Name: Frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su Comunità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Impara un protocollo rapido per il frazionamento del sangue intero e l'isolamento di DNA, RNA, plasma e PBMC in contesti non clinici. Questo metodo ottimizzato migliora l'efficienza e la qualità dei campioni per analisi ad alto rendimento.

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Vorremmo ringraziare Henriette Mair-Meijers per l'inestimabile attenzione ai dettagli e le ore dedicate all'elaborazione delle raccolte di sangue. Siamo grati per l'esperienza di progettazione grafica di Natalie Jameson Kiesling. Apprezziamo anche l'approvazione dei produttori (Qiagen (Valencia, CA), BD Biosciences (San Jose, CA), Life Technologies (Grand Island, NY)) menzionati nel presente documento per pubblicare l'uso dei loro prodotti come descritto. I finanziamenti per questo lavoro sono stati generosamente forniti dal National Institutes of Health con i numeri di premio DA022720, RC1MH088283 e DA022720-05-S1.

<ol><li>Hernandez, M. E., Martinez-Fong, D., Perez-Tapia, M., Estrada-Garcia, I., Estrada-Parra, S., Pavon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+effect+of+selective+serotonin-reuptake+inhibitors+on+lymphocyte+subsets+in+patients+with+a+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Neuropsychopharmacol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the effect of selective serotonin-reuptake inhibitors on lymphocyte subsets in patients with a major depressive disorder.</a> Eur Neuropsychopharmacol. 20, 88-95 (2010).</li>
<li>Weigelt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TREM-1+and+DAP12+expression+in+monocytes+of+patients+with+severe+psychiatric+disorders+EGR3%2C+ATF3+and+PU.1+as+important+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun%22%5BJournal%5D)">TREM-1 and DAP12 expression in monocytes of patients with severe psychiatric disorders EGR3, ATF3 and PU.1 as important transcription factors.</a> Brain Behav Immun. 25, 1162-1169 (2011).</li>
<li>Robertson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+subset+differences+in+patients+with+chronic+fatigue+syndrome%2C+multiple+sclerosis+and+major+depression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte subset differences in patients with chronic fatigue syndrome, multiple sclerosis and major depression.</a> Clin Exp Immunol. 141, 326-332 (2005).</li>
<li>Rotter, A., Asemann, R., Decker, A., Kornhuber, J., Biermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orexin+expression+and+promoter-methylation+in+peripheral+blood+of+patients+suffering+from+major+depressive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Orexin expression and promoter-methylation in peripheral blood of patients suffering from major depressive disorder.</a> J Affect Disord. 131, 186-192 (2011).</li>
<li>Klengel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+FKBP5+DNA+demethylation+mediates+gene-childhood+trauma+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Allele-specific FKBP5 DNA demethylation mediates gene-childhood trauma interactions.</a> Nat Neurosci. 16, 33-41 (2013).</li>
<li>Segman, R. H., Shefi, N., Goltser-Dubner, T., Friedman, N., Kaminski, N., Shalev, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+blood+mononuclear+cell+gene+expression+profiles+identify+emergent+post-traumatic+stress+disorder+among+trauma+survivors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Peripheral blood mononuclear cell gene expression profiles identify emergent post-traumatic stress disorder among trauma survivors.</a> Mol Psychiatry. 10, 500-513 (2005).</li>
<li>Smith, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohort+Profile%3A+Generation+Scotland%3A+Scottish+Family+Health+Study+%28GS%3ASFHS%29.+The+study%2C+its+participants+and+their+potential+for+genetic+research+on+health+and+illness%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Cohort Profile: Generation Scotland: Scottish Family Health Study (GS:SFHS). The study, its participants and their potential for genetic research on health and illness.</a> Int J Epidemiol. 42, 689-700 (2013).</li>
<li>Mallone, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+preservation+of+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+analysis+of+islet+antigen-reactive+T+cell+responses%3A+position+statement+of+the+T-Cell+Workshop+Committee+of+the+Immunology+of+Diabetes+Society%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and preservation of peripheral blood mononuclear cells for analysis of islet antigen-reactive T cell responses: position statement of the T-Cell Workshop Committee of the Immunology of Diabetes Society.</a> Clin Exp Immunol. 163, 33-49 (2011).</li>
<li>Duvigneau, J. C., Hartl, R. T., Teinfalt, M., Gemeiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delay+in+processing+porcine+whole+blood+affects+cytokine+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Delay in processing porcine whole blood affects cytokine expression.</a> J Immunol Methods. 272, 11-21 (2003).</li>
<li>Debey, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+isolation+techniques+prior+gene+expression+profiling+of+blood+derived+cells%3A+impact+on+physiological+responses%2C+on+overall+expression+and+the+role+of+different+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics+J%22%5BJournal%5D)">Comparison of different isolation techniques prior gene expression profiling of blood derived cells: impact on physiological responses, on overall expression and the role of different cell types.</a> Pharmacogenomics J. 4, 193-207 (2004).</li>
