consiglia di sviluppare un database per archiviare tutte le informazioni sulla fiala criogenica, inclusi il volume, la concentrazione, la qualità, il codice a barre e il luogo di conservazione all'inizio. E ulteriori raccomandazioni sull'organizzazione del campione possono essere trovate nel protocollo di testo.