Name: Citometria a flusso Protocolli per superficie e intracellulare Antigen analisi di tipi di cellule neurali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Impara la citometria a flusso per analizzare antigeni di superficie e intracellulari nelle cellule neurali. Questo protocollo dettagliato guida i neurobiologi nell'identificazione di sottopopolazioni specifiche.

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Il nostro programma di ricerca è finanziato attraverso il programma Emmy Noether della Fondazione tedesca per la ricerca (DFG), sovvenzione PR1132/3-1. Si ringrazia l'ulteriore sostegno della Fondazione Müller-Fahnenberg dell'Università di Friburgo. Questo studio è stato in parte sostenuto dall'Excellence Initiative della German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

1. Neural raccolta cellulare <ol><li> Valutazione al microscopio: <ol><li> Prima di avviare un esperimento, verificare lo stato della cultura in campo chiaro o contrasto di fase. NOTA: Mentre tessuto neurale primaria ottenuti da dissezioni è, in linea di principio, ugualmente suscettibili di analisi citofluorimetrica 14,28, si ricorda che l&#39;attenzione del protocollo è sulle cellule ottenute da sistemi cellulari neuronali in vitro. </li></ol></li><li> Cellule di vendemmia 7: <ol><li> Lavare delicatamente il piatto / boccetta di cellule aderenti con Mg 2+ / Ca 2+ tampone fosfato salino gratuito (PBS) a temperatura ambiente (per esempio, 5 ml di pallone T75, 3 ml per pozzetto per 6 pozzetti, o 10 ml 10 centimetri piatto). NOTA: Il PBS utilizzato in tutto il protocollo è Mg 2+ / Ca 2+ gratuito. <ol><li> Per l&#39;esempio video, utilizzare un pallone T75 di cellule di neuroblastoma SH-SY5Y al 80% di confluenza. Applicare fasi di lavaggio supplementari nei casi in cuiconsiderevole detriti è presente nel piatto. </li><li> Considerare lavaggi con siero-albumina contenenti PBS 48, Percoll, o Ficoll 49 sfumature di centrifugazione e / o perline disponibili in commercio 50,51. Rimozione di mielina e altri lipidi o altri contaminanti è fondamentale, soprattutto quando si utilizzano fonti primarie tessuti adulti. </li></ol></li><li> Aggiungere pre-riscaldato (37 ° C) la sostituzione tripsina in un volume adeguato che copre l&#39;intera superficie del recipiente di coltura tissutale. NOTA: In alternativa, prendere in considerazione altre opzioni digestione enzimatica Accutase o. Questo passaggio critico può influenzare negativamente l&#39;espressione epitopi di superficie (vedi 7). </li><li> Incubare il piatto / matraccio a 37 ° C per 2 - 5 minuti (a seconda del tipo di cellula) per permettere alle cellule di staccare. Battere delicatamente il recipiente di coltura tissutale o filo con una pipetta sierologica per rimuovere le cellule. Evitare di digestione (come questo può causare la perdita di cellule e coagulazione a passi successivi). </li><li> Quench la sostituzione tripsina aggiungendo due volte il volume di tampone di flusso (2% FBS in PBS) e raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 ml. </li><li> Triturare delicatamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta microlitro (100 - 1.000 ml) o una pipetta 5 ml sierologica per preparare una sospensione di cellule singole. </li><li> Centrifugare le cellule a 220 xg per 5 min a 25 ° C. Con attenzione aspirare il surnatante lasciando il pellet alle spalle. </li><li> Risospendere il pellet in un volume adeguato di tampone di flusso, a seconda delle dimensioni del pellet (ad esempio, per una beuta T75 confluenti di cellule SH-SY5Y la resa tipica è almeno 10 x 10 6 cellule, nel qual caso le cellule sono risospese in 5 ml di tampone di flusso). NOTA: Se si osservano pezzi più grandi o di coagulazione, filtrare attraverso un 30 - 100 micron di maglia. </li></ol></li><li> Conteggio delle cellule 52: <ol><li> Trasferire una piccola aliquota della sospensione di cellule in una provetta e diluire in un rapporto definito in un volume di trypan blu o una viabilità alternativa tintura prima del trasferimento ad un emocitometro o sistema di conteggio delle cellule automatizzato. </li><li> Diluire la sospensione cellulare ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule vitali / ml aggiungendo il volume adeguato di tampone di flusso o PBS con 0,1% BSA (se procedere con etichettatura CFSE). NOTA: propidio ioduro, 7-aminoactinomycin D, annessina V e disponibili in commercio kit di analisi fattibilità risolvibili rappresentano opzioni alternative al fine di valutare la vitalità delle cellule. Inoltre, utilizzando saggi apoptosi caspasi-3 fluorescenza come descritto in precedenza 53 possono essere utilizzati. Canali fluorescenti saranno &quot;occupate&quot; da questi reagenti che possono limitare le opzioni per passi successivi, se inclusi in tutti i campioni. </li></ol></li></ol> 2. intracellulare Dye Labeling Utilizzando CFSE (Figura 3) <ol><li> Diluire il CFSE ad una concentrazione archivio desiderato che può essere usato facilmente. NOTA: Per questi esperimenti una concentrazione di magazzino0.01 mM è stato utilizzato. Determinare la concentrazione ottimale di lavoro del CFSE empiricamente. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione 0,01 mM CFSE per ml di cellule (Sezione 1.3.2, concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml in PBS + 0,1% BSA) per una concentrazione finale di 0,1 mM. Brevemente vortex per miscelare bene. NOTA: concentrazioni CFSE usati qui sono circa dieci volte inferiore rispetto a quelli comunemente applicati in saggi di proliferazione, quindi cella tossicità del colorante è minima. Noi non osserviamo effetti negativi sulla vitalità cellulare. </li><li> Incubare per 5 minuti a RT, con agitazione costante (200 rpm). Proteggere dalla luce. </li><li> Quench il colorante aggiungendo 5 volumi di tampone di flusso per i tubi. Centrifugare a 94 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Eliminare il surnatante lasciando il pellet alle spalle. Risospendere le cellule con 5 volumi di tampone di flusso. </li><li> Centrifugare a 94 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in tampone di flusso ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule /<html> ml. </li><li> Aggiungere un numero uguale di cellule non marcate di interesse alla sospensione cellulare macchiato. Procedere alla superficie protocollo di colorazione antigene (sezione 3). </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Rilevamento di differenziale espressione dell&#39;antigene di superficie CD tra due linee di cellule tramite cellule SH-SY5Y neuroblastoma CFSE tintura etichettatura. Sono pre-etichettati con CFSE per la successiva identificazione rispetto a fibroblasti BJ senza etichetta. Co-colorazione del campione misto (pannelli di destra) con marcatori di superficie CD24 o CD54 (sia coniugato con APC) dimostra che le linee cellulari sono facilmente distinguibili grazie alla colorazione CFSE (frecce = SH-SY5Y, punte di freccia = BJ fibroblasti). La maggior parte delle cellule SH-SY5Y esprimono CD24, ma non CD54 (ICAM-1). Al contrario, i fibroblasti BJ (CFSE-negativo) sono positivi per CD54, ma in gran parte negative per CD24.Target &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg&quot; = &quot;_ blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 3. Cella Surface colorazione <ol><li> Etichettare le provette compresi i campioni ed i controlli critiche (vedi Tabella 1). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Tubo no. </td><td> Nome del campione </td><td> Antigen-fluoroforo </td><td> Diluizione </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Cellule senza macchia </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td> Macchiato singolo </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Macchiato singolo </td><td> TUJ1-Alexa 488 nm Fluor </td><td> 1: 2.000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Doppia macchiato </td><td> CD24-APC </td><td> 01:50 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> TUJ1-Alexa 488 nm Fluor </td><td> 1: 2.000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Macchiato singolo</td><td> Secondary solo: Alexa Fluor 488 nm </td><td> 1: 2.000 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. L ist di tubi da includere in un tipico flusso citometria esperimento. La tabella mostra un insieme minimo di provette per campioni necessari per un esperimento di co-colorazione descritto in questo articolo video. Un esperimento ideale deve includere tutti i controlli necessari (positivi, così come controlli negativi) per compensazione accurata interpretazione dei risultati ottenuti. <ol start="2"><li> Aggiungere 100 ml di sospensione cellulare (dalla Sezione 2.7 o 1.3.2) per ogni provetta da 1,5 ml microcentrifuga. NOTA: Assicurarsi che un minimo di 0,1 x 10 6 cellule sono presenti per 100 ml di sospensione cellulare. </li><li> Aggiungere fluoroforo anticorpo coniugato con il campione a una diluizione appropriata. NOTA: Determinare diluizione di lavoro per ogni anticorpo prima dell&#39;esperimento. Vedere la Tabella 2 per un elenco of antigeni di superficie neurali. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Antigene </td><td> Tipo di cella </td><td> Riferimento </td></tr><tr><td> CD15 </td><td> Le cellule staminali neurali </td><td> [28, 67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td> Cellule neuronali </td><td> [28, 68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td> Le cellule staminali neurali </td><td> [28, 69, 70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td> Le cellule gliali </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD49f </td><td> Le cellule staminali neurali </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56 (NCAM) </td><td> Cellule neuronali </td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td> Le cellule staminali neurali </td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td> Le cellule staminali neurali e cellule gliali </td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td> Cellule neuronali </td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td> Le cellule staminali della cresta neurale </td><td&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td> Le cellule gliali </td><td> [31] </td></tr><tr><td> CORIN </td><td> Precursori dopaminergici </td><td> [35, 36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td> Le cellule staminali neurali (NSC) </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td> Le cellule gliali </td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td> Le cellule gliali </td><td> [32] </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Selezione di antigeni di superficie neurali. Questa tabella fornisce un elenco di epitopi di superficie trovati ad essere espressa da vari tipi di cellule neurali per esemplificare la crescente gruppo di antigeni di superficie utilizzate per caratterizzare il lignaggio neurale. Si noti che questa selezione è lungi dall&#39;essere completo e che la maggior parte di questi marcatori sono espressi anche da una serie di altre cellule neuronali e non neuronali. Di conseguenza, le combinazioni di diversi marcatori saranno tenuti a definire meglio e isolare i sottoinsiemi neurali indicati. <ol starte = &quot;4&quot;&gt; <li> Incubare per 30 minuti su un agitatore orbitale (200 rpm) al buio. </li><li> Flusso tampone di lavaggio <ol><li> Aggiungere 1 ml di tampone di flusso per i tubi. Centrifugare a 380 xg per 4 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante lasciando il pellet alle spalle. </li></ol></li><li> Ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Dopo il secondo lavaggio, decantare il supernatante e risospendere le cellule in tampone portata ad un volume finale di 100 microlitri. </li><li> Utilizzare campione per l&#39;analisi di citometria di flusso. In alternativa, procedere alla sezione 4 e 5. NOTA: Se le cellule devono essere ordinati e rimesso in cultura post-FACS (ie, sospensione di cellule vitali senza fissazione o permeabilizzazione), applicare tecniche asettiche durante la vendemmia, colorazione e fasi analitiche. </li></ol> 4. Fissazione e permeabilizzazione 38 <ol><li> Fissazione con paraformaldeide (PFA): <ol><li> Preparare tampone di fissaggio contenente 2% PFA in PBS. <br/&gt; NOTA: PFA è nocivo per l&#39;uomo e per l&#39;ambiente. Utilizzare dispositivi di protezione adeguati e gettare rifiuti in conformità alla normativa vigente. </li><li> Aggiungere 500 pl di tampone di fissaggio a 100 ml di sospensione cellulare. </li><li> Incubare le provette a RT per 15 minuti su un agitatore orbitale (100 rpm) al buio. </li></ol></li><li> PBS lavaggio: <ol><li> Aggiungere 1 ml di PBS al tubo. Centrifugare a 380 xg per 3 min a 4 ° C. </li><li> Scartare / decantare il surnatante lasciando circa 100 microlitri nel tubo. </li></ol></li><li> Permeabilizzazione con Tween-20: <ol><li> Preparare tampone permeabilizzazione contenente 0,7% Tween-20 in PBS. </li><li> Aggiungere 500 pl di tampone di permeabilizzazione a 100 ml di sospensione cellulare. </li><li> Incubare le provette a RT per 15 minuti su un agitatore orbitale (100 rpm) al buio. </li></ol></li><li> Lavare le cellule una volta con PBS (come descritto nel paragrafo 4.2) e rimuovere il surnatante dal tubi completely, lasciando solo il pellet dietro. </li></ol> 5. intracellulare Antigen Staining 38 (Figura 4) <ol><li> Preparazione di soluzioni di anticorpi primari: <ol><li> Diluire gli anticorpi primari in tampone di diluizione contenente 1% di albumina di siero bovino, siero 10% (per esempio, o di capra normale asino siero) e 0,5% Tween-20 in PBS. NOTA: Scegliere il siero da utilizzare a seconda delle specie anticorpi secondari sono stati allevati in. </li><li> In alternativa, utilizzare Zenon etichettatura fluoresceina dell&#39;anticorpo primario secondo le istruzioni del produttore. <ol><li> Preparare 1 mg di anticorpo primario in PBS ad una diluizione adeguata (volume totale ≤ 20 ml). </li><li> Aggiungere 5 ml di Zenon fluoresceina IgG reagente etichettatura (Componente A) alla soluzione di anticorpi. </li><li> Incubare la miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 5 ml di Zenon reagente bloccante (Componente B) alla miscela di reazione. </li><li> Covarela miscela per 5 minuti a temperatura ambiente. Applicare l&#39;anticorpo per il campione in 30 min. </li></ol></li></ol></li><li> Primaria colorazione anticorpi: <ol><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di anticorpo primario per il pellet e triturare delicatamente per miscelare. </li><li> In alternativa, aggiungere Zenon fluoresceina anticorpo marcato per la sospensione cellulare alla diluizione appropriata. </li><li> Incubare le provette a RT per 30 minuti su un agitatore orbitale (200 rpm), al riparo dalla luce. Lavare le cellule una volta con PBS (come descrive nella sezione 4.2) e rimuovere il surnatante dai tubi completamente, lasciando solo il pellet dietro. </li></ol></li><li> Colorazione anticorpo secondario (non richiesto per gli anticorpi Zenon fluoresceina marcati): <ol><li> Diluire gli anticorpi secondari in PBS ad una concentrazione adeguata. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di anticorpo secondario al pellet e triturare delicatamente per miscelare. Incubare le provette a RT per 30 minuti su un agitatore (200 rpm) al buio. </li></ol></li><li> Lavare i campioni due volte con PBS (come descritto nella Sezione 4.2). </li><li> Lavare una volta con tampone di flusso (vedi Sezione 3.5). </li><li> Risospendere le cellule in circa 150 ml di tampone di flusso e analizzare il citometro a flusso. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4. Co-colorazione di superficie e di proteine ​​intracellulari. Citometria a flusso di dati esemplifica un confronto tra primaria + secondaria anticorpo-basata contro colorazione intracellulare a base di fluoresceina Zenon in combinazione con colorazione della superficie. Positività esclusiva on y (quadrante in alto a sinistra) e l&#39;asse x (quadrante inferiore destro) mostra cellule colorate per MAP2 e CD24, rispettivamente. Dopo co-colorazione, MAP2 condiviso e di espressione CD24 può essere visto nel quadrante in alto a destra (pannelli di destra). Confronto di utilizzoAlexa Fluor 488. (Top; AF488) rispetto Zenon fluoresceina (in basso) per i rendimenti MAP2-etichettatura risultati simili <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 6. analisi citofluorimetrica <ol><li> Condurre immediatamente mediante citometria a flusso, dopo il completamento del protocollo di colorazione utilizzando un citofluorimetro con filtri appropriati per il rilevamento del segnale. Utilizzare 488 nm laser rosso blu e 640 nm con FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), e filtri FL-4 (675/25) passa-banda. </li><li> Impostare porte principali sulla base del scatter in avanti e laterale esclusi detriti e cellule morte. </li><li> Impostare cancelli fluorescenza per superficie e l&#39;antigene intracellulare al ≤0.5% sulla base dei campioni senza macchia e la compensazione per sovrapposizione spettrale che utilizzano controlli colorati singoli. </li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere potenziali conflitti di interesse.

Il protocollo presentato qui è ben definito per colture cellulari neuronali derivate da cellule staminali umane, ma può essere ugualmente applicata ad altre fonti di cellule neurali compreso il tessuto primario o linee cellulari neurali. Oltre alle fonti embrionali, le cellule staminali o progenitrici neurali possono essere estratti dalle regioni neurogenici del cervello adulto 27. Inoltre, citometria a flusso e FACS possono essere sfruttati per quantificare, analizzare e isolare diverse popolazioni di cellul...

Citometria a flusso è stato ampiamente sfruttato in immunologia, ematologia e oncologia per definire popolazioni di cellule con proprietà intrinseche scatter, espressione dell&#39;antigene di superficie cellulare, e altri parametri di fluorescenza 1-3. Le nostre intuizioni sviluppo linea di sangue e malattie sono il risultato di un notevole grado di raffinatezza continua di questa metodologia, dopo la sua iniziale 4,5 attuazione. Una maggiore consapevolezza delle potenzialità analitica quantitativa e globale della citometria a flusso ha recentemente incoraggiato il suo uso più diffuso nel campo della ricerca sulle cellule staminali e può consentire allo stesso modo profondo il progresso in un arco di tempo più breve 6. Tuttavia, l&#39;applicazione di citometria a flusso per analizzare specificamente e isolare popolazioni neuronali è stata a lungo percepita come stimolante. Contrariamente alle cellule ematopoietiche che esistono naturalmente in sospensione, tipi di cellule neurali sono tipicamente raccolte da fonti eccessivamente complesse che possono includere glia e vari other cellule circostanti, nonché una intricata rete di neuroni processo fruttiferi. Di conseguenza, neurobiologia ha ancora attuare la versatilità di citometria a flusso per il suo potenziale completo in routine di ricerca quotidiana. Tuttavia, fintanto che una sospensione valida singola cellula può essere generato (e protocolli è stato ideato e ottimizzata a tale scopo 7), citofluorimetria e classificare fluorescenza delle cellule attivate (FACS) può essere considerato un prezioso elemento del repertorio analitico neurobiologia 8-11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> . Figura 1. Principio di citometria di flusso e componenti di un citofluorimetro a flusso citometri comprendono tre sistemi principali: fluidici, ottica ed elettronica. Un flusso semplificato di cellule in sospensione (preparata da tessuto primario o coltura in vitro) è compiuta dal flui guainad via focalizzazione idrodinamica, limitando il campione al suo nucleo centrale. Le parti ottiche sono composti di laser che illuminano il flusso di celle e filtri ottici che indirizzano il segnale ai rivelatori appropriati. I segnali luminosi rilevati sono convertiti in segnali elettronici, successivamente elaborati da un computer e visualizzati su un monitor per l&#39;analisi dei dati e di gating. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Gli utenti di flusso di metodi di citometria a profitto di almeno una conoscenza di base dei fondamenti di base, tra cui blocchi di costruzione di un citometro (per la revisione cfr 12,13; vedi anche figura 1). Un fascio laser interseca con un flusso fluidico idrodinamico concentrato che contiene le cellule in sospensione, che a loro volta passano attraverso il fascio laser in &#39;singolo file&#39; uno dopo l&#39;altro. Il interceptisu di una cella (o qualsiasi altra particella, per questo) con i risultati laser nella diffusione della luce da questo punto di interrogazione. Luce diffusa può essere rilevato in continuazione della direzione laser (forward scatter, associato con la dimensione della particella), nonché perpendicolare alla sua direzione (lato scatter, riflettendo la granulosità della particella / cella). Queste proprietà scatter cui sopra non richiedono etichettatura specifica, che è il motivo per cui un campione senza etichetta (o anche detriti cellulari, bolle d&#39;aria, ecc) genera un segnale (evento) sul forward scatter bivariato contro lato scatter plot comunemente usato per gating iniziale. Utilizzando i laser e filtri specifici per il corrispondente spettri di eccitazione ed emissione appropriati, una cella può essere analizzata per la sua positività, livello di intensità, o assenza di marcatori fluorescenti. La maggior parte delle applicazioni citometria di flusso sono concentrati sulla caratterizzazione via antigeni di superficie cellulare. A differenza del lineag ematopoietichee, il lignaggio neurale è rimasta meno ampiamente definita in base alle superfici modelli di espressione epitopi 5. Un vantaggio di sfruttare antigeni di superficie è che le cellule vive possono essere sottoposti a separazione delle cellule paradigmi come il FACS. Al contrario, l&#39;antigene intracellulare colorazione richiede fissazione e permeabilizzazione passi per mediare l&#39;interazione epitopo-anticorpo, precludendo applicazioni a valle che richiedono cellule vitali. Da segnalare, questi approcci permettono ancora di numerose analisi quantitative 14 nonché analisi a valle per RNA e proteine ​​espressione 15. Ematologia, immunologia e oncologia hanno spesso usato più di una dozzina di marcatori in collaborazione per definire particolari sottopopolazioni 16. Inoltre, citometria di massa o CyTOF possono ora essere utilizzati per analizzare fino a 30 parametri simultaneamente 17,18. Per le applicazioni di cellule staminali neurali e colture primarie 14,19,20 l&#39;eterogeneità delle cellulevitro è un fenomeno comune 21-23. Le cellule non rappresentano la popolazione bersaglio di interesse incarnano un potenziale fattore confondente per la lettura sperimentale 24,25. Convenientemente, i differenti sottoinsiemi cellulari presenti all&#39;interno di una sospensione cellulare eterogenea recano profili di espressione dell&#39;antigene distinte (noti o ancora da decifrare), che possono essere utilizzati per definire queste diverse popolazioni. Citometria a flusso può quindi svolgere un ruolo cruciale nel risolvere eterogeneità cellulare e, di conseguenza, facilitare applicazioni biomediche (test in vitro, terapia cellulare) e ottimizzare la lettura quantitativa concentrandosi sul sottoinsieme più rilevante 24,26. Varie combinazioni di antigene di superficie sono stati identificati negli ultimi anni per consentire la quantificazione e l&#39;isolamento di particolari tipi di cellule neuronali. Questo include CD133 per l&#39;arricchimento delle cellule staminali neurali 27, una combinazione delle CD15 / CD24 / antigeni di superficie CD29 per l&#39;isolamento delle NSC, differentiated neurone e cellule della cresta neurale 28 o CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 di isolare neurali e gliali sottoinsiemi 25, tra le altre firme 29,30. Al di là di neuroni, marcatori gliali includono A2B5 31, CD44 25, NG2 32 e GLAST 33. Una recente pubblicazione ha sfruttato il mesencefalo marcatore precursore fondello CORIN 34,35 per arricchire di precursori dopaminergici nel trapianto di cellule Parkinson paradigmi 36. Molecole di CD non sono solo i marcatori, ma funzionalmente rilevanti mediatori delle interazioni cellula-cellula e di capacità delle cellule di rispondere ai segnali di molecole della matrice extracellulare e fattori di crescita 37. Una strategia di potenziare ulteriormente l&#39;arsenale di antigeni CD combinatorie a caratterizzare lo sviluppo lignaggio neurale è quella di utilizzare noti markers intracellulari per lo screening e definire combinazioni di antigene CD per un particolare tipo di cellule di interesse. Abbiamo recentemente sfruttato tale approccio e identificato CD49F - / CD200 alti modelli di espressione combinatorie come un nuovo approccio per arricchire sottoinsiemi neuronali da neurally differenziati pluripotenti indotte sistemi di coltura delle cellule staminali 38. Qui, includiamo e discutere il secondo protocollo (e varianti opzionali loro), in cui la colorazione superficiale e la colorazione intracellulare possono essere utilizzati contemporaneamente per definire sottopopolazioni di cellule neurali in citometria a flusso. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> Figura 2. Schema di flusso di opzioni protocollo sperimentale. La figura illustra una rappresentazione schematica dei principali fasi del protocollo. Passaggi facoltativi (CFSE dye o etichettatura antigene intracellulare) sono indicati da caselle di colore grigio chiaro. Dopo la raccolta, è fondamentale per valutare il numero di vitalità e di cellule di sospensioni cellulari neuronali prima della colorazione della superficie cellulare. Positivo comecosì come controlli negativi devono essere inclusi in aggiunta ai campioni di interesse. I campioni possono essere analizzati mediante citometria a flusso e / o utilizzati in separazione delle cellule paradigmi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Mentre abbiamo precedentemente utilizzato anticorpo primario in combinazione con l&#39;anticorpo secondario per la colorazione intracellulare 38, introduciamo ora etichettatura non covalente dell&#39;anticorpo primario mediante frammenti Fab fluorescenti (etichettatura Zenon) come una lieve variazione, riducendo così le fasi di manipolazione cellulare 39. Inoltre, come ulteriore esempio della versatilità del protocollo, ci avvaliamo di una etichettatura facoltativa di un sottoinsieme sperimentale carbossifluoresceina estere succinimidyl (CFSE) prima superficie antigene colorazione. Tale CFSE pre-etichettatura consente confronto diretto immediato delle due linee cellulari o condizioni sperimentali (CFSE marcato vs. senza etichetta) all&#39;interno di un unico tubo di esempio, la riduzione della varianza o sottili differenze di tempo di incubazione e di risparmio di anticorpi. CFSE è un colorante fluorescente stabilito che viene comunemente utilizzato per il monitoraggio delle cellule 40, in proliferazione 41,42 e codici a barre esperimenti 43,44. Infine, mentre passaggi effettivi (FACS, separazione immunomagnetica o immunopanning) non fanno parte di questo protocollo, in linea di principio, le modalità di raccolta e di etichettatura qui descritte fanno i campioni di rendimento che possono essere sottoposti a superficie antigene o intracellulari applicazioni di smistamento basate etichettatura- 15 25,28. Con questo articolo, ci proponiamo di: sintesi di una superficie valida protocollo antigene colorazione 25,28, sintesi di un protocollo per la rivelazione di bersagli intracellulari e superficie combinata e intracellulare analisi dell&#39;antigene 38, presenterà un intracellulare CFSE etichettatura tintura passo 41,45 come opzione sperimentale per comcomparata analisi di popolazioni di cellule neuronali, e riassumere approcci per l&#39;analisi di citometria di flusso (controlli appropriati 13,46, gating strategia e dati presentazione 47).

<table><tbody><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (Mezzo di coltura di Dulbecco modificato/Nutrient Mixture F-12)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS senza Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, approvato UE, origine Sud America (FBS)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali MEM (100x)</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di blu di tripano, 0,4%</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td><a href="http://www.carlroth.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Carl Roth</a></td><td>335.3</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA) Fraczione V</td><td><a href="http://www.gelifesciences.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> PAA Laboratories, Coelbe</a></td><td>K41-001</td><td></td></tr><tr><td>Detergente Tween-20</td><td><a href="http://www.merckmillipore.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Calbiochem</a></td><td>655205</td><td></td></tr><tr><td>Carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE)</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>65-0850-84</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td><a href="http://www.applichem.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AppliChem</a></td><td>A1584</td><td></td></tr><tr><td>Filtri a bottiglia con membrana da 0,22 &amp;micro;m, 250 ml</td><td><a href="http://www.millipore.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Millipore</a></td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per colture cellulari (T 25)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>Flaconi per colture cellulari (T 75)</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> NUNC</a></td><td>156499</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici (15 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Tubi conici (50 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di Pasteur, in vetro (150 mm)</td><td><a href="http://www.stein-labortechnik.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> STEIN Labortechnik, Remchingen</a></td><td>S03710150</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta (0,1-10 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4125</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta (1-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4126</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipetta (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4129</td><td></td></tr><tr><td>Pipette serologiche, 5 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4051</td><td></td></tr><tr><td>Pipette serologiche, 10 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4101</td><td></td></tr><tr><td>Pipette serologiche, 25 ml</td><td><a href="http://www.corning.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Corning</a></td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per microcentrifuga (0,5 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,699</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per microcentrifuga (1,5 ml)</td><td><a href="http://www.greinerbioone.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Greiner Bio-One</a></td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>Tubi per microcentrifuga (2,0 ml)</td><td><a href="http://www.sarstedt.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Sarstedt</a></td><td>72,695,500</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Anti-CD24 umano APC</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>17-0247-42</td><td>Diluizione di lavoro 1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Anti-CD54 umano PE</td><td><a href="http://www.ebioscience.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> eBioscience</a></td><td>12-0549-42</td><td>Diluizione di lavoro 1:50</td></tr><tr><td>Anticorpo policlonale Neuronal Class III &amp;beta;-Tubulin (Tuj1)</td><td><a href="http://www.covance.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Covance</a></td><td>PRB-435P</td><td>Diluizione di lavoro 1:2.000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>A21206</td><td>Diluizione di lavoro 1:2.000</td></tr><tr><td>Kit di etichettatura Zenon&amp;reg; Fluorescein Rabbit IgG</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Life Technologies</a></td><td>Z-25342</td><td></td></tr><tr><td>Camera di conta Neubauer-Improved</td><td><a href="http://www.marienfeld-superior.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Marienfeld</a></td><td>0640010</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td><a href="http://www.scientificindustries.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Scientific Industries</a></td><td>G560E</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td><a href="http://www.eppendorf.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Eppendorf</a></td><td>5355 000.001</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso Accuri C6</td><td><a href="http://www.bdbiosciences.com/instruments/accuri" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Becton Dickinson (BD)</a></td><td>653118</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga refrigerata, PerfectSpin 24 R</td><td><a href="http://www.peqlab.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Peqlab</a></td><td>91-PSPIN-24R</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore orbitale, Unimax 1010</td><td><a href="http://www.heidolph-instruments.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Heidolph</a></td><td>543-12310-00</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata, Rotanta 96 RC</td><td><a href="http://www.hettichlab.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Hettich</a></td><td>4480-50</td><td></td></tr><tr><td>Cappa di sicurezza biologica di Classe II Safe 2020</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026640</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, Heracell 240i</td><td><a href="http://www.thermoscientific.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Thermo Scientific</a></td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Sistema a vuoto, Vacusafe comfort</td><td><a href="http://www.integra-biosciences.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Integra Biosciences</a></td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio, Axiovert 40 CFL</td><td><a href="http://www.zeiss.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Zeiss</a></td><td>451212</td><td></td></tr><tr><td>Controllore per pipetta, accu-jet pro</td><td><a href="http://www.brand.de" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Brand</a></td><td>26303</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta, Pipetman neo P20N (2-20 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144563</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta, Pipetman neo P200N (20-200 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta, Pipetman neo P1000N (100-1000 &amp;micro;l)</td><td><a href="http://www.gilson.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Gilson</a></td><td>F144566</td><td></td></tr></tbody></table>