<li>Uddin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+immune+function+profiles+associated+with+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and immune function profiles associated with posttraumatic stress disorder.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 9470-9475 (2010).</li>
<li>Kessler, R. C., Wang, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+descriptive+epidemiology+of+commonly+occurring+mental+disorders+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The descriptive epidemiology of commonly occurring mental disorders in the United States.</a> Annu Rev Public Health. 29, 115-129 (2008).</li>
<li>Qiagen. QIAamp® DNA Mini and Blood Mini Handbook. , Valencia, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=67893a91-946f-49b5-8033-394fa5d752ea</a> (2010).</li>
<li>Thermo Scientific. NanoDrop 1000 Spectrophotometer. , Waltham, Massachusetts, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8">http://www.nanodrop.com/Library/nd-1000-v3.8-users-manual-8</a> (2010).</li>
<li>Life Technologies. LeukoLOCK™ Total RNA Isolation System. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf">http://www.ambion.com/techlib/misc/leuko_iso.pdf</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. Countess™ Automated Cell Counter. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess">http://www.lifetechnologies.com/content/dam/LifeTech/migration/files/cell-analysis/pdfs.par.5257.file.dat/mp10227-countess</a> (2009).</li>
<li>Life Technologies. Alternative Protocol for Extraction of RNA from Cells Captured on LeukoLOCK™ Filters Using TRI Reagent®. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html">http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/references/protocols/nucleic-acid-purification-and-analysis/rna-protocol/alternative-protocol-extraction-of-rna-from-cells-captured-on-leukolock-filters-using-tri-reagent.html</a> (2011).</li>
<li>Life Technologies. DNA-free™ Kit. , Grand Island, New York, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf">http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/cms_055739.pdf</a> (2012).</li>
<li>Agilent Technologies. Agilent RNA 6000 Nano Kit Guide. , Santa Clara, California, USA. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf">http://www.genomics.agilent.com/files/Manual/G2938-90034_KitRNA6000Nano_ebook.pdf</a> (2006).</li>
<li>Koenen, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC6A4+methylation+modifies+the+effect+of+the+number+of+traumatic+events+on+risk+for+posttraumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Depress+Anxiety%22%5BJournal%5D)">SLC6A4 methylation modifies the effect of the number of traumatic events on risk for posttraumatic stress disorder.</a> Depress Anxiety. 28, 639-647 (2011).</li>
<li>Walsh, K., Uddin, M., Soliven, R., Wildman, D. E., Bradley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+between+the+SS+variant+of+5-HTTLPR+and+PTSD+among+adults+with+histories+of+childhood+emotional+abuse%3A+Results+from+two+African+American+independent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Associations between the SS variant of 5-HTTLPR and PTSD among adults with histories of childhood emotional abuse: Results from two African American independent samples.</a> J Affect Disord. 161, 91-96 (2014).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. Childhood maltreatment is associated with epigenetic differences in hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis genes in the Detroit Neighborhood Health Study. American Association of Physical Anthropologists 82nd Annual Meeting, Knoxville, TN, , Comprehensive Psychiatry. (2013).</li>
<li>Sipahi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+epigenetic+variation+of+DNA+methyltransferase+genes+is+associated+with+vulnerability+to+post-traumatic+stress+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Longitudinal epigenetic variation of DNA methyltransferase genes is associated with vulnerability to post-traumatic stress disorder.</a> Psychol Med. 44, 3165-3179 (2014).</li>
<li>Uddin, M., Koenen, K. C., Aiello, A. E., Wildman, D., de los Santos, R., Galea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+and+inflammatory+marker+profiles+associated+with+depression+in+a+community-based+epidemiologic+sample%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med%22%5BJournal%5D)">Epigenetic and inflammatory marker profiles associated with depression in a community-based epidemiologic sample.</a> Psychol Med. 41, 997-1007 (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 3rd North American Congress of Epidemiology, Montreal, QC, , (2011).</li>
<li>Uddin, M., et al. Post-traumatic stress disorder is associated with immunosenescent T cell phenotypes in the Detroit Neighborhood Health Study. 101st Annual Conference of the American Psychopathological Association, New York, NY, , (2011).</li>
<li>Uddin, M. Biological signatures of post-traumatic stress disorder in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Aiello, A. E. Cytomegalovirus antibodies as a marker of immunosenescence in the Detroit Neighborhood Health Study. 9th International Conference on Urban Health, New York Academy of Medicine, , (2010).</li>
<li>Bustamante, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBustamante%2C+AC+%22Distinct+gene+expression+profiles+characterize+lifetime+PTSD+and+childhood+maltreatment+in+the+Detroit+Neighborhood+Health+Study%22">Distinct gene expression profiles characterize lifetime PTSD and childhood maltreatment in the Detroit Neighborhood Health Study</a>. , International Society for Traumatic Stress Studies. Philadelphia, PA. (2013).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

