Name: Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Impara a generare cloni di cellule T umane specifiche per alloantigeni da sangue periferico. Questo metodo utilizza centrifugazione a gradiente di densità, separazione magnetica e citometria a flusso per isolare e coltivare cellule T con reattività antigene definita.

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L'autore desidera ringraziare il NIH Tetramer Core Facility per la produzione di tetrameri. L'autore desidera inoltre ringraziare E.D. O'Connor e K.E. Marquez del laboratorio di citometria a flusso UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility per l'assistenza nello smistamento delle cellule. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).

NOTA: Questo protocollo richiede l&#39;utilizzo di campioni di sangue periferico di volontari umani. Tutta la ricerca con soggetti umani deve essere esaminato e approvato da un studi sull&#39;uomo Institutional Review Board per garantire la conformità con la Dichiarazione di Helsinki (2013) e l&#39;Health Insurance Portability e Accountability Act del 1996. 1. Isolamento dei linfociti T da sangue intero <ol><li> Prima di iniziare, riscaldare il mezzo gradiente di densità a temperatura ambiente. Aliquota 4 ml di terreno gradiente di densità in 2-4 sterili da 15 ml provette coniche (1 tubo verrà utilizzato per ogni 10 ml di volume totale di sangue diluito). </li><li> Ottenere 10-20 ml di sangue in 1-2 sodio eparina a spruzzo con rivestimento (verde-top) provette di raccolta del sangue venoso. Raccogliere campioni umani sotto la supervisione di persone addestrate e secondo un Institutional Review Board ha approvato il protocollo. </li><li> Pulire la parte esterna dei tubi con il 70% di etanolo. Rimuovere con attenzione le cime della firiempito provette per il prelievo e decantare il sangue in una sterile 50 ml provetta da centrifuga. </li><li> Aggiungere 10 ml sterile tampone fosfato salino (PBS) per ogni tubo di raccolta del sangue. Raccogliere il PBS, aggiungere al sangue intero decantato, e mescolare delicatamente. </li><li> Aggiungere 25 microlitri T umano di arricchimento cellulare Cocktail / 2 ml di volume totale. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Usando una pipetta 10 ml, sovrapporre fino a 10 ml di 1: 1 sangue diluito delicatamente sulla sommità del mezzo gradiente di densità. Fare attenzione a non disturbare la superficie del terreno gradiente di densità. </li><li> Centrifugare il sangue strati e media densità gradiente a 1.200 xg per 20 min a 20 ° C. </li><li> Rimuovere le provette dalla centrifuga, avendo cura di non interrompere l&#39;interfaccia tra il mezzo gradiente di densità e lo strato di leucociti all&#39;interfaccia tra il mezzo gradiente di densità e il plasma diluito. Usando una pipetta da 5 ml, raccogliere con cura lo strato di leucociti e trasferimento in una nuova sterile 50 ml vasca conicae. </li><li> Aggiungere PBS per portare il volume della raccolta PBL a 50 ml e mescolare delicatamente. </li><li> Centrifugare a 600 xg per 5 min a 20 ° C. Decantare. </li><li> Risospendere le cellule in pellet in 10 ml sterile flusso citometria ordinamento tampone (sterile filtrata PBS contenente 1% BSA). Esempio 10 ml di sospensione cellulare, diluire 1:10 (aggiungere a 90 ml) trypan blu per contare le cellule utilizzando un emocitometro (rendimento atteso 1 - 4 x 10 6 cellule / tubo di sangue intero). <ol><li> Rimuovere 1 ml un&#39;aliquota, trasferire 5 ml di tubo, e tenere in ghiaccio per l&#39;analisi delle cellule T non etichettati da tetramero. Tenere sospensione cellulare su ghiaccio. </li></ol></li></ol> 2. magnetico arricchimento di cellule T alloantigene-specifici <ol><li> Diluire alloantigene pMHC tetramero a 1: 100 in tampone tipo sterile. </li><li> Sospensione cellulare Centrifuga (9 ml dal punto 1.11) a 600 xg per 5 min a 20 ° C. Decantare. </li><li> Aggiungere 50 ml di diluito alloantigene pMHC tetramero a pelletcellule (fino a 10 7 cellule). Mescolare delicatamente pipettaggio. Trasferimento in una provetta sterile da 5 ml. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone di sorta. Centrifugare a 600 xg per 5 min a 20 ° C. Decantare. </li><li> Risospendere le cellule in 100 microlitri di buffer sorta. Aggiungere 10 ml biotina selezione di cocktail e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 5 ml Nanoparticelle magnetiche e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 2,5 ml sorta tampone e mescolare delicatamente con una pipetta. Togliere 100 ml un&#39;aliquota, trasferimento in 5 ml di tubo, e tenere in ghiaccio per l&#39;analisi di cellule pre-arricchimento. </li><li> Posizionare il tubo 5 ml, contenente la sospensione cellulare nel magnete separazione cellulare. Il tappo deve essere vagamente in cima al tubo. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere delicatamente il tappo dal tubo. Mantenendo il tubetto e magnete insieme, decantare il contenuto del tubo in una nuova provetta 5 ml. Non urtare o scuotere il contenuto della provetta perrimuovere le ultime gocce di liquido. </li><li> Togliere la provetta dal magnete. Aggiungere 2 ml di tampone di tipo freddo e mescolare delicatamente con una pipetta. Esempio 10 ml di sospensione cellulare, diluire 1: 2 (aggiungere a 10 ml) trypan blu per contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li></ol> 3. Preparazione delle cellule T per la singola cella di Citometria a Flusso Ordinamento cellulare <ol><li> Aggiungi buffer di tipo fredda a tutte le provette di cellule tetramero (senza etichetta, tetramero marcato non-arricchito, e tetramero marcati arricchito) per portare il volume a 3 ml. </li><li> Centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C e tampone decantare per recuperare le cellule. </li><li> Risospendere le cellule pellet in 25 microlitri di buffer tipo freddo. Aggiungere 5 ml di blocco Fc umana. Incubare in ghiaccio per 20 min. </li><li> Preparare anticorpi per citometria a flusso ordinamento. Mescolare 15 ml di buffer sorta, 15 microlitri anti-CD5, 15 microlitri anti-CD14, e 15 microlitri anti-CD19. </li><li> Aggiungere 20 ml di miscela di anticorpi a ciascuna provetta di cellule. Incubare in ghiaccio per 20 min. </li><li> Aggiungere 2 ml di tampone di tipo freddo ad ogni provetta. </li><li> Centrifugare a 600 xg per 5 minuti a 4 ° C e tampone decantare per recuperare le cellule. </li><li> Risospendere le cellule ad una concentrazione di 1 -2 x 10 6 cellule / ml in tampone di ordinamento. </li><li> Un&#39;aliquota di 100 ml di terreno di coltura delle cellule T umane (DMEM di Iscove integrati con 2 Glutamax mM, HEPES 10 mM, 50 mg / ml di gentamicina, 50 mM 2-mercaptoetanolo, siero umano AB 10% inattivato al calore, e 2,5 ng / ml umana ricombinante IL-2) a ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a fondo rotondo da 96 pozzetti. Tenere su ghiaccio. </li></ol> 4. L&#39;isolamento di cellule T tetramero marcato da Single-cell Citometria a flusso Ordinamento <ol><li> Stabilire citometria a flusso parametri di gating per identificare etichettati cellule T alloantigene-pMHC tetramero (Figura 2.a). Utilizzare la frazione tetramero di pre-arricchimento etichettati per stabilire gating strategie per eliminare doppietti, porta sui linfociti, cellule che esprimono CD19 escludere B e CD14esprimendo monociti, e identificare le cellule T dall&#39;espressione CD5. Utilizzare il campione non etichettati con tetramero come una fluorescenza meno un controllo per stabilire il gating per l&#39;identificazione di cellule tetramero legame T (con lo 0% di CD5 + CD14 - CD19 - le cellule del campione non etichettati da tetramero dovrebbero rientrare nell&#39;ambito di questa porta) . NOTA: Soppressione strategie che non sono sufficientemente stringenti comporterà isolamento di cellule non-T o cellule T non antigene specifico, mentre le strategie di gating eccessivamente restrittive riducono il numero di cellule T isolate. </li><li> Programmare i parametri di targa del singolo tipo cellulare. Dirigere il sorter di inserire 1 CD5 + CD14 - CD19 - tetramero + cellule in ciascun pozzetto. Dirigere il piatto creato per contenere 1 controllo negativo (assenza di cellule ordinate nel pozzo) e 1 controllo positivo (100 CD5 + CD14 - CD19 - tetramero - cellule) in ogni riga (Figura 2.B </strong&gt;). </li><li> Utilizzando il flusso stabilito citometria strategia di gating e messa a punto piatto, isolare singole cellule