citometria a flusso protocolli per superficie e intracellulare antigen analisi di tipi di cellule neurali

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

La citometria a flusso è stata ampiamente utilizzata per definire le popolazioni cellulari in immunologia, ematologia e oncologia. Qui, forniamo una descrizione dettagliata dei protocolli per l'analisi citofluorimetrica degli antigeni di superficie del cluster di differenziazione (CD) e degli antigeni intracellulari nei tipi di cellule neurali. La nostra descrizione dettagliata delle procedure metodologiche include: la raccolta di colture neurali in vitro, una fase opzionale di marcatura dell'estere carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE), seguita dalla colorazione dell'antigene di superficie con anticorpi CD coniugati (ad esempio, CD24, CD54) e la successiva rilevazione intracellare dell'antigene tramite anticorpi primari/secondari o frammenti di Fab marcati in fluorescenza (marcatura Zenon). Il video mostra i passaggi più critici. Inoltre, vengono brevemente spiegati i principi della pianificazione sperimentale, l'inclusione dei controlli critici e i fondamenti dell'analisi citofluorimetrica (identificazione della popolazione bersaglio ed esclusione dei detriti; strategia di gating; compensazione per sovrapposizione spettrale) al fine di consentire ai neurobiologi con conoscenze pregresse limitate o formazione specifica in citometria a flusso di valutarne l'utilità e di sfruttare meglio questa potente metodologia.

Il protocollo presentato qui permette approcci versatile sperimentali (Figura 2). Nella sua versione più breve (passi 1, 3 e 6), può essere considerato una guida per la semplice colorazione di antigeni di superficie. Nella sua forma più complessa, una serie di paradigmi co-etichettatura con una gamma di antigeni intracellulari può essere perseguito (fasi opzionali 2 e / o 4 a 5). Inoltre, la fase di eti...

Forniamo una descrizione dettagliata di un protocollo per l'analisi citofluorimetrica di antigeni di superficie e/o antigeni intracellulari in tipi di cellule neurali. Vengono spiegati gli aspetti critici della pianificazione sperimentale, le procedure metodologiche passo-passo e i principi fondamentali della citometria a flusso al fine di consentire ai neurobiologi di sfruttare questa potente tecnologia.

Citometria a flusso Protocolli per superficie e intracellulare Antigen analisi di tipi di cellule neurali