Abbiamo descritto un protocollo semplificato che è stato applicato con successo a elaborare più di 1.600 campioni di sangue intero in Health Study Detroit Quartiere. Sebbene molte di queste tecniche sono disponibili in letteratura, il nostro compilazione passo-passo, comprese le modifiche temporizzati precisamente ogni aumento, riflette una ottimizzata, protocollo efficiente che produce con successo una varietà di campioni biologici con una vasta gamma di applicazioni a valle, tra cui la metilazione del DNA, espressione...

Molteplici studi hanno caratterizzato le differenze di espressione genica, la metilazione del DNA e sottoinsieme di cellule nel sangue tra gli individui con e senza mentale (o altro) malattie 1-4. Questi studi, tuttavia, sono stati ottenuti da situazioni cliniche in cui le differenze malattie associate possono essere amplificate a causa della natura generalmente più grave delle malattie per le quali pazienti stanno cercando di trattamento. Grazie ai progressi in tecnologie "omiche", l'ultimo decennio ha visto un'esplosione di interesse ad ottenere campioni biologici provenienti da comunità e / o le impostazioni epidemiologici 5-7, al fine di fornire stime basate sulla popolazione di prevalenza della malattia e di un quadro più ampio della determinanti ambientali di queste malattie mentali e / o fisici. Una sfida chiave in questo senso è il requisito per una rapida elaborazione dei campioni raccolti. Degradazione delle cellule mononucleate, componenti chiave del sistema immunitario che sono frequently utilizzato per valutare la salute di un individuo, inizia subito dopo prelievo di sangue con una diminuzione significativa recupero dopo 2 ore di raccolta 8-10. Per affrontare questa sfida, vi presentiamo un protocollo ottimizzato in cui più componenti del sangue umano intero sono contemporaneamente isolati da campioni ottenuti nelle case di soggetti che vivono in una grande area metropolitana. Il protocollo si basa sulla nostra compilazione e modifica delle tecniche attuali, compreso lo stoccaggio di tutte le frazioni "extra" in caso di tecniche future permettono di ulteriore isolamento / analisi. Mentre i metodi o kit alternativi possono essere impiegati al posto dei singoli metodi qui descritti, quelli delineati hanno dimostrato di essere un mezzo affidabile ed efficiente per la lavorazione dei campioni in maniera high-throughput. Frazioni di alta qualità (PBMC, DNA, siero, e RNA) di sangue fresco possono essere prodotti in 2 ore di raccolta e di tutti i campioni del test-ready può essere disponibile entro 2 giorni (Figura 1). Questo protocollo è stato sviluppato per consentire il trattamento efficiente dei campioni raccolti da residenti in comunità, adulti residenti della città di Detroit per la sperimentazione in Detroit Quartiere Health Study (DNHS; DA022720, RC1MH088283, DA022720-05-S1) un basato sulla popolazione, studio dei determinanti sociali e biologiche del disturbo post-traumatico da stress (PTSD) e di altre malattie mentali. La prevalenza di PTSD a Detroit è più del doppio della media nazionale 11,12. Identificare determinanti biologiche di PTSD in questa popolazione può aiutare a sviluppare farmacologico adeguato e / o interventi cognitivo-comportamentali per aiutare coloro che soffrono di questo disturbo, sia in questa popolazione urbana, e in altre popolazioni ad alto rischio (ad esempio, tornando veterani militari). Il nostro laboratorio, precedentemente situato presso la Wayne State University di Detroit, Michigan, è stato selezionato per l'elaborazione sulla base della nostra esperienza nella gestione di campioni di tessuto fresche provenienti da una varietàdelle fonti, la necessità di iniziare il trattamento dei campioni in 2 ore di raccolta, e la nostra vicinanza ai siti di raccolta. Con questa opportunità unica a portata di mano, il nostro obiettivo era quello di ottimizzare il trattamento per il massimo rendimento di DNA, RNA, siero