Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare, isolare e clonare le cellule T umane con una specificità all'antigene definita. Ciò si ottiene isolando prima i linfociti T da tutto il sangue periferico mediante centrifugazione a gradiente di densità. Nella seconda fase, le cellule T specifiche dell'antigene sono marcate con tetrameri del peptide coniugato Fluor four, HLA, e arricchite mediante separazione magnetica.

Successivamente, le cellule T marcate vengono isolate mediante smistamento cellulare con citometria a flusso a cellula singola. Infine, le colture di singole cellule vengono stimolate con anticorpi anti CD tre e anti CD 25. In definitiva, l'allo-reattività delle cellule T antigene specifico può essere valutata mediante analisi citofluorimetrica.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre tecniche come la stimolazione di massa dei linfociti e la diluizione limitante è che questa tecnica consente la generazione di cloni di cellule T con reattività specifica agli antigeni ben definiti. In generale, gli individui che sono nuovi a questo metodo possono avere difficoltà nella coltura e nell'espansione dei cloni delle cellule T. Ciò richiede un attento monitoraggio quotidiano delle colture prima di iniziare la procedura.

Aliquotare quattro millilitri di gradiente di densità a temperatura ambiente in due o quattro provette da centrifuga coniche sterili da 15 millilitri utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'esterno di una o due provette di raccolta del sangue verdi riempite contenenti sangue da un volontario sano e quindi rimuovere con cura le parti superiori, decantare il sangue in una provetta da centrifuga sterile da 50 millilitri, e poi res ogni provetta di raccolta con 10 millilitri di PBS. Raggruppare i lavaggi con il sangue intero decantato e mescolare delicatamente una soluzione, quindi incubare le cellule con 25 microlitri di cocktail di arricchimento di cellule T umane per due millilitri di volume totale di sangue diluito. Dopo 20 minuti, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per sovrapporre delicatamente fino a 10 millilitri di sangue sopra il mezzo del gradiente di densità, facendo attenzione a non interrompere la superficie del gradiente.

Centrifugare le cellule per 10 minuti e quindi utilizzare una pipetta da cinque millilitri per trasferire con cura lo strato di leucociti dall'interfaccia del gradiente di densità e il plasma diluito in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Portare il volume dei linfociti del sangue periferico raccolti fino a 50 millilitri con PBS e mescolare delicatamente la sospensione cellulare. Quindi contare le cellule e rimuovere un'aliquota di un millilitro per l'analisi.

Successivamente, dopo aver centrifugato le cellule in profondità, sospendere i pellet in un millilitro di tampone per citometria a flusso e mescolare 50 microlitri del peptide MHC dell'antigene diluito nella sospensione cellulare. Trasferire le cellule in una provetta sterile da cinque millilitri, quindi dopo 30 minuti, lavare le cellule in due millilitri di una sorta di tampone di risus. Sospendere il palato in 100 microlitri di tampone, quindi incubare le cellule in 10 microlitri di cocktail di selezione di biotina per 15 minuti.

Successivamente, incubare le cellule in cinque microlitri di particelle magnetiche per 10 minuti, quindi mescolare delicatamente la sospensione cellulare con 2,5 millilitri di tampone di sorta. Rimuovere un'aliquota da 100 microlitri di analisi delle celle di arricchimento dei preen, quindi posizionare la provetta nel magnete di separazione cellulare. Dopo cinque minuti, tenere insieme il tubo e il magnete e travasare il contenuto in un tubo nuovo da cinque millilitri.

Quindi rimuovere la provetta dal magnete e lavare le cellule in due millilitri di tampone di selezione, risospendere il pellet in un tampone di selezione a freddo e aliquotare le cellule in due millilitri di tampone di selezione a freddo per tipo di campione. Dopo aver centrifugato nuovamente i campioni, sospendete nuovamente i pellet in 25 microlitri di tampone di smistamento a freddo e incubate le cellule in cinque microlitri di blocco FC umano su ghiaccio per 20 minuti. Quindi, incubare le provette con 20 microlitri del cocktail di anticorpi appropriato.