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare l'espressione di antigeni di superficie e intracellulari su cellule neurali utilizzando la citometria a flusso. Ciò si ottiene raccogliendo prima le cellule neurali da colture in vitro o da tessuto neurale primario. Successivamente, alle cellule viene applicata una colorazione intracellulare non specifica opzionale.Quindi gli antigeni di superficie desiderati vengono immediatamente marcati con un anticorpo primario, mentre gli antigeni intracellulari desiderati vengono marcati dopo la fissazione e la permeazione cellulare. In definitiva, i risultati possono essere ottenuti utilizzando l'analisi citofluorimetrica per la co-espressione degli antigeni di superficie su specifiche sottopopolazioni neurali di interesse come definito dall'etichetta intracellulare. Questo protocollo dimostrerà come preparare cellule neurali derivate da colture tissutali per l'interrogazione di antigeni di superficie e intracellulari con citometria a flusso multicolore.Per iniziare, raccogliere le cellule neurali aderenti coltivate in fiasche T 75 lavando delicatamente le cellule una volta con cinque millilitri di magnesio e PBS privo di calcio a temperatura ambiente. Quindi staccare le cellule dal pallone aggiungendo tre millilitri di sostituto della tripsina e incubare a 37 gradi Celsius per due-cinque minuti. Estinguere la digestione enzimatica aggiungendo sei millilitri di tampone di flusso Dopo aver allentato i grumi cellulari pipettando la sospensione cellulare su e giù alcune volte, trasferire l'intera sospensione cellulare in una provetta fresca da 15 millilitri per isolare le cellule.Mettere la provetta in una centrifuga, far girare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente e aspirare la snat in preparazione per la marcatura intracellulare del colorante. Risospendere il pellet della cella con cinque millilitri di PBS più lo 0,1% di BSA. In caso contrario, aggiungere cinque millilitri di tampone di flusso in combinazione con il protocollo di colorazione standard trian blue.Utilizzare un emocitometro per stimare l'effettiva conta delle cellule vitali. Riaggiustare la concentrazione cellulare della sospensione esistente a 1 milione di cellule vitali per millilitro con lo stesso tampone utilizzato nella fase precedente. Queste cellule sono ora pronte per due opzioni di colorazione, una colorazione con anticorpi antigenici di superficie o una colorazione intracellulare fluorescente opzionale con fluoresceina carbossi seguita dalla suddetta colorazione con antigene di superficie.Per eseguire una fase di marcatura intracellulare con il colorante estere CIN carbossi-fluoresceina, aggiungere prima 10 microlitri di soluzione madre CFSE. Per ogni millilitro di sospensione cellulare, posizionare la provetta su uno shaker a 200 giri/min e incubare la miscela per cinque minuti. A temperatura ambiente, prevenire il fotosbiancamento proteggendo il tubo dall'esposizione diretta alla luce.Estinguere tutti i coloranti non reattivi aggiungendo cinque volumi di siero contenente il tampone di flusso e pipettare delicatamente su e giù alcune volte per mescolare. Quindi centrifugare le cellule per cinque minuti in una centrifuga a temperatura ambiente e aspirare il surnatante per rimuovere le tracce residue di coloranti non reattivi. Lavare il pellet della cella sospendendolo con cinque volumi di tampone di flusso.Le cellule vengono quindi fatte girare ancora una volta in una centrifuga a temperatura ambiente per cinque minuti prima di scartare il natante di SUP. Infine, risospendere il pellet di cella con il tampone di flusso in modo tale che la concentrazione finale della cella sia di 1 milione di cellule vitali per millilitro. Per un esperimento multiplexato, aggiungere un numero uguale di cellule non colorate di interesse da una diversa condizione sperimentale alla sospensione di cellule colorate con CFSC.Le cellule sono ora pronte per la marcatura dell'antigene di superficie con gli anticorpi per iniziare la colorazione della superficie cellulare. Trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare con o senza etichette CFSC in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Aggiungere quattro anticorpi coniugati fluorescenti alla sospensione cellulare a una quantità precedentemente determinata mediante test di titolazione anticorpale.Posizionare la provetta su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 100 RPM e incubare la miscela per 30 minuti. In assenza di luce, diluire la miscela di anticorpi aggiungendo un millilitro di tampone di flusso. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare e centrifugare le cellule in una microcentrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per quattro minuti.Aspirare il supinato per rimuovere gli anticorpi non legati e ripetere la centrifuga di lavaggio e l'aspirazione. Fai un passo ancora una volta. Reus sospende il pellet cellulare in 100 microlitri un tampone di flusso alle cellule precedentemente colorate.Aggiungere 500 microlitri di tampone di fissazione a 100 microlitri di sospensione cellulare. Posizionare la provetta su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 100 giri/min e incubare per 15 minuti al buio. La formaldeide reticolerà tutte le specie proteiche e di DNA che si trovano in stretta vicinanza l'una con l'altra e produrrà sospensioni cellulari non vitali.Diluire la miscela di fissaggio aggiungendo un millilitro di PBS e pipettare delicatamente su e giù alcune volte per mescolare. Quindi centrifugare le celle fisse in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per tre minuti. Aspirare il supinato in modo tale che rimangano 100 microlitri di liquido sopra il pellet cellulare per permeare la membrana cellulare per la successiva marcatura intracellulare dell'antigene.Aggiungere 500 microlitri di tampone di permeazione a 100 microlitri di sospensione cellulare. Posizionare la provetta su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 100 giri/min e incubare per 15 minuti al buio. Diluire la miscela di permeazione aggiungendo un millilitro di PBS, pipettare delicatamente su e giù alcune volte per mescolare e centrifugare le cellule fissate in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per tre minuti.Aspirare completamente il natante SUP prima dell'incubazione. Preparare un stock di lavoro per anticorpi primari diluendo l'anticorpo in un tampone PBS più 0,5% tween 20. Questo è ulteriormente arricchito con l'1% di BSA, il 10% di siero d'asino o il 10% di siero di capra.Quindi risospendere il pellet di cellule permeabili alla membrana con 100 microlitri della massa lavorante dell'anticorpo primario. Posizionare la provetta su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 200 giri/min e incubare per 30 minuti al buio. Diluire la miscela di anticorpi primari aggiungendo un millilitro di tampone di flusso.Pipettare delicatamente su e giù un paio di volte per mescolare e centrifugare le cellule in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per quattro minuti. Aspirare completamente il supinato per rimuovere gli anticorpi non legati. Quindi, risospendere il pellet con 100 microlitri della scorta di lavoro dell'anticorpo secondario.Ripetere l'incubazione a temperatura ambiente protetta dalla luce per 30 minuti. Nello stesso agitatore, diluire la miscela di anticorpi secondari aggiungendo un millilitro di tampone di flusso. Ripetere la stessa miscelazione dell'inversione del tubo, lo spin down e la rimozione del surnatante per eliminare tutti gli anticorpi non legati.Ripetere gli stessi passaggi di centrifugazione di lavaggio da un millilitro e di rimozione del surnatante per altre due volte, ma con PBS fresco come tampone di lavaggio. Invece, il risultato finale sarà un pellet di cellule pulite marcato con anticorpi fluorescenti CFSC extracellulari o intracellulari mirati o qualsiasi combinazione dei tre resuspend, il pellet cellulare marcato in 150 microlitri di tampone di flusso. Trasferire la sospensione cellulare al citometro a flusso e iniziare l'analisi con le impostazioni appropriate del filtro di eccitazione ed emissione laser per ogni piano di quattro.Utilizzando i dati di dispersione diretta e laterale come guida, è possibile impostare la dispersione iniziale in avanti rispetto a quella laterale all'interno del software di analisi della citometria a flusso per escludere punti dati non specifici come detriti cellulari e cellule morte. Successivamente, utilizzando i dati grezzi di una sospensione cellulare non colorata come controllo negativo, è possibile impostare più porte di integrazione fluorescente che selezionano i segnali di emissione positivi dalle etichette degli antigeni extracellulari e intracellulari per tenere conto della fluorescenza di fondo da multicolore. Gli effetti di sovrapposizione spettrale riregolano i cancelli fluorescenti utilizzando i dati grezzi dei controlli colorati con un singolo anticorpo.In un esperimento fax multiplexato, i tag carbossi-fluoresceina possono essere utilizzati come segnale di base in grado di discriminare tra cellule di due diversi lignaggi o condizioni sperimentali senza l'uso di un anticorpo. Ad esempio, in una sospensione cellulare eterogenea, si può immediatamente distinguere tra cellule neurali marcate con CFSC e fibroblasti non marcati semplicemente osservando la presenza o l'assenza di fluorescenza nel canale verde. Inoltre, in combinazione con la marcatura CFSE Esther, è possibile utilizzare anticorpi fluorescenti di diversi colori per determinare l'espressione differenziale degli antigeni di superficie tra i sottogruppi marcati con CFSE e quelli non marcati all'interno di un campione misto.Ad esempio, le cinque cellule di neuroblastoma Y SHSY marcate con CFSE nel canale di fluorescenza verde, co-esprimevano alti livelli di antigene di superficie CD 24, ma non del marcatore di fibroblasti CD 54. Al contrario, i fibroblasti CFSC negativi di BJ sono positivi per la CD 54 con livelli più bassi di CD 24. L'analisi degli antigeni della superficie neurale può essere eseguita anche in combinazione con il rilevamento degli antigeni intracellulari basato su anticorpi.L'inclusione di campioni non colorati e di controlli con colorazione singola per antigeni di superficie e antigeni intracellulari è fondamentale come alternativa alla marcatura primaria e secondaria basata su anticorpi degli antigeni intracellulari, come la mappa dei marcatori neurali due mostrata qui. La marcatura fluorescente non covalente dell'anticorpo primario può produrre risultati comparabili nell'analisi di co-espressione e abbreviare il protocollo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le cellule neurali per l'analisi citofluorimetrica di base utilizzando vari approcci di etichettatura alternativi e loro combinazioni.