e le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) da ciascun campione (per un totale di N = 1.639 campioni in 5 ondate di raccolta del campione). Le procedure descritte qui possono essere eseguite contemporaneamente in un contesto non clinico, producendo materiale (vedi Tabella 1 per rendimenti medi) di partenza per un gran numero di applicazioni a valle, tra cui microarray, epigenetica, real-time RT-PCR, e citometria a flusso analisi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" width="700"> Figura 1. flusso di lavoro complessivo. Il processo globale raffigurato qui comprende la logistica di ottenere i campioni di sangue da identificare consenzienti particparte- al sangue disegnare sé. Di alta qualità, le frazioni (cellule mononucleate del sangue periferico, PBMC, DNA, siero, e RNA) di sangue intero fresco può essere prodotto in 2 ore di raccolta e di tutti i campioni del test-ready può essere disponibile entro 2 giorni. Inoltre, le frazioni preparati con questo metodo sono adatti per lo stoccaggio a lungo termine se i campioni non devono essere testati immediatamente. L'intera timeline qui delineato potrebbe essere completata in un solo giorno (~ 5 ore in totale). Tuttavia, un tale giorno sarebbe estremamente laborioso soprattutto per un singolo tecnico con esperienza sostanziale con le tecniche. Pertanto, si consiglia di dividere le procedure il giorno 1 tra almeno due tecnici e il completamento del trattamento RNA Day 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52227/52227fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Mini kit QIAamp DNA Blood</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Giorno 1: Isolamento del DNA</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5493-1L</td><td>Giorno 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>5 &frac34; &rdquo; Pasteur pipette</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Giorno 1: isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS), inattivato a calore</td><td>Life Technologies</td><td>10082147</td><td>Giorno 1: isolamento PBMC</td></tr><tr><td>dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D8418-500ml</td><td>Giorno 1: isolamento PBMC</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640, liquido</td><td>Invitrogen</td><td>11875119</td><td>Giorno 1: isolamento PBMC</td></tr><tr><td>0,4% colorazione blu di tripano&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Giorno 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Camera di conteggio delle cellule Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Giorno 1:</td></tr><tr><td>Contatore di cellule automatizzato Countess con isolamento PBMC o dispositivo di conteggio delle cellule come un microscopio e un emocitometro</td><td>Invitrogen</td><td>C10281</td><td>Giorno 1: Isolamento PBMC</td></tr><tr><td>Frazionamento LeukoLOCK & Kit di stabilizzazione&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>1933</td><td>Giorno 1: Isolamento dell'RNA leucocitario</td></tr><tr><td>25&nbsp; G x 5/8 pollici aghi</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td> Giorno 1: Siringhe per <td>isolamento dell'RNA leucocitario</td></tr><tr><td>(5&nbsp; ml)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td> Giorni 1 e 2: Soluzione di lisi denaturante per <td>l'isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>8540G</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA leucocitario</td></tr><tr><td>5&nbsp; M NaCl</td><td>Life Technologies</td><td>24740011</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>Reagente TRI</td><td>Ambion</td><td>9738</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>Bromo-3-cloro-propano (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B-9673</td> Giorno 2: Cartucce di spin per <td>l'isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>10051G</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA leucocitario</td></tr><tr><td>0,1&nbsp; mM