Dopo 20 minuti, lavare le celle in altri due millilitri di tampone di smistamento a freddo e risospendere i pellet a una risoluzione compresa tra uno e 2 milioni di cellule per millilitro. In più tampone, quindi aliquotare, 100 microlitri di terreno di coltura di cellule T umane in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a fondo rotondo da 96 pozzetti e conservare la piastra su ghiaccio fino al completamento della cernita. Dopo la cernita, centrifugare la piastra e quindi posizionare le celle a 37 gradi Celsius in un incubatore al 6% di CO2.

Quindi, mescolare il volume appropriato di perle attivatrici mediante vortex e trasferire il volume appropriato di perle in un tubo sterile da cinque millilitri. Dopo aver lavato le perle sul magnete, decantare la soluzione di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di coltura di cellule T umane, terreno per 0,5 microlitri di microsfere al tubo. Quindi aliquotare 100 microlitri della sospensione di perle attivatrici in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti e rimettere le cellule nell'incubatore.

Piccoli gruppi di cellule proliferanti possono essere osservati al microscopio dopo cinque-sette giorni di coltura, 14 giorni dopo l'isolamento cellulare. Sostituire con cura 100 microlitri di terreno dalla parte superiore delle colture con 100 microlitri di coltura di cellule T umane fresche. I cluster cellulari di medie dimensioni dovrebbero essere visibili al microscopio due o tre giorni dopo l'alimentazione macroscopicamente; i pellet cellulari dovrebbero diventare visibili durante i 14 giorni successivi al cambio del mezzo.

Dopo 28 giorni dall'isolamento cellulare, trasferire l'intero volume di 200 microlitri delle colture positive alla crescita in pozzetti individuali di una piastra di coltura tissutale a 48 pozzetti contenente 200 microlitri di terreno di coltura di cellule T umane. Quindi aggiungere 12,5 microlitri di microsfere stimolanti anti CD tre, anti CD 28 in 100 microlitri di terreno di coltura di cellule T umane e rimettere la piastra nell'incubatore da tre a cinque giorni dopo la restimolazione. Il terreno dovrebbe iniziare a diventare giallo paglierino.

A questo punto, trasferire le colture in pozzetti individuali di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti e aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura di cellule T umane a ciascuna coltura. Infine, a 10-14 giorni dalla restimolazione, raccogliere 200 microlitri di ciascuna coltura di cellule T per valutare la loro specificità antigenica mediante analisi di citometria a flusso del loro peptide. MHC: Legame con il tetramero La resa attesa delle cellule T specifiche dell'antigene dipenderà dal donatore, dall'antigene allo utilizzato e dalla corrispondente frequenza di cellule T reattive nel donatore.

Ad esempio, un donatore sano medio avrà da 4.500.000 a 10 milioni di leucociti per millilitro di sangue, circa il 20% dei quali sono linfociti T. Questi grafici a punti illustrano i risultati della misurazione del legame delle cellule T da un donatore HLAD 4 negativo a uno specifico antigene allo. Ad esempio, in questo esperimento, è stata enumerata una frequenza di una su 4.776 cellule T specifiche per l'antigene da un numero iniziale di 20 milioni di leucociti di questa popolazione cellulare di partenza.

È stato possibile isolare 88 singole cellule T marcate con temer, quindi, dopo due cicli di stimolazione e coltura con microsfere, due colture positive alla crescita sono state identificate mediante un esame microscopico e la loro specificità antigenica è stata valutata esaminando il loro legame con l'A 2 30 48 HLA DR. Quattro tetrameri. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di monitorare quotidianamente le colture cellulari per prevenire la morte cellulare e la crescita eccessiva delle colture. Seguendo questa procedura, i cloni delle cellule T possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come l'esame della biochimica del riconoscimento allogenico dei ligandi e il modo in cui ciò si traduce in risposte immunitarie efficaci.