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Neuroscienze

Questo protocollo video viene illustrato un nuovo metodo per la generazione e la successiva purificazione delle cellule progenitrici neuronali da una fonte rinnovabile di cellule staminali neuronali (NSC) sulla base della loro fisico (granularità e dimensione interna) e proprietà di fluorescenza usando citometria di flusso tecnologia.

Il saggio neuroblasti: un test per la generazione e arricchimento delle cellule progenitrici neuronali di differenziare i Progeny cellule staminali neurali in citometria a flusso

Fonte: Becker-Kojić, Z. A., et. al., Generazione libera da OGM di cellule neuronali derivate dal sangue. J. Vis. Exp. (2021)Il video mostra un protocollo per la preparazione di cellule neurali derivate da cellule del sangue periferico riprogrammate per la microscopia a fluorescenza, mostrando tipi cellulari distinti e fasi di sviluppo attraverso l'imaging a immunofluorescenza.

Microscopia a immunofluorescenza di cellule neurali differenziate da cellule derivate dal sangue periferico 

Fonte: Hidmark, A. S., et al. Analisi delle cellule immunitarie in singoli nervi sciatici e ganglio della radice dorsale da un singolo topo utilizzando la citometria a flusso. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Questo video dimostra l'uso della citometria a flusso per analizzare le cellule immunitarie nei nervi sciatici di topo e nei gangli delle radici dorsali (DRG). Il processo prevede la marcatura delle cellule immunitarie con anticorpi marcati con fluorofori e biotina, la stabilizzazione e la...

Analisi delle cellule immunitarie nei tessuti nervosi di topo mediante citometria a flusso

Nel corso degli ultimi anni, saggi cellulari vivi sono stati utilizzati con successo per rilevare gli anticorpi contro gli antigeni di superficie e conformazionale. Qui, descriviamo un metodo con elevate throughput citometria consentire l'analisi di grandi coorti di pazienti. Individuazione di anticorpi romanzo migliorare la diagnosi e il trattamento di disturbi immuno-mediata.

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L'obiettivo di questo protocollo è utilizzare la tecnica di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per ordinare tipi specifici di cellule neurali per la successiva analisi dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, dei marcatori epigenetici e/o dell'espressione proteica.

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Vi presentiamo un metodo di citometria di flusso per identificare contemporaneamente diversi tipi di cellule recuperate dal cervello del topo o dal midollo spinale. Questo metodo potrebbe essere sfruttato per isolare o caratterizzare le popolazioni di cellule pure nelle malattie neurodegenerative o per quantificare l'estensione del targeting cellulare sulla somministrazione in vivo di vettori virali o nanoparticelle.

Caratterizzazione citometrica a flusso simultaneo di più tipi di cellule recuperate dal cervello del mouse/cavo spinale attraverso diversi metodi di omogeneizzazione

Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

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Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza

Questo protocollo descrive le strategie per identificare e arricchire lo stato cellulare in colture primarie di cellule staminali neurali di topo adulto mediante imaging in autofluorescenza utilizzando i) un microscopio confocale, ii) un selezionatore cellulare attivato a fluorescenza per eseguire l'imaging dell'intensità o iii) un microscopio multifotone per eseguire l'imaging del tempo di vita in fluorescenza.

Classificazione dello stato di attivazione delle cellule staminali neurali in vitro mediante autofluorescenza

Ad oggi, i protocolli per l'isolamento simultaneo di tutti i principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale dallo stesso topo sono una richiesta insoddisfatta. Il protocollo mostra una procedura applicabile nei topi con encefalomielite autoimmune naïve e sperimentale per studiare reti cellulari complesse durante la neuroinfiammazione e contemporaneamente ridurre il numero di topi richiesti.

Isolamento simultaneo dei principali tipi di cellule residenti nel sistema nervoso centrale da topi adulti con encefalomielite autoimmune

Qui presentiamo due protocolli per quantificare l'inghiottimento microgliale delle sinapsi vGLUT1-positive e dei sinaptosomi grezzi marcati con pHRodo Red utilizzando la citometria a flusso.

Quantificazione dell'inghiottimento microgliale di materiale sinaptico mediante citometria a flusso

Impara la citometria a flusso per analizzare antigeni di superficie e intracellulari nelle cellule neurali. Questo protocollo dettagliato guida i neurobiologi nell'identificazione di sottopopolazioni specifiche.

Citometria a flusso Protocolli per superficie e intracellulare Antigen analisi di tipi di cellule neurali

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