EDTA</td><td>Ambion</td><td>9912</td><td>Giorno 2: Isolamento dell'RNA dei leucociti</td></tr><tr><td>Kit senza DNA</td><td>Ambion</td><td>AM1960</td> Giorno 2: Scala RNA 6000 <td>per trattamento DNasi</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1529</td><td>Giorno 2: Analisi del bioanalizzatore</td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Series II Kit&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>Giorno 2: Analisi del bioanalizzatore</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>Ambion</td><td>AM8782</td><td>Giorno 2: Analisi del bioanalizzatore</td></tr><tr><td>Etanolo >99%</td><td>Sigma</td><td>E7023-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo >99%&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I9516-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultra pura senza nucleasi&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>9938</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (senza nucleasi)</td><td>Eppendorf</td><td>22491253</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter (sierologico)</td><td>Eppendorf</td><td>2223020-4</td><td></td></tr><tr><td>Pipetter (per volumi inferiori a 1&nbsp; ml)</td><td>Eppendorf</td><td>3120000-054</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (sierologiche)</td><td>Fisher</td><td>13-678-27E</td><td></td></tr><tr><td>Contenitori per congelamento a velocità controllata</td><td>Nalgene</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox (per contenere 2&nbsp; ml e 5&nbsp; ml crioviali e 1,5&nbsp; ml provette per microcentrifuga)</td><td>Fisher</td><td>03-395-464</td><td></td></tr><tr><td>Rack per provette</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-804-134</td><td></td></tr><tr><td>15&nbsp; ml tubi in polipropilene</td><td>Fisher</td><td>14-959-49D</td><td></td></tr><tr><td>1.5&nbsp; provette per microcentrifuga ml e 0,65</td><td>Fisher</td><td>07-200-534 e 07-200-185</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; ml e 5&nbsp; ml crioviali</td><td>Fisher</td><td>10-500-26 e 10-269-88F&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>8&nbsp; ml CPT vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>2 provette</td></tr><tr><td>6&nbsp; ml K2 vacutainer EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>367863</td><td>2 provette</td></tr><tr><td>8,5&nbsp; ml SST vacutainer</td><td>BD Biosciences</td><td>367988</td><td>1 provetta</td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore a bagno secco con blocco riscaldante per provette per microcentrifuga</td><td>Fisher</td><td>11-715-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtrazione/vuoto per l'uso all'interno della cappa per colture cellulari</td><td>Fisher</td><td>01-257-87</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso per provette per microcentrifuga con coperchio</td> <td>a tenuta di aerosolEppendorf</td><td>22637002</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata con rotore a secchiello oscillante e tappi a tenuta di aerosol per 16 x 125&nbsp; mm vacutainers e 15&nbsp; ml di tubi in polipropilene</td><td>Eppendorf</td><td>22628157</td><td>2, non è necessario refrigerare</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000 (consigliato per la precisione di piccoli volumi) o altro dispositivo spettrofotometrico</td><td>Fisher</td><td>13-400-411</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Bioanalyzer Agilent</td><td>Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Serbatoio di azoto liquido</td><td>Thermo Scientific</td><td>11-676-56</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per oggetti taglienti</td><td>Fisher</td><td>22-037-970</td><td></td></tr><tr><td>Contenitore per rifiuti biologici</td><td>Thermo Scientific</td><td>1223P52</td><td></td></tr><tr><td>Cappa per colture cellulari certificata Biosafety Level 2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-261-315</td><td></td></tr></tbody></table>

frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su comunità

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Raccolta e lavorazione di campioni di sangue intero in un contesto non clinico offre un&#39;opportunità unica per valutare residenti in comunità gli individui con e senza condizioni preesistenti. Elaborazione rapida di questi campioni è essenziale per evitare la degradazione dei componenti cellulari chiave. Vi sono incluse le modalità di simultanea periferico delle cellule mononucleate del sangue (PBMC), DNA, RNA e l&#39;isolamento del siero da un unico prelievo di sangue effettuato nelle case dei partecipanti consentendo all&#39;interno delle aree metropolitane, con l&#39;elaborazione iniziata entro 2 ore di raccolta. Abbiamo usato queste tecniche per elaborare oltre 1.600 campioni di sangue cedevole, materiale costante qualità elevata, che è stato successivamente utilizzato in metilazione del DNA, la genotipizzazione, espressione genica successo e citometria a flusso analisi. Alcuni dei metodi utilizzati sono di serie; tuttavia, se combinati nel modo descritto, consentono un&#39;efficiente elaborazione dei campioni di partecipanti di population- e / o community-studi basati che normalmente non verrebbero valutati in un ambiente clinico. Pertanto, questo protocollo ha il potenziale per ottenere campioni (e, successivamente, dati) che sono più rappresentativi della popolazione generale.

È essenziale che la procedura generale produrre materiale di alta qualità per l'analisi in una moltitudine di applicazioni a valle compresa l'espressione genica tramite microarray e l'analisi RT-PCR, rilevazione di modificazioni epigenetiche, e variazioni subset cellulare. Tabella 1 indica la resa media e qualità dei materiali da ciascuno dei processi. La figura 3 fornisce un esempio dell'output qualità dell'isolamento leucociti RNA e filtri metodi di lavorazione. L'imm...

Delineiamo una metodologia per il trattamento del sangue intero per ottenere una varietà di componenti per ulteriori analisi. Abbiamo ottimizzato un protocollo semplificato che consente l'elaborazione simultanea rapida e ad alta produttività di campioni di sangue intero in un contesto non clinico.

Frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su Comunità

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un protocollo semplificato che consenta un rapido flusso oculare e l'elaborazione simultanea di campioni di sangue intero. In un contesto non clinico, il processamento del vacutainer viene eseguito in modo sovrapposto per consentire l'isolamento efficiente di frazioni di alta qualità di cellule mononucleate del sangue periferico D-N-A-R-N-A o siero pbmc e frazioni residue di plasma e globuli rossi. Il processo inizia con la centrifugazione del vacutainer sierico, la rimozione di un'aliquota da un vacutainer contenente fial per l'isolamento del DNA, la centrifugazione delle provette fial.Quindi può verificarsi il completamento dell'isolamento del DNA dopo l'isolamento del DNA, l'isolamento dell'RNA derivato dai leucociti dal vacutainer K due EDTA. Il sangue di ciascun vacutainer viene fatto passare attraverso un rispettivo filtro e lavato con PBS, quindi trattato con un agente di stabilizzazione dell'RNA che ritorna al vacutainer contenente il fiale. Il plasma residuo viene prelevato e lo strato mononucleare viene lavato con PBS.Durante la centrifugazione delle provette, i globuli rossi residui vengono raccolti e il siero separato v

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Questo video mostra la preparazione di plasma ricco di piastrine (PRP) di alta qualità mediante screening per la conta piastrinica, raccolta e centrifugazione del sangue e isolamento delle piastrine. Questo PRP è utilizzato in applicazioni terapeutiche per la rigenerazione e la guarigione dei tessuti.

Preparazione di plasma ricco di piastrine da sangue periferico umano

Qui si descrive un protocollo per isolare sottoinsiemi di precursore cellule B dal sangue del cordone ombelicale. Una sufficiente quantità e qualità di acidi nucleici può essere estratto dalle cellule e utilizzati in saggi successivi utilizzando DNA o RNA.

Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

Leucociti e piastrine può essere utilizzato come marcatore bioenergetico di salute generale di un individuo e quindi hanno il potenziale per controllare i processi patologici e l'impatto dei trattamenti. Qui si descrive un metodo per isolare e misurare la funzione mitocondriale e il burst ossidativo in queste cellule.

Bioenergetica e il burst ossidativo: Protocolli per l&#39;isolamento e la valutazione dei leucociti umani e piastrine

'Leucociti-Piastrine Ricche di Fibrina (L-PRF) rappresenta una preparazione approvata dalla FDA di concentrati piastrinici autologhi che possiede un'architettura unica della fibrina, piastrine arricchite e abbondanti fattori di crescita. Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di L-PRF alla poltrona e ne valutiamo le proprietà meccaniche, inclusi i test uniassiali e i test di forza di ritenzione della sutura.

Caratterizzazione di leucociti-piastrine Rich fibrina, un biomateriale Novel

Qui, presentiamo un protocollo per isolare la membrana plasmatica, citoplasma e nei mitocondri delle cellule U937 senza l'uso di centrifugazione ad alta velocità. Questa tecnica può essere utilizzata per purificare le frazioni subcellulari per l'esame successivo di localizzazione della proteina tramite immunoblotting.

Il frazionamento delle cellule delle cellule U937 in assenza di centrifugazione ad alta velocità

Questo protocollo descrive in dettaglio la preparazione clinicamente implementabile di pbmc di alta qualità e biocampioni al plasma nel sito di sperimentazione clinica che possono essere utilizzati per l'analisi del biomarcatore trascizionale.

Preparazione di pellet e plasma di cellule mononucleari periferici da un singolo estrapolazione di sangue presso siti di studio clinico per l'analisi dei biomarcatori

Presentiamo un semplice protocollo per l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico da sangue intero ottenuto da pazienti con diagnosi di Sindrome di Sézary, seguito dalla selezione di cellule T CD4+, dalla loro stimolazione con phorbol12-myristate13-acetato e A23187 ionoforo, e dalla preparazione dell'RNA per la profilazione trascrittomica.

Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico umano e delle cellule T CD4+ da pazienti con sindrome di Sézary per la profilazione trascrittomica

Questo protocollo descrive un metodo per l'isolamento dei neutrofili dal sangue intero, dai cappotti buffy o dalle membrane di leucaferesi, ottenendo una buona resa, un'elevata purezza e un'attivazione cellulare minima. Utilizziamo la purificazione a gradiente, la sedimentazione dei globuli rossi (RBC) e la lisi dei globuli rossi per ottenere una preparazione neutrofila di alta qualità / purezza.

Isolamento dei neutrofili umani da Whole Blood e Buffy Coats

Le biobanche sono risorse cruciali per la ricerca biomedica e l'unità Biobank for Translational and Digital Medicine presso l'Istituto europeo di oncologia è un modello in questo campo. Qui forniamo una descrizione dettagliata delle procedure operative standard delle biobanche per la gestione di diversi tipi di campioni biologici umani.

Biobanca per la medicina traslazionale: procedure operative standard per una gestione ottimale dei campioni

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo compatibile con l'automazione ad alto rendimento per isolare cellule mononucleate del sangue periferico umano per la biobanca e altri scopi.

Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano da Buffy Coats tramite separazione di microsfere immunomagnetiche ad alto rendimento

Impara un protocollo rapido per il frazionamento del sangue intero e l'isolamento di DNA, RNA, plasma e PBMC in contesti non clinici. Questo metodo ottimizzato migliora l'efficienza e la qualità dei campioni per analisi ad alto rendimento.

Frazionamento rapida e isolamento dei componenti sangue intero in campioni ottenuti da una impostazione basata su Comunità

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