tetramero vincolante T direttamente nella piastra a 96 pozzetti con un cell sorter citometria a flusso. </li></ol> 5. Cultura ed espansione di alloantigene-specifici cloni di cellule T <ol><li> Dopo il completamento della separazione delle cellule, piastra centrifugare a 600 xg per 5 min a 20 ° C. Luogo piastra di coltura a 37 ° C in un incubatore CO 2 al 6%. </li><li> Vortex stimolatori microsfere anti-CD3 / anti-CD28-per 30 secondi per risospendere le sfere. </li><li> Calcolare il volume di perline attivatore necessari per la stimolazione delle cellule T raccolti (0,5 ml di attivatore microsfere / pozzetto). Trasferire volume calcolato di perline stimolatore di una provetta sterile da 5 ml. Aggiungere 1 ml di cellule T umane terreno di coltura e vortice. </li><li> Posizionare il tubo con sospensioni microbead magnete. Il tappo deve essere vagamente in cima al tubo. Incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere delicatamenteil tappo dal tubo. Tenendo il tubo e magnete insieme, contenuto della provetta decantare in una nuova provetta da 5 ml. Non urtare o scuotere il contenuto della provetta. </li><li> Togliere la provetta dal magnete. Aggiungere mezzo di coltura delle cellule T umane (100 microlitri medio / 0,5 ml di microsfere inizialmente aggiunto). </li><li> Aliquotare 100 microlitri di sospensione attivatore tallone a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Incubare piastra di coltura a 37 ° C in un incubatore CO 2 al 6%. </li><li> Monitorare la crescita cellulare tutti i giorni con l&#39;esame microscopico. I piccoli gruppi di cellule proliferanti possono essere osservati al microscopio dopo 5 - 7 giorni di coltura (Figura 3.a). NOTA: visualizzazione di colture cellulari T a questo punto può essere difficile, e l&#39;assenza di gruppi di cellule osservabili in questa fase può non essere indicativo di una mancanza di cellule T in crescita. </li><li> A 14 giorni dopo l&#39;isolamento delle cellule, le culture di alimentazione rimuovendo con cura 100 ml di mezzi fuori della parte superiore della cultura e sostituirli con 100 μ; L fresca umano T terreno di coltura cellulare. Continuare l&#39;incubazione piastra di coltura a 37 ° C in un incubatore CO 2 al 6%. </li><li> Monitorare la crescita cellulare giornalmente mediante controllo e valutazione del colore del mezzo di coltura microscopica. I grandi gruppi di cellule dovrebbero essere visibili microscopicamente 2 - 3 giorni dopo il cambio medio. Macroscopicamente, pellet cellulari dovrebbero diventare visibili durante i 14 giorni successivi al cambio medio. </li><li> A 28 giorni dopo l&#39;isolamento delle cellule, individuare i cloni che crescono con l&#39;esame microscopico. Trasferire il volume di 200 microlitri della piastra a 96 pozzetti culture crescita positivi a singoli pozzetti di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti contenente 200 microlitri terreno di coltura delle cellule T umane. </li><li> Aggiungere 100 ml contengono 12,5 ml di microsfere di stimolo anti-CD3 / anti-CD28 (preparato come descritto nelle sezioni 5,2-5,6). Incubare piastra di coltura a 37 ° C in un incubatore CO 2 al 6%. </li><li> Monitorare la crescita della cultura ogni giorno da microscopici examminazione e valutazione del colore del mezzo di coltura. Quando la cultura delle cellule T raggiunge&gt; 2x10 6 / ml (in genere 3-5 giorni dopo la ri-stimolazione, può essere stimato dal giorno in cui i media inizia a trasformare giallo paglierino), la cultura trasferimento ad un pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti tessuto e aggiungere 500 media delle cellule T umane ml. </li><li> A 10-14 giorni seguito ri-stimolazione, raccogliere 200 ml di coltura di cellule T per valutare la specificità alloantigene citometria a flusso di pMHC tetramero vincolante (utilizzando la strategia di etichettatura e gating descritto nelle sezioni 3 e 4.1). </li></ol> 6. a lungo termine Re-stimolazione e la cultura di cloni di cellule T <ol><li> Continuamente ri-stimolare ed espandere colture di cellule T clonali con la specificità desiderata può essere ogni 14 giorni. Raccogliere colture di cellule T in una provetta sterile da 5 ml al giorno 14 dopo l&#39;ultima stimolazione microbead anti-CD3 / CD28. Combinare pozzi multipli dello stesso clone di cellule T in un unico tubo, fino ad un volume di 2,5 ml. </li&gt; <li> Aggiungere mezzo per portare il volume finale di 2,5 ml e mescolare delicatamente con una pipetta. </li><li> Posizionare il tubo 5 ml contenente la coltura di cellule T nel magnete separazione cellulare per rimuovere le microsfere dalla cultura. Il tappo deve essere vagamente in cima al tubo. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere delicatamente il tappo dal tubo. Mantenendo il tubetto e magnete insieme, decantare la sospensione cellulare in una nuova provetta 5 ml. Non urtare o scuotere il contenuto della provetta per rimuovere le ultime gocce di liquido. </li><li> Aggiungere mezzo per portare il volume finale a 4 ml. Campione di 10 microlitri per contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Recupero cellule T mediante centrifugazione a 600 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Decantare il surnatante. Risospendere le cellule T a 10 6 cellule / ml T umano mezzo di coltura cellulare. Trasferire 1 ml aliquote a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. </li><li> Re-stimolare le cellule T con l&#39;aggiunta di 100 microlitri supporti contenenti 12,5 ml di stimolazione anti-CD3 / amicrosfere NTI-CD28 (come descritto nelle sezioni 5,2-5,6). Incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 al 6%. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

L'alloreattività delle cellule T è un fenomeno studiato a lungo e clinicamente rilevante. Le robuste risposte proliferative ed effettrici delle cellule T alla stimolazione allogenica hanno permesso analisi approfondite delle risposte delle cellule T umane in vitro attraverso reazioni linfocitarie miste relativamente semplici delle cellule T del sangue periferico contro le cellule allogeniche inattivate. Tuttavia, queste risposte primarie delle cellule T alloreattive sono oligoclonali, costituite da un gran numer...

I linfociti T sono componenti critici del sistema immunitario adattativo. Le cellule T sono responsabili non solo mediare direttamente risposte immunitarie protettive a patogeni attraverso una varietà di meccanismi effettori, ma anche mantenere attivamente immunologica auto-tolleranza e dirigere le risposte di altre cellule del sistema immunitario. Queste funzioni sono diretti attraverso una serie di segnali integrati, compreso recettore delle cellule T (TCR) legatura, citochine e chemochine, e metaboliti 1. Di questi segnali, il TCR è di particolare importanza, in quanto fornisce la specificità caratteristica che definisce il ruolo delle cellule T nell&#39;immunità adattativa. Un TCR interagisce con antigeni peptidici lineari presentati da MHC (HLA ortologo umano) molecole (complessi pMHC) in modo altamente specifico e sensibile per fornire i segnali che attivano la funzione delle cellule T effettrici. I parametri biochimici delle interazioni TCR con leganti pMHC non solo forniscono la specificità per Tattivazione delle cellule, ma anche avere un impatto qualitativo sulla funzione delle cellule T 2 successiva. Così, studiando la funzione delle cellule T richiede spesso di esaminare le risposte delle cellule T clonali con specificità antigenica definito. Il vano umano delle cellule T, che contiene circa 10 12 cellule T αβ, contiene, secondo le stime 10 luglio-10 agosto αβTCRs distinte 3-4. Questo vasto repertorio offre opportunità per il riconoscimento della vasta gamma di peptidi da potenziali agenti patogeni tali da richiedere una risposta delle cellule T per l&#39;immunità protettiva. Si stima che la frequenza delle cellule T rispondere ad un dato antigene estraneo presentata dalla auto-MHC è dell&#39;ordine di 10 -4 - 10 -7 in assenza di prima risposta immunitaria a questo antigene 5. L&#39;ingenuo repertorio delle cellule T è modellato dalla selezione timica per garantire la capacità di riconoscere auto-MHC presentano antigeni peptidici e limite reagisconoivity contro antigeni self-peptide, massimizzando l&#39;utilità potenziale di mediare l&#39;immunità protettiva 2. Tuttavia, in violazione del presente progettato reattività relativamente grande frequenza, 10 -3 - 10 -4, di