High Throughput Caratterizzazione di cellule staminali adulte Engineered per consegna di fattori terapeutici per le strategie neuroprotettive

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di caratterizzare rapidamente le cellule staminali geneticamente modificate utilizzando un sistema di screening ad alto contenuto o HCS. Ciò si ottiene progettando e preparando prima gli esperimenti per una piastra da 96 pozzetti, e poi placcando le diverse popolazioni di cellule staminali ingegnerizzate. Successivamente, il sistema di screening ad alto contenuto viene preparato per l'imaging di cellule vive e quindi l'imaging time-lapse viene avviato per il periodo di tempo desiderato.

Quindi, dopo aver completato l'imaging time-lapse, la piastra di coltura viene preparata per le procedure di colorazione cellulare come lo ioduro di propidio, la colorazione per la morte cellulare o l'immunomarcatura KI 67 per caratterizzare la proliferazione cellulare. Infine, la piastra a 96 pozzetti viene ricaricata nel sistema di screening ad alto contenuto per l'imaging a fluorescenza e l'acquisizione di immagini. In definitiva, il software di analisi delle immagini viene utilizzato per condurre l'analisi dei dati per la determinazione di diversi parametri di crescita cellulare.

Questa metodologia può aiutare ad affrontare questioni chiave nel campo della biologia delle cellule staminali, come l'identificazione e la caratterizzazione dei fattori che stimolano la differenziazione delle cellule staminali. Le implicazioni di questa tecnica si estendono alle strategie terapeutiche basate sulle cellule a causa dell'importanza di caratterizzare i tipi di cellule prima che vengano utilizzati in vivo. Questo metodo può fornire informazioni sui comportamenti cellulari e può essere applicato praticamente a qualsiasi altro tipo di cellula che cresce bene in coltura.

Inoltre, questi approcci possono potenzialmente essere utilizzati su organismi interi come la larva di pesce zebra. Per iniziare, creare una mappa, come mostrato qui, della piastra a 96 pozzetti, delineando i diversi substrati e tipi di cellule da esaminare sotto una cappa di coltura sterile. Preparare una workstation con diversi substrati e una piastra da 96 pozzetti.

Aggiungere 100 microlitri di soluzione di substrato a ciascuno, bene secondo la mappa. Quindi utilizzare una striscia di perfil per sigillare il coperchio e conservare a quattro gradi Celsius durante la notte dopo aver isolato le cellule staminali mesenchimali di topo e averle infettate con vettori lentivirali secondo il protocollo di testo, rimuovere le soluzioni di substrato dalla piastra a 96 pozzetti e utilizzare circa 200 microlitri di PBS sterile per lavare i pozzetti due volte. Una volta rimosso il risciacquo finale, a 200 microlitri di terreno di coltura cellulare ed equilibrare la piastra in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Nel frattempo, in condizioni sterili, raccogliere le MSC raccogliendo prima il terreno di coltura, ora indicato come terreno condizionato, dal pallone in un tubo conico da 15 millilitri. Quindi aggiungere otto millilitri di PBS sterile al pallone e agitare delicatamente prima di aspirare il tampone Per staccare le cellule dal pallone, aggiungere un millilitro di soluzione di tripsina allo 0,05% e EDTA allo 0,01%. Quando le cellule si sono staccate, aggiungere otto millilitri del terreno condizionato prima di raccogliere la sospensione cellulare e riplaccare le cellule a circa 300 cellule per pozzetto.

Secondo il protocollo di testo, incubare la piastra per due ore per consentire alle MSC di attaccarsi al substrato mentre le cellule sono in incubazione. Avviare il sistema HCS e attendere due ore affinché si equilibri. Impostare il controller ambientale a 37 gradi Celsius e accendere con cautela la bombola di gas miscelato contenente il 5% di anidride carbonica nell'aria nel sistema HCS, camera ambientale che fornisce una fonte d'aria costante.

Successivamente, dopo il periodo di incubazione di due ore, rimuovere la piastra da 96 pozzetti dall'incubatore e posizionarla direttamente nella camera ambientale del sistema HCS. Dopo aver lasciato equilibrare la piastra per 30 minuti, avviare il software per configurare le impostazioni della piastra. Una volta impostati i parametri di imaging, secondo il protocollo di testo, utilizzare l'autofocus laser per mettere a fuoco il fondo del pozzetto e acquisire immagini di prova da più siti e più pozzetti per trovare un piano focale ottimizzato.

Una volta stabilita la messa a fuoco, iniziare a catturare le immagini ogni cinque minuti per 48 ore per tutti i 60 pozzetti. Al termine dell'esperimento, rimuovere la piastra da 96 pozzetti dal sistema HCS in condizioni sterili, raccogliere campioni di terreno condizionato da ciascun pozzetto e trasferirli in una piastra fresca da 96 pozzetti. Questi campioni possono essere successivamente utilizzati per un ELIZA per eseguire un saggio di proliferazione cellulare KI 67.

Utilizzare un tampone fosfato molare 0,1 per sciacquare le colture cellulari per un minuto. Dopo aver ripetuto il lavaggio, utilizzare il 4% di para formaldeide o PFA a temperatura ambiente per 20 minuti per fissare le colture dopo la fissazione. Rimuovere il PFA e utilizzare il PBS per sciacquare i pozzetti tre volte per sette minuti ciascuno.

Dopo aver bloccato le cellule secondo il protocollo di testo, applicare 100 microlitri di soluzione di anticorpi primari su ciascuna. Coprire bene la piastra e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte. Dopo aver lavato le celle tre volte per sette minuti.

Per ogni lavaggio, applicare anticorpi secondari. Mettere le celle al buio e incubare a temperatura ambiente per 90 minuti dopo altri tre lavaggi. Coprire la lastra e conservarla a quattro gradi Celsius fino all'imaging.

Per eseguire l'imaging automatizzato, caricare la piastra immunomarcata nel sistema HCS e lasciare che la piastra si equilibri per 20 minuti. Aprire il software di acquisizione e analisi delle immagini del sistema HCS. Scegli le impostazioni di acquisizione per l'obiettivo 10 x utilizzando la curvatura della fotocamera a uno e un'impostazione di guadagno su due.

Utilizzare la funzione di esposizione automatica per trovare il piano Z in cui risiedono le celle e calcolare l'offset per ciascuna lunghezza d'onda di interesse per l'analisi illustrata qui. Acquisizione di immagini per DAP, EGFP e S3. Scegliere il livello di intensità massimo al quale i pozzetti di controllo negativo non mostrano alcun segnale per l'acquisizione dell'immagine. Utilizzare le stesse impostazioni di soglia per i pozzetti positivi.

Infine, acquisisci le immagini e salvale in un database prima di eseguire l'analisi delle immagini. Secondo il protocollo di testo, come mostrato qui, cinque diverse popolazioni di sottotipi di MSC sono state piastrate in piastre di coltura tissutale a 96 pozzetti precodificate con diversi substrati in questa figura, anti KI 67, che identifica le cellule proliferanti, e DAPI è stato utilizzato per valutare se i diversi substrati influenzavano la proliferazione delle diverse popolazioni di MSC ingegnerizzate come illustrato qui, sebbene vi fosse una variazione nelle percentuali di MSC proliferanti, tutti i substrati supportavano una notevole proliferazione cellulare per ogni sottotipo di MSC. Questo grafico mostra che la percentuale di cellule con ioduro di propidio o colorazione PI, che identifica le cellule morte in una popolazione, è bassa su tutti i substrati esaminati: le cellule trattate con etanolo al 70%, che uccide la maggior parte delle cellule, hanno mostrato un alto tasso di marcatura PI e funge da controllo positivo per studiare il comportamento delle MSC su diversi substrati.

La migrazione cellulare in un periodo di 29 ore è stata analizzata utilizzando la microscopia digitale time-lapse. Il percorso di migrazione per la cella uno e la cella due è contrassegnato rispettivamente dalla linea verde e blu. Come mostrato qui, tutti i sottotipi di MSC hanno mostrato la velocità di migrazione più rapida sulla matrice extracellulare, sulle superfici rivestite e la più lenta sulle superfici in polistirene non rivestite.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di pianificare e progettare attentamente l'esperimento per un formato di piastra a più pozzetti, come una piastra a 96 pozzetti Seguendo questa procedura. Altri metodi, come Eliza S, possono essere eseguiti su terreni di coltura per rispondere a ulteriori domande riguardanti la produzione e la secrezione di fattori terapeutici da parte delle cellule staminali ingegnerizzate dopo il suo sviluppo. Le procedure di screening ad alto contenuto hanno spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia delle cellule staminali e della scoperta di farmaci per esplorare sistemi biologici complessi in modo ad alto rendimento.