Tecnica mini-invasiva per iniezione in Rat nervo ottico

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un approccio minimamente invasivo per iniettare farmaci o cellule staminali nel nervo ottico di un ratto vivo. Ciò si ottiene anestetizzando prima il ratto, posizionandolo sul supporto di dissezione e inserendo una sutura nella congiuntiva per la manipolazione dell'occhio. Successivamente, il secondo passo consiste nel sezionare la cresta orbitale dietro l'occhio per esporre il nervo ottico.

Successivamente, la pipetta di vetro viene inserita nel nervo ottico e il farmaco o le cellule staminali vengono iniettati prima della chiusura del sito chirurgico e della rianimazione del ratto dall'anestesia. Alla fine, dopo un certo periodo di tempo, il ratto viene sacrificato, il nervo ottico sezionato e gli effetti dell'iniezione chirurgica o del trapianto possono essere visualizzati al microscopio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che questo approccio è minimamente invasivo e ciò consente al ratto di sopravvivere per tutto il tempo necessario.

Studia gli effetti dell'iniezione chirurgica o del trapianto. A dimostrare la procedura sarà Kate Schwartz, una studentessa di tecnico del mio laboratorio. Eseguire tutte le procedure chirurgiche in anestesia con il 2-3% di fluoro.

Confermare il livello appropriato di anestesia con il pizzico delle dita dei piedi e la frequenza respiratoria. Controlla che il ratto non sussulti in risposta a un dito del piede. Pizzicare. Fissare l'animale se necessario per evitare movimenti della testa durante la procedura.

Quindi posizionare una goccia di lidocaina sull'occhio chirurgico. Usa lacrime artificiali ogni 10 minuti per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Somministrare un'iniezione preoperatoria di buprenorfina a 0,01 milligrammi per chilogrammo per via sottocutanea e poi ogni sei-otto ore secondo necessità.

Mantieni l'animale al caldo con un termoforo. Bagnare il pelo del cuoio capelluto con alcool. Facendo attenzione ad evitare l'esposizione agli occhi.

Assicurati di utilizzare strumenti sterili e tecniche sterili per ridurre al minimo il rischio di infezioni postoperatorie. Quindi posizionare una sutura a quattro o nella congiuntiva laterale e legarla con una sutura sufficiente a consentire una trazione delicata. Praticare un'incisione di circa un pollice nella pelle sovrastante la cresta orbitale.

Utilizzando un bisturi di taglia 10. Ritrarre la pelle e la fascia sottostante e sezionare con cura la fascia. Posizionare una sutura nella pelle retratta per consentire l'esposizione del sacco orbitale superiore per prevenire un sanguinamento eccessivo nel sito chirurgico.

Evitare di tagliare i vasi sanguigni durante la dissezione della fascia. Con una leggera trazione sulla congiuntiva, tirando l'occhio verso il basso e fuori dall'orbita, il muscolo orbitale superiore entrerà in vista. Per esporre il nervo ottico, il grasso retroorbitale deve essere rimosso e questo muscolo tagliato.

Il grasso può essere scartato e non deve essere sostituito dopo l'iniezione. Da questo punto, la fascia del nervo ottico dovrebbe essere visibile come un fascio del nervo ottico stesso, insieme ai vasi sanguigni avvolti nella dura. Per effettuare la dissezione più profonda, praticare una piccola incisione nel DRA utilizzando il bisturi o un ago smussato calibro 31 per rendere il piercing meno traumatico, preparare una micro pipetta di vetro tirata con un diametro da 50 a 100 micron per fornire stabilità.

Montare la micropipetta su un micromanipolatore e collegarla a una siringa di plastica da 20 cc. Estrarre le perle o le cellule staminali ricostituite in 0,5-1 microlitri nella micropipetta retrograda, insieme a 0,5 microlitri di soluzione di blu di metile prima e dopo che la pipetta di vetro è stata caricata con il colorante. Utilizzando una siringa da un cc e un ago calibro 30, abbassare la punta della micropipetta sul nervo ottico appena sopra la dura intaccata.

Un movimento piccolo ma brusco della punta del vetro nel nervo ottico provoca il minor danno durante l'applicazione di una pressione lenta e costante sullo stantuffo. Il colorante blu di Evans dovrebbe evidenziare l'area del nervo ottico iniettato. Il colorante deve rimanere localizzato all'interno del nervo ottico senza fuoriuscire nello spazio subaracnoideo.

Segui la seconda banda del colorante blu di Evan per determinare quando l'iniezione di cellule staminali è completa. Quando il volume necessario viene iniettato nel nervo ottico, rilasciare lo stantuffo. Tenere la micropipetta ferma all'interno del nervo ottico per cinque minuti per evitare l'espulsione ad alta pressione al momento del ritiro della micropipetta al termine dell'iniezione.

Rimuovere la micropipetta insieme alle punte di cotone utilizzate per fornire l'emostasi. Sutura la pelle con seta 3.0 e rimozione della sutura congiuntivale. Tieni i ratti al caldo su un termoforo fino a quando non emergono dall'anestesia.

Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la posizione sdraiata sternale. Se l'animale mostra segni di dolore, tra cui letargia eccessiva, atassia o respiro affannoso, somministrare un'analgesia appropriata con buprenorfina intramuscolare fino a tre volte al giorno. Dopo l'esperimento, i ratti sono stati sacrificati e perfusi con paraldeide.

I nervi ottici sono stati accuratamente sezionati e montati per il sezionamento del criostato, mostrato qui è un esempio di un nervo ottico a foro di ratto a bassa potenza in cui è stato iniettato il colorante blu di Evan. Per visualizzare il sito, la freccia identifica la posizione precisa dell'iniezione. Questa dissezione è stata eseguita entro pochi giorni dall'iniezione, come indicato dalla limitata diffusione del colorante lungo il nervo dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurologia rigenerativa per esplorare nuovi modi per rigenerare il nervo ottico e potenzialmente ripristinare la vista persa in questo modello di ratto di malattia demielinizzante.