cellule T da individui immunologicamente naive rispondere alla stimolazione con cellule allogeniche, riconoscendo entrambe le molecole MHC estere nonché peptidi endogeni che presentano 6. Il riconoscimento di allogenici ligandi pMHC è strutturalmente simile al riconoscimento di antigeni estranei presentate da auto-MHC; TCR rende interazioni biochimiche critici sia con la molecola MHC allogeniche e il peptide presentato 7. La natura robusta della risposta delle cellule T allogeniche ai risultati della stimolazione della diversità dei pMHC complessi presenti sulla superficie delle cellule allogeniche 8. Si stima che ogni MHC presenta circa 2 x 10 4 differenti antigeni peptidici endogeni 9. Questo breadth di risposta alla stimolazione allogenico è un aspetto significativo della patologia clinicamente rilevanti, come il rigetto o di malattia da trapianto contro ospite (GVHD), derivanti da alloreattività cellule T. Studio delle cellule T risposte alloreattivi umani ha tradizionalmente invocato l&#39;esame delle risposte policlonali di cellule T naive in seguito alla stimolazione con cellule allogeniche. Stimolazione ripetuta con la stessa linea di cellule allogeniche combinato con diluizione limite analisi è in grado di generare cellule T clonali con riconoscimento definito di allogenico HLA 10. Tuttavia, questo approccio è problematico per l&#39;esame delle risposte ai singoli ligandi allogenici pMHC, come il grande e variegato repertorio di endogena pMHC complessi presenti per un determinato allogenico HLA stimola un ampio repertorio di cellule T. Questa stimolazione popolazione di massa e di limitare la diluizione approccio richiederebbe lo screening di un gran numero di cloni per isolare le cellule T con il riatti desideratovità contro un singolo ligando pMHC. Inoltre, la frequenza delle cellule T che rispondono ad un individuo allogenico pMHC ligando è relativamente bassa tra popolazioni di cellule T naive, che presenta una barriera efficace generazione di cloni di cellule T umane sensibili ad un dato antigene. Identificazione e isolamento di cellule T antigene-specifiche da popolazioni policlonali sono stati abilitati dallo sviluppo di fluoroforo marcata pMHC multimeri 11. Questo approccio utilizza specifici antigeni peptidici caricati in molecole MHC ricombinanti solubili biotinilate, etichettati legandosi ad un fluoroforo streptavidina marcata. Multimerizzazione di pMHC aumenta l&#39;avidità, compensando la intrinsecamente basso (mM) affinità del TCR per ligandi solubili pMHC. Cellule marcate possono essere identificati e isolati mediante citometria a flusso. Tuttavia, questo approccio è ancora limitata dalla bassa frequenza di cellule T antigene-specifiche tra naive popolazioni di cellule T, che sono tipicamenteordini di grandezza inferiore al limite di identificazione accurata e quantificazione sulla maggior citofluorimetri. Per affrontare questa limitazione, un metodo di etichettatura tetramero pMHC e successiva tallone arricchimento magnetico per cellule tetramero-marcato è stato sviluppato 12. Questo metodo ha dimostrato rilevamento affidabile, l&#39;enumerazione, e l&#39;isolamento di cellule T antigene-specifiche bassa frequenza. Questo protocollo descrive un protocollo efficace per la generazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente ai singoli ligandi allogenici pMHC. Il protocollo si applica pMHC (HLA) etichettatura Multimer e di arricchimento per l&#39;isolamento di cellule T umane specifiche per alloantigene con citometria a flusso delle cellule di ordinamento e un metodo robusto per la coltura in vitro di cellule T umane per consentire la produzione di cloni di cellule T da cellule ordinati singole ( panoramica nella Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Provetta per prelievo di sangue venoso con eparina di sodio 16 x 100 mm</td><td>Becton, Dickenson and Company</td><td>366480</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Rosette Set Kit di arricchimento delle cellule T umane</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>PBS di Dulbecco, 1x senza Ca o Mg</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Albumina</td> <td>sierica bovinaSigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6635</td><td></td></tr><tr><td>Tetramero pMHC marcato con fluoroforo</td><td>NIH Tetramer Facility</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit di selezione della biotina</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18553</td><td></td></tr><tr><td>Magnete di selezione EasySep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>TruStain FcX Soluzione</td> <td>di blocco Fc umanoBiolegend</td><td>422301</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2)</td><td>Biolegend</td><td>300621</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 FITC (clone HCD14)</td><td>Biolegend</td><td>325603</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19 FITC (clone HIB19)</td><td>Biolegend</td><td>302205</td><td></td></tr><tr><td>DMEM di Iscove, senza b-ME o L-glutammina</td><td>Corning</td><td>15-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>b-Mercaptoetanolo&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato (50 mg/ml)</td><td>Omega Scientific</td><td>GT-50</td><td></td></tr><tr><td>Siero umano AB, donatore maschio</td><td>Omega Scientific</td><td>HS-30</td><td></td></tr><tr><td>Umano ricombinante IL-2</td><td>Peprotech</td><td>AF 200-02</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Life Tecnologie</td><td>11131D</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td><td></td>di selezione cellulare</tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>1 L</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>10 g</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>2 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Terreno di coltura di cellule T umane DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>di Iscove</td><td>351,6 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero AB umano inattivato termicamente</td><td>40 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (100x)</td><td>4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina (50 mg/ml)</td><td>0,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>b-mercaptoetanolo (14,3 M)</td><td>1,4 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-2 umana ricombinante (1 mg/ml)</td><td>1 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di human alloantigene-specifiche cellule t da sangue periferico

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Lo studio della biologia dei linfociti T umani spesso comporta l'esame delle risposte ai ligandi attivanti. Le cellule T riconoscono e rispondono agli antigeni peptidici processati presentati dalle molecole MHC (HLA ortologo umano) attraverso il recettore delle cellule T (TCR) in modo altamente sensibile e specifico. Mentre la funzione primaria delle cellule T è quella di mediare le risposte immunitarie protettive agli antigeni estranei presentati dall'auto-MHC, le cellule T rispondono in modo robusto alle differenze antigeniche nei tessuti allogenici. Le risposte delle cellule T agli alloantigeni possono essere descritte come alloreattività diretta o indiretta. Nell'alloreattività, la cellula T risponde attraverso il riconoscimento altamente specifico sia del peptide presentato che della molecola MHC. La robusta risposta oligoclonale delle cellule T alla stimolazione allogenica riflette il gran numero di alloantigeni potenzialmente stimolatori presenti nei tessuti allogenici. Mentre l'ampiezza delle risposte alloreattive delle cellule T è un fattore importante nell'avvio e nella mediazione della patologia associata a risposte alloreattive biologicamente rilevanti come la malattia del trapianto contro l'ospite e il rigetto dell'allotrapianto, può precludere l'analisi delle risposte delle cellule T ai ligandi allogenici. A tal fine, questo protocollo descrive un metodo per generare cellule T alloreattive da leucociti del sangue periferico umano (PBL) naïve che rispondono agli alloantigeni noti del peptide-MHC (pMHC). Il protocollo applica la marcatura multimerica pMHC, l'arricchimento di biglie magnetiche e la citometria a flusso a metodi di coltura in vitro di singole cellule per la generazione di cloni di cellule T alloantigene-specifiche. Ciò consente di studiare la biochimica e la funzione delle cellule T che rispondono alla stimolazione allogenica.

Questo protocollo descrive la generazione di colture di cellule T clonale umani con definito alloantigene specificità attraverso un arricchimento tallone magnetico e flusso a cella singola citometria di ordinamento strategia. La Figura 1 fornisce una panoramica del processo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52257/52257fig1highres.jpg" /> Figura 1: Panoramica del protocollo Il protocollo qui descritto forni...

Questo articolo descrive un metodo per la generazione e la propagazione di cloni di cellule T umane che rispondono specificamente a un alloantigene definito. Questo protocollo può essere adattato per la clonazione di cellule T umane specifiche per una varietà di ligandi peptidici-MHC.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare, isolare e clonare le cellule T umane con una specificità all'antigene definita. Ciò si ottiene isolando prima i linfociti T da tutto il sangue periferico mediante centrifugazione a gradiente di densità. Nella seconda fase, le cellule T specifiche dell'antigene sono marcate con tetrameri del peptide coniugato Fluor four, HLA, e arricchite mediante separazione magnetica.Successivamente, le cellule T marcate vengono isolate mediante smistamento cellulare con citometria a flusso a cellula singola. Infine, le colture di singole cellule vengono stimolate con anticorpi anti CD tre e anti CD 25. In definitiva, l'allo-reattività delle cellule T antigene specifico può essere valutata mediante analisi citofluorimetrica.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre tecniche come la stimolazione di massa dei linfociti e la diluizione limitante è che questa tecnica consente la generazione di cloni di cellule T con reattività specifica agli antigeni ben definiti. In generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo possono avere difficoltà nella coltura e nell'espansione dei cloni delle cellule T. Ciò richiede un attento monitoraggio quotidiano delle colture prima di iniziare la procedura.Aliquotare quattro millilitri di gradiente di densità a temperatura ambiente in due o quattro provette da centrifuga coniche sterili da 15 millilitri utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'esterno di una o due provette di raccolta del sangue verdi riempite contenenti sangue da un volontario sano e quindi rimuovere con cura le parti superiori, decantare il sangue in una provetta da centrifuga sterile da 50 millilitri, e poi res ogni provetta di raccolta con 10 millilitri di PBS. Raggruppare i lavaggi con il sangue intero decantato e mescolare delicatamente una soluzione, quindi incubare le cellule con 25 microlitri di cocktail di arricchimento di cellule T umane per due millilitri di volume totale di sangue diluito. Dopo 20 minuti, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per sovrapporre delicatamente fino a 10 millilitri di sangue sopra il mezzo del gradiente di densità, facendo attenzione a non interrompere la superficie del gradiente.Centrifugare le cellule per 10 minuti e quindi utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire con cura lo strato di leucociti dall'interfaccia del gradiente di densità e il plasma diluito in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Portare il volume dei linfociti del sangue periferico raccolti fino a 50 millilitri con PBS e mescolare delicatamente la sospensione cellulare. Quindi contare le cellule e rimuovere un'aliquota di un millilitro per l'analisi.Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule in profondità, sospendere i pellet in un millilitro di tampone per citometria a flusso e mescolare 50 microlitri del peptide MHC dell'antigene diluito nella sospensione cellulare. Trasferire le cellule in una provetta sterile da cinque millilitri, quindi dopo 30 minuti, lavare le cellule in due millilitri di una sorta di tampone di risus. Sospendere il palato in 100 microlitri di tampone, quindi incubare le cellule in 10 microlitri di cocktail di selezione di biotina per 15 minuti.Successivamente, incubare le cellule in cinque microlitri di particelle magnetiche per 10 minuti, quindi mescolare delicatamente la sospensione cellulare con 2,5 millilitri di tampone di sorta. Rimuovere un'aliquota da 100 microlitri di analisi delle celle di arricchimento dei preen, quindi posizionare la provetta nel magnete di separazione cellulare. Dopo cinque minuti, tenere insieme il tubo e il magnete e travasare il contenuto in un tubo nuovo da cinque millilitri.Quindi rimuovere la provetta dal magnete e lavare le cellule in due millilitri di tampone di selezione, risospendere il pellet in un tampone di selezione a freddo e aliquotare le cellule in due millilitri di tampone di selezione a freddo per tipo di campione. Dopo aver centrifugato nuovamente i campioni, sospendete nuovamente i pellet in 25 microlitri di tampone di smistamento a freddo e incubate le cellule in cinque microlitri di blocco FC umano su ghiaccio per 20 minuti. Quindi, incubare le provette con 20 microlitri del cocktail di anticorpi appropriato.Dopo 20 minuti, lavare le celle in altri due millilitri di tampone di smistamento a freddo e risospendere i pellet a una risoluzione compresa tra uno e 2 milioni di cellule per millilitro. In più tampone, quindi aliquotare, 100 microlitri di terreno di coltura di cellule T umane in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a fondo rotondo da 96 pozzetti e conservare la piastra su ghiaccio fino al completamento della cernita. Dopo la cernita, centrifugare la piastra e quindi posizionare le celle a 37 gradi Celsius in un incubatore al 6% di CO2.Quindi, mescolare il volume appropriato di perle attivatrici mediante vortex e trasferire il volume appropriato di perle in un tubo sterile da cinque millilitri. Dopo aver lavato le perle sul magnete, decantare la soluzione di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di coltura di cellule T umane, terreno per 0,5 microlitri di microsfere al tubo. Quindi aliquotare 100 microlitri della sospensione di perle attivatrici in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e rimettere le cellule nell'incubatore.Piccoli gruppi di cellule proliferanti possono essere osservati al microscopio dopo cinque-sette giorni di coltura, 14 giorni dopo l'isolamento cellulare. Sostituire con cura 100 microlitri di terreno dalla parte superiore delle colture con 100 microlitri di coltura di cellule T umane fresche. I cluster cellulari di medie dimensioni dovrebbero essere visibili al microscopio due o tre giorni dopo l'alimentazione macroscopicamente; i pellet cellulari dovrebbero diventare visibili durante i 14 giorni successivi al cambio del mezzo.Dopo 28 giorni dall'isolamento cellulare, trasferire l'intero volume di 200 microlitri delle colture positive alla crescita in pozzetti individuali di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti contenente 200 microlitri di terreno di coltura di cellule T umane. Quindi aggiungere 12,5 microlitri di microsfere stimolanti anti CD tre, anti CD 28 in 100 microlitri di terreno di coltura di cellule T umane e rimettere la piastra nell'incubatore da tre a cinque giorni dopo la restimolazione. Il terreno dovrebbe iniziare a diventare giallo paglierino.A questo punto, trasferire le colture in pozzetti individuali di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura di cellule T umane a ciascuna coltura. Infine, a 10-14 giorni dalla restimolazione, raccogliere 200 microlitri di ciascuna coltura di cellule T per valutare la loro specificità antigenica mediante analisi di citometria a flusso del loro peptide. MHC: Legame con il tetramero La resa attesa delle cellule T specifiche dell'antigene dipenderà dal donatore, dall'antigene allo utilizzato e dalla corrispondente frequenza di cellule T reattive nel donatore.Ad esempio, un donatore sano medio avrà da 4.500.000 a 10 milioni di leucociti per millilitro di sangue, circa il 20% dei quali sono linfociti T. Questi grafici a punti illustrano i risultati della misurazione del legame delle cellule T da un donatore HLAD 4 negativo a uno specifico antigene allo. Ad esempio, in questo esperimento, è stata enumerata una frequenza di una su 4.776 cellule T specifiche per l'antigene da un numero iniziale di 20 milioni di leucociti di questa popolazione cellulare di partenza.È stato possibile isolare 88 singole cellule T marcate con temer, quindi, dopo due cicli di stimolazione e coltura con microsfere, due colture positive alla crescita sono state identificate mediante un esame microscopico e la loro specificità antigenica è stata valutata esaminando il loro legame con l'A 2 30 48 HLA DR. Quattro tetrameri. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare quotidianamente le colture cellulari per prevenire la morte cellulare e la crescita eccessiva delle colture. Seguendo questa procedura, i cloni delle cellule T possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come l'esame della biochimica del riconoscimento allogenico dei ligandi e il modo in cui ciò si traduce in risposte immunitarie efficaci.

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Immunologia e Infezioni

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L&#39;induzione di anergia Alloantigen specifici nelle cellule mononucleari del sangue periferico di stimolazione Alloantigen con co-stimolatorie blocco del segnale

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