Citometria a flusso Protocolli per superficie e intracellulare Antigen analisi di tipi di cellule neurali

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare l'espressione di antigeni di superficie e intracellulari su cellule neurali utilizzando la citometria a flusso. Ciò si ottiene raccogliendo prima le cellule neurali da colture in vitro o da tessuto neurale primario. Successivamente, alle cellule viene applicata una colorazione intracellulare non specifica opzionale.

Quindi gli antigeni di superficie desiderati vengono immediatamente marcati con un anticorpo primario, mentre gli antigeni intracellulari desiderati vengono marcati dopo la fissazione e la permeazione cellulare. In definitiva, i risultati possono essere ottenuti utilizzando l'analisi citofluorimetrica per la co-espressione degli antigeni di superficie su specifiche sottopopolazioni neurali di interesse come definito dall'etichetta intracellulare. Questo protocollo dimostrerà come preparare cellule neurali derivate da colture tissutali per l'interrogazione di antigeni di superficie e intracellulari con citometria a flusso multicolore.

Per iniziare, raccogliere le cellule neurali aderenti coltivate in fiasche T 75 lavando delicatamente le cellule una volta con cinque millilitri di magnesio e PBS privo di calcio a temperatura ambiente. Quindi staccare le cellule dal pallone aggiungendo tre millilitri di sostituto della tripsina e incubare a 37 gradi Celsius per due-cinque minuti. Estinguere la digestione enzimatica aggiungendo sei millilitri di tampone di flusso Dopo aver allentato i grumi cellulari pipettando la sospensione cellulare su e giù alcune volte, trasferire l'intera sospensione cellulare in una provetta fresca da 15 millilitri per isolare le cellule.

Mettere la provetta in una centrifuga, far girare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente e aspirare la snat in preparazione per la marcatura intracellulare del colorante. Risospendere il pellet della cella con cinque millilitri di PBS più lo 0,1% di BSA. In caso contrario, aggiungere cinque millilitri di tampone di flusso in combinazione con il protocollo di colorazione standard trian blue.

Utilizzare un emocitometro per stimare l'effettiva conta delle cellule vitali. Riaggiustare la concentrazione cellulare della sospensione esistente a 1 milione di cellule vitali per millilitro con lo stesso tampone utilizzato nella fase precedente. Queste cellule sono ora pronte per due opzioni di colorazione, una colorazione con anticorpi antigenici di superficie o una colorazione intracellulare fluorescente opzionale con fluoresceina carbossi seguita dalla suddetta colorazione con antigene di superficie.

Per eseguire una fase di marcatura intracellulare con il colorante estere CIN carbossi-fluoresceina, aggiungere prima 10 microlitri di soluzione madre CFSE. Per ogni millilitro di sospensione cellulare, posizionare la provetta su uno shaker a 200 giri/min e incubare la miscela per cinque minuti. A temperatura ambiente, prevenire il fotosbiancamento proteggendo il tubo dall'esposizione diretta alla luce.

Estinguere tutti i coloranti non reattivi aggiungendo cinque volumi di siero contenente il tampone di flusso e pipettare delicatamente su e giù alcune volte per mescolare. Quindi centrifugare le cellule per cinque minuti in una centrifuga a temperatura ambiente e aspirare il surnatante per rimuovere le tracce residue di coloranti non reattivi. Lavare il pellet della cella sospendendolo con cinque volumi di tampone di flusso.

Le cellule vengono quindi fatte girare ancora una volta in una centrifuga a temperatura ambiente per cinque minuti prima di scartare il natante di SUP. Infine, risospendere il pellet di cella con il tampone di flusso in modo tale che la concentrazione finale della cella sia di 1 milione di cellule vitali per millilitro. Per un esperimento multiplexato, aggiungere un numero uguale di cellule non colorate di interesse da una diversa condizione sperimentale alla sospensione di cellule colorate con CFSC.

Le cellule sono ora pronte per la marcatura dell'antigene di superficie con gli anticorpi per iniziare la colorazione della superficie cellulare. Trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare con o senza etichette CFSC in una provetta fresca da 1,5 millilitri. Aggiungere quattro anticorpi coniugati fluorescenti alla sospensione cellulare a una quantità precedentemente determinata mediante test di titolazione anticorpale.

Posizionare la provetta su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 100 RPM e incubare la miscela per 30 minuti. In assenza di luce, diluire la miscela di anticorpi aggiungendo un millilitro di tampone di flusso. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare e centrifugare le cellule in una microcentrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per quattro minuti.

Aspirare il supinato per rimuovere gli anticorpi non legati e ripetere la centrifuga di lavaggio e l'aspirazione. Fai un passo ancora una volta. Reus sospende il pellet cellulare in 100 microlitri un tampone di flusso alle cellule precedentemente colorate.

Aggiungere 500 microlitri di tampone di fissazione a 100 microlitri di sospensione cellulare. Posizionare la provetta su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 100 giri/min e incubare per 15 minuti al buio. La formaldeide reticolerà tutte le specie proteiche e di DNA che si trovano in stretta vicinanza l'una con l'altra e produrrà sospensioni cellulari non vitali.

Diluire la miscela di fissaggio aggiungendo un millilitro di PBS e pipettare delicatamente su e giù alcune volte per mescolare. Quindi centrifugare le celle fisse in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per tre minuti. Aspirare il supinato in modo tale che rimangano 100 microlitri di liquido sopra il pellet cellulare per permeare la membrana cellulare per la successiva marcatura intracellulare dell'antigene.

Aggiungere 500 microlitri di tampone di permeazione a 100 microlitri di sospensione cellulare. Posizionare la provetta su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 100 giri/min e incubare per 15 minuti al buio. Diluire la miscela di permeazione aggiungendo un millilitro di PBS, pipettare delicatamente su e giù alcune volte per mescolare e centrifugare le cellule fissate in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per tre minuti.

Aspirare completamente il natante SUP prima dell'incubazione. Preparare un stock di lavoro per anticorpi primari diluendo l'anticorpo in un tampone PBS più 0,5% tween 20. Questo è ulteriormente arricchito con l'1% di BSA, il 10% di siero d'asino o il 10% di siero di capra.

Quindi risospendere il pellet di cellule permeabili alla membrana con 100 microlitri della massa lavorante dell'anticorpo primario. Posizionare la provetta su un agitatore orbitale a temperatura ambiente a 200 giri/min e incubare per 30 minuti al buio. Diluire la miscela di anticorpi primari aggiungendo un millilitro di tampone di flusso.

Pipettare delicatamente su e giù un paio di volte per mescolare e centrifugare le cellule in una centrifuga pre-raffreddata a quattro gradi Celsius per quattro minuti. Aspirare completamente il supinato per rimuovere gli anticorpi non legati. Quindi, risospendere il pellet con 100 microlitri della scorta di lavoro dell'anticorpo secondario.

Ripetere l'incubazione a temperatura ambiente protetta dalla luce per 30 minuti. Nello stesso agitatore, diluire la miscela di anticorpi secondari aggiungendo un millilitro di tampone di flusso. Ripetere la stessa miscelazione dell'inversione del tubo, lo spin down e la rimozione del surnatante per eliminare tutti gli anticorpi non legati.

Ripetere gli stessi passaggi di centrifugazione di lavaggio da un millilitro e di rimozione del surnatante per altre due volte, ma con PBS fresco come tampone di lavaggio. Invece, il risultato finale sarà un pellet di cellule pulite marcato con anticorpi fluorescenti CFSC extracellulari o intracellulari mirati o qualsiasi combinazione dei tre resuspend, il pellet cellulare marcato in 150 microlitri di tampone di flusso. Trasferire la sospensione cellulare al citometro a flusso e iniziare l'analisi con le impostazioni appropriate del filtro di eccitazione ed emissione laser per ogni piano di quattro.

Utilizzando i dati di dispersione diretta e laterale come guida, è possibile impostare la dispersione iniziale in avanti rispetto a quella laterale all'interno del software di analisi della citometria a flusso per escludere punti dati non specifici come detriti cellulari e cellule morte. Successivamente, utilizzando i dati grezzi di una sospensione cellulare non colorata come controllo negativo, è possibile impostare più porte di integrazione fluorescente che selezionano i segnali di emissione positivi dalle etichette degli antigeni extracellulari e intracellulari per tenere conto della fluorescenza di fondo da multicolore. Gli effetti di sovrapposizione spettrale riregolano i cancelli fluorescenti utilizzando i dati grezzi dei controlli colorati con un singolo anticorpo.

In un esperimento fax multiplexato, i tag carbossi-fluoresceina possono essere utilizzati come segnale di base in grado di discriminare tra cellule di due diversi lignaggi o condizioni sperimentali senza l'uso di un anticorpo. Ad esempio, in una sospensione cellulare eterogenea, si può immediatamente distinguere tra cellule neurali marcate con CFSC e fibroblasti non marcati semplicemente osservando la presenza o l'assenza di fluorescenza nel canale verde. Inoltre, in combinazione con la marcatura CFSE Esther, è possibile utilizzare anticorpi fluorescenti di diversi colori per determinare l'espressione differenziale degli antigeni di superficie tra i sottogruppi marcati con CFSE e quelli non marcati all'interno di un campione misto.

Ad esempio, le cinque cellule di neuroblastoma Y SHSY marcate con CFSE nel canale di fluorescenza verde, co-esprimevano alti livelli di antigene di superficie CD 24, ma non del marcatore di fibroblasti CD 54. Al contrario, i fibroblasti CFSC negativi di BJ sono positivi per la CD 54 con livelli più bassi di CD 24. L'analisi degli antigeni della superficie neurale può essere eseguita anche in combinazione con il rilevamento degli antigeni intracellulari basato su anticorpi.

L'inclusione di campioni non colorati e di controlli con colorazione singola per antigeni di superficie e antigeni intracellulari è fondamentale come alternativa alla marcatura primaria e secondaria basata su anticorpi degli antigeni intracellulari, come la mappa dei marcatori neurali due mostrata qui. La marcatura fluorescente non covalente dell'anticorpo primario può produrre risultati comparabili nell'analisi di co-espressione e abbreviare il protocollo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare le cellule neurali per l'analisi citofluorimetrica di base utilizzando vari approcci di etichettatura alternativi e loro combinazioni.