La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays
3 gennaio 2015
I saggi delle sfere in vitro sono comunemente usati per identificare le cellule staminali tumorali. Qui confrontiamo saggi basati su sfere singole con più cellule. I saggi più laboriosi basati su singole cellule o l'integrazione di metilcellulosa forniscono risultati più accurati, mentre i saggi basati su più cellule eseguiti in mezzo liquido possono essere fortemente influenzati dalla densità cellulare.
L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le proprietà delle cellule staminali delle cellule di carcinoma ovarico umano utilizzando saggi basati su sfere multicellulari e singole. Ciò si ottiene selezionando prima le cellule SOX due reporter RFP lentivirus Trasdotte mediante trattamento con Pur Mycin nella seconda fase, le cellule RFP positive e RFP negative vengono isolate e piastrate dai fatti come colonie di cellule singole o multiple per pozzetto. Successivamente, la formazione della sfera primaria viene analizzata al microscopio e quindi le colture della sfera primaria vengono dissociate e riplaccate per l'analisi della formazione della sfera secondaria.
In definitiva, questi saggi a sfera vengono utilizzati per calcolare la percentuale di cellule staminali putative di cancro ovarico che mostrano capacità di formazione di sfere. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali tumorali, come ad esempio quali sono alcune potenziali popolazioni di cellule staminali tumorali e qual è la frequenza nell'intera sacca tumorale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'identificazione delle cellule staminali del cancro ovarico, può anche essere applicato per isolare le cellule staminali tumorali da altre entità tumorali solide come il carcinoma mammario.
24 ore dopo la trasduzione delle cellule di carcinoma ovarico umano con particelle lentivirali, rimuovere il surnatante virale e lavare le cellule in coltura di PBS. Le celle in terreno completo per 48 ore. Quindi cambiare il terreno e aggiungere 10 microgrammi per millilitro di piro micina dopo cinque giorni.
Trattare le colture con scudo uno a una diluizione da uno a 1000 il giorno successivo. Lavare le cellule in PBS e poi staccarle con 0,05% di tripsina EDTA. Dopo tre minuti, interrompere la reazione con il mezzo completo.
Contare le cellule e centrifugarle per cinque minuti a 300 volte G e temperatura ambiente. Risospendere accuratamente le cellule in 0,5-1 millilitro di PBS sterile, quindi filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro da 40 micrometri. Regolare le cellule a una diluizione da cinque volte 10 a sei cellule per millilitro, quindi aggiungere 100 microlitri di sfere di terreno a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a bassissimo attacco per un saggio a sfera a base di singola cellula.
Utilizzare la modalità cella singola per ordinare una cella in ciascun pozzetto della piastra. Quindi incidere al microscopio le celle per valutare l'efficienza della placcatura. Incubare le cellule in sfere fresche, medie a 37 gradi Celsius e 5% di CO2 con l'integrazione giornaliera di fattore di crescita basico dei fibroblasti e del fattore di crescita epidermico.
Dopo una settimana, determinare il numero di sfere tumorali emergenti mediante microscopia ottica e la presenza del segnale fluorescente dal sistema reporter integrato mediante microscopia fluorescente. Conta le sfere con un diametro superiore a 100 micrometri come sfere grandi e le sfere con un diametro da 50 a 100 micrometri come sfere piccole. Avendo cura di contare le sfere reali e non i cluster di cellule.
Quindi calcola la proporzione di sfere che formano celle RFP positive o RFP negative in base alla formula per il passaggio. Le sfere iniziano trasferendo il contenuto di ciascun pozzetto in singole provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Quindi sciacquare ogni pozzetto da tre a cinque volte con PBS per essere sicuro di raccogliere tutte le sfere e centrifugare le celle per 10 minuti a 300 volte G e temperatura ambiente.
Dopo la centrifugazione, rimuovere il ceppo e sospendere nuovamente i pellet in 200 microlitri di tripsin 0,05% in EDTA a 37 gradi Celsius in uno shaker morbido per cinque minuti. Se dopo cinque minuti non sono visibili sfere di grandi dimensioni, tritrare delicatamente la soluzione cellulare con un puntale per pipetta da 100 microlitri e aggiungere 500 microlitri di terreno completo per inattivare la tripsina. Le celle di spin-down riprospendono accuratamente i pellet in sfere e drenano la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro da 40 micrometri come appena nominato.
Infine, per la riplaccatura in serie delle singole cellule, seminare singole cellule da una sfera primaria in 100 microlitri di sfere, terreno per pozzetto in una nuova piastra da 96 pozzetti con attacco ultra basso. Quindi utilizzare la stessa formula del saggio delle sfere primarie per valutare la proporzione di cellule che formano sfere nelle sfere secondarie. Saggi in sfere basate su più cellule: quasi il 40% delle cellule di carcinoma ovarico umano positivo per RFP, rispetto a solo il 20% delle cellule RFP negative, ha dato origine a una singola sfera tumorale nel test delle sfere primarie.
Sorprendentemente, un numero maggiore di sfere viene contato da un numero inferiore di cellule piatte sia in terreni basati su MGEM che su D-M-E-M-F 12, dimostrando che le modalità di placcatura hanno fortemente influenzato i risultati di questo test. Al contrario, quando le cellule vengono immobilizzate con l'aggiunta dell'1% di metilcellulosa, l'efficienza della formazione delle sfere è per lo più indipendente dalla densità cellulare nelle colture di sfere multicellulari. Circa il 35% delle cellule delle sfere positive RFP perde il segnale fluorescente rosso dopo sette giorni di coltura, suggerendo che queste cellule sono state sottoposte a differenziazione mentre oltre il 65% delle cellule conserva un segnale RFP che suggerisce una capacità di auto-rinnovamento.
Al contrario, le cellule provenienti da sfere generate da cellule inizialmente RFP negative rimangono RFP negative, indicando che non possono ristabilire il potenziale delle cellule staminali in queste condizioni. La microscopia a fluorescenza eseguita su sfere generate da singole cellule conferma questi dati, dimostrando che le singole sfere derivate da cellule RFP positive contengono sia cellule RFP positive che RFP negative. Mentre le sfere derivate da cellule RFP negative mantengono la loro mancanza di segnale rosso Seguendo questa procedura.
Altri metodi come gli anticorpi, la colorazione o l'analisi dell'espressione genica tramite quantit PCR possono essere eseguiti per caratterizzare ulteriormente le cellule con una grave capacità di formazione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che è necessario eseguire saggi di trapianto in vivo in topi immunosoppressi per convalidare le proprietà delle cellule staminali tumorali delle cellule che iniziano la sfera.
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Panoramica
Questo studio valuta le proprietà delle cellule staminali di cellule del carcinoma ovarico umano utilizzando saggi di formazione di sfere basati su singola cellula e su più cellule. I risultati indicano che i saggi basati su singola cellula forniscono risultati più accurati rispetto ai saggi basati su più cellule, che possono essere influenzati dalla densità cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Cellule Staminali del Cancro
- Carcinoma Ovarico
- Tecniche di Coltura Cellulare
Sfondo
- I saggi di sfera in vitro sono essenziali per l'identificazione delle cellule staminali tumorali.
- I saggi basati su singole cellule sono più laboriosi ma offrono una maggiore accuratezza.
- I saggi basati su più cellule possono essere influenzati dalla densità delle cellule in coltura.
- Questa ricerca può essere estesa ad altri tumori solidi, come il carcinoma della mammella.
Scopo dