Generazione di plasmidi vettori che esprimono proteine FLAG-tagged Ai sensi del regolamento di Human Factor-allungamento 1α Promotore Uso Gibson Assembly
9 febbraio 2015
La sintesi di plasmidi personalizzati richiede lavoro e tempo. Questo protocollo descrive l'uso della clonazione dell'assemblaggio Gibson per ridurre il lavoro e la durata della procedura di clonazione del DNA personalizzata. Il protocollo descritto produce anche costrutti proteici marcati affidabili per l'espressione nei mammiferi a un costo simile al tradizionale clonaggio del DNA taglia e incolla.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare l'approccio dell'assemblaggio di Gibson per creare costrutti di DNA grandi e complessi che combinano segmenti corti e lunghi da diverse fonti di DNA. In primo luogo, progettare computazionalmente la sequenza nucleotidica completa dei plasmidi e quindi progettare set di primer sovrapposti. Successivamente, i modelli di DNA per la reazione di assemblaggio vengono amplificati mediante PCR.
Successivamente, viene eseguita una purificazione dei prodotti PCR. La fase finale è la trasformazione della reazione di assemblaggio dei plasmidi risultanti e la verifica del clone plasmidico. In definitiva, la reazione di assemblaggio di Gibson viene utilizzata per sviluppare plasmidi paralleli che contengono versioni marcate flag delle proteine CSTF 64 wild type e mutanti sotto la regolazione trascrizionale del fattore di allungamento umano uno promotore alfa.
Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il DNA Corning tradizionale, è che può creare in parallelo, simili nel design, plasmidi wild type e mutanti senza passaggi sequenziali di Corning. Progettare una sequenza nucleotidica continua per rappresentare il plasmide finale. Ora elenca i plasmidi e i frammenti di DNA effettivi che verranno utilizzati come modelli nei frammenti di DNA dell'ordine PCR che non sono prontamente disponibili, come diverse combinazioni di tag e promotori come frammenti di DNA sintetici a doppio filamento singoli o multipli.
Successivamente, dividere la sequenza nucleotidica continua del costrutto finale in frammenti di DNA adatti alla PCR. Confermare che i frammenti corrispondano ai plasmidi disponibili e ai frammenti di DNA sintetico. Evitare frammenti di DNA più piccoli di 200 nucleotidi.
Accanto ad accedere allo strumento di generazione del primer, selezionare il menu delle preferenze nella finestra pop-up di modifica delle impostazioni dell'assieme Gibson. Seleziona la scheda cambia pres, quindi seleziona il menu costruisci costrutto per inserire i frammenti di DNA divisi nello strumento di generazione del primer in sequenza dai cinque primi ai tre primi. Apri la finestra Inserisci vettore o Inserisci frammento, incolla il primo frammento di DNA che rappresenta le cinque estremità prime del DNA vettore in formato A veloce e nomina questo frammento di DNA.
Scegli il modo appropriato per ottenere il frammento di DNA. Quindi fare clic sulla scheda continua. Se è necessario aggiungere ulteriori nucleotidi o siti di restrizione alla giunzione del costrutto finale, aprire il frammento di aggiunta e inserimento nella finestra di assemblaggio nelle aree del distanziatore di primer in avanti o all'indietro.
Inserire i nucleotidi extra o i siti di restrizione a uno solo dei frammenti di DNA. Quindi fare clic sulla scheda Fine. Ripetere l'operazione per tutti i frammenti fino al completamento del costrutto.
Seleziona il menu Visualizza primer ed esamina le sequenze di primer. Ripetere anche per tutti i costrutti, vettori, dorsali e inserti o per frammenti di DNA diversi. Diluire i primer PCR a 10 micromolari in acqua o tampone.
Quindi diluire tutti i modelli di DNA e il DNA sintetico a singolo filamento per le PCR a un nanogrammo per microlitro in acqua. Assemblare le reazioni di PCR a temperatura ambiente combinando 2,5 microlitri di 10 micromolari di ciascun primer. Un microlitro del frammento di DNA modello da un nanogrammo per microlitro 25 microlitri di caldo.
Inizia a correggere le bozze di DNA polimerasi e 19 microlitri di acqua. Mescolare la provetta con un leggero movimento e raccogliere le goccioline di liquido mediante una breve centrifugazione. Amplificare simultaneamente in provette separate, i frammenti di DNA di dimensioni simili secondo le raccomandazioni per la DNA polimerasi utilizzata.
Eseguire da 25 a 28 cicli di PCR o determinare il numero di cicli che producono una resa di DNA sufficiente. Risolvere cinque microlitri di PCR utilizzando l'elettroforesi su gel standard AROS. Verificare che sia visibile una singola banda di DNA che rappresenta il prodotto PCR.
Determinare la dimensione e la quantità relativa dei frammenti di DNA utilizzando gli standard di peso molecolare del DNA, se necessario, ripetere la PCR per ottenere una quantità sufficiente di frammenti di DNA. Trasferire le PCR predigerite con DPN da una a provette da 1,5 millilitri e aggiungere 81 microlitri di microsfere magnetiche di purificazione del DNA a ciascuna provetta. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 10 minuti.
Posizionare i tubi sul collettore magnetico per due minuti. Ora, scarta il liquido trasparente. Lavare due volte con 200 microlitri di etanolo all'80% per 30 secondi.
Quindi risospendere le perle essiccate in 10 microlitri di tris cloridrato da 10 millimolari pH 8.0 Dopo due minuti, centrifugare brevemente e quindi posizionare le provette sul collettore magnetico per due minuti. Rimuovere da 8,5 a 10 microlitri della soluzione limpida e metterla in un nuovo tubo pre-etichettato. Determinare la concentrazione dei frammenti di DNA mediante spettroscopia UV.
Utilizzare almeno 100 nanogrammi di frammento di DNA che rappresenti la spina dorsale vettoriale o il frammento di DNA che trasporta il marcatore selettivo. Calcola l'eccesso di tre molari per i frammenti di DNA che verranno utilizzati come inserti. Mescolare le quantità calcolate di frammenti di DNA in una provetta per PCR.
Quindi regolare il volume a 10 microlitri. Aggiungere 10 microlitri del master mix di assemblaggio Gibson. Incubare la reazione a 50 gradi Celsius in un termociclatore PCR.
Procedere con la trasformazione del prodotto di assemblaggio incompetente e coli, oppure congelare i prodotti a meno 20 gradi centigradi fino al momento del bisogno. Seguire la procedura di trasformazione che accompagna le celle chimiche o elettrocompetenti. Di solito utilizzare due microlitri della reazione di assemblaggio per reazione di trasformazione.
Infine, confermare il successo del clonaggio del DNA mediante sequenziamento del DNA utilizzando primer specifici o standard. Analizza i dati di sequenziamento per verificarne l'accuratezza. Questo esperimento è stato progettato per clonare la proteina 64 del fattore di stimolazione della scissione e anche il CSTF 64 mutante.
Proteine fuse in un tag a tre x flag sotto la regolazione espressiva del promotore alfa HE F1. Un plasmide contenente HE F1 alfa seguito da un tag a tre x non era disponibile per noi. Tuttavia, erano disponibili i seguenti plasmidi.
PC DNA 3.1 M sibila HF un alfa contenente plasmidi e plasmidi CSTF 64 di topo. L'intera sequenza per il costrutto è stata assemblata utilizzando le applicazioni di modifica dei nucleotidi e del testo. Successivamente, la sequenza è stata divisa in quattro pezzi convenienti corrispondenti al DNA plasmidico disponibile.
I quattro frammenti di DNA per le reazioni di assemblaggio sono stati amplificati mediante PCR. I plasmidi risultanti da singoli cloni sono stati amplificati e analizzati mediante digestione con enzimi di restrizione per un corretto assemblaggio nel vettore di DNA pc. Una volta padroneggiata la tecnica di assemblaggio, compresa la progettazione del plasmide e della primaria, la successiva verifica della PCR e della comunicazione può essere eseguita entro cinque giorni, escludendo il tempo per la sintesi e la consegna del DNA primario e sintetico.
Panoramica
Questo protocollo descrive l'uso del clonaggio mediante assemblaggio Gibson per ottimizzare la sintesi di plasmidi personalizzati, riducendo in modo significativo il tempo e lo sforzo richiesti per il clonaggio del DNA. Consente la creazione di costrutti proteici marcati affidabili per l'espressione in cellule mammifere a un costo paragonabile a quello dei metodi tradizionali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia Molecolare
- Ingegneria Genetica
- Espressione Proteica
Sfondo
- La sintesi personalizzata di plasmidi è tradizionalmente un processo laborioso.
- L'assemblaggio Gibson consente la creazione parallela di plasmidi.
- Le proteine marcate sono essenziali per lo studio della funzione proteica.
- Tecniche di clonaggio efficienti sono fondamentali per la ricerca genetica.
Scopo dello studio
- Semplificare il processo di creazione di costrutti complessi di DNA.
- Produrre contemporaneamente plasmidi di tipo selvaggio e mutanti.
- Migliorare l'efficienza dell'assemblaggio di plasmidi per l'espressione nei mammiferi.
Metodi Utilizzati
- Progettazione di set di primer sovrapposti per l'assemblaggio del DNA.
- Amplificazione di template di DNA mediante PCR.
- Purificazione dei prodotti della PCR prima dell'assemblaggio.
- Trasformazione di E. coli competenti con plasmidi assemblati.
Risultati principali
- Assemblaggio riuscito di plasmidi contenenti proteine CSTF 64 con marcatura a bandiera.
- Verifica dei costrutti plasmidici mediante sequenziamento.
- Dimostrazione dei vantaggi dell'assemblaggio parallelo rispetto ai metodi tradizionali.
- Produzione di costrutti sotto il controllo del promotore umano del fattore di allungamento uno alfa.
Conclusioni
- Il metodo di assemblaggio Gibson riduce in modo significativo il tempo di clonaggio.
- Permette la produzione efficiente di costrutti proteici con marcatura.
- Questo approccio può essere applicato a vari progetti di ingegneria genetica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La generazione rapida e parallela di vettori plasmidici personalizzati mediante assemblaggio Gibson consente una produzione efficiente di costrutti proteici marcati per studi funzionali in sistemi mammiferi. Questo approccio risolve il collo di bottiglia legato alla stabilità dell'espressione guidata dal promotore e alla disponibilità dei costrutti, sostenendo le fasi iniziali della scoperta e la validazione degli obiettivi. Il metodo aumenta l'affidabilità predittiva e accelera la selezione del portafoglio riducendo i tempi del ciclo di clonaggio e migliorando l'affidabilità dei costrutti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente un'analisi rapida della funzione genica mediante costrutti di espressione personalizzabili.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico supportando studi paralleli su proteine wild-type e mutanti.
- Migliora l'affidabilità predittiva nella validazione del target garantendo un'espressione genica stabile nei modelli di cellule staminali.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara vettori di espressione validati per saggi fenotipici o biochimici successivi.
- Permette la standardizzazione dei saggi consentendo la generazione riproducibile di costrutti con promotori e marcatori definiti.
- Accelera la prontezza per lo screening riducendo i tempi di assemblaggio dei costrutti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la progettazione del costrutto a sistemi pertinenti alle malattie, consentendo l'espressione in cellule staminali di mammifero.
- Permette una continuità dalla scoperta alla validazione preclinica grazie a un'espressione robusta mediata da promotore.
- Riduce il rischio di perdita di espressione, favorendo studi traslazionali su biomarcatori quando rilevante.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo basato sull'assemblaggio Gibson integra le fasi iniziali di scoperta e sviluppo del saggio, collegando la progettazione del costrutto alla validazione funzionale in sistemi mammiferi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la generazione rapida di costrutti per lo studio della funzione genica.
- Screening: Fornisce plasmidi pronti per il saggio, riproducibili e con potenziale di output quantitativo.
- Analisi: Fornisce costrutti verificati per sequenza, supportando il confronto affidabile degli effetti delle proteine di tipo selvaggio e mutanti.
- Ricerca traslazionale: Facilita l'espressione in modelli di cellule staminali pertinenti per le malattie, sostenendo la continuità preclinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro scalabile e riutilizzabile per le future esigenze di costrutti in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica negli studi sulla funzione genica.
- Valore operativo: Standardizza e accelera la generazione di costrutti con elevata riproducibilità.
- Valore strategico: Consente decisioni più rapide di tipo go/no-go e migliora l'efficienza del capitale accorciando i cicli di clonaggio.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di target validati con un'adeguata gestione del rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nella progettazione computazionale di sequenze e negli strumenti di generazione di primer.
- Necessita dell'accesso a infrastrutture per PCR, purificazione del DNA e sequenziamento.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la progettazione delle costruzioni e i passaggi di verifica.
- Adattabile a diversi sistemi modello mediante opportuna scelta di promotori ed etichette.
- Dipende dalla disponibilità dei DNA stampo e dai tempi di approvvigionamento dei frammenti di DNA sintetico.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Title
1:30
In Silico Design: Final Plasmid and Overlapping Primers
3:58
Amplification of the DNA Fragments
5:44
DNA Purification Using Magnetic Beads
6:58
Assembly Cloning Reaction and Transformation of the Products in E. coli
8:21
Results: Cloning of CstF-54 and CstF-64 Mutants Under the Transcriptional Regulation of Human Elongation Factor 1α Promoter
9:47
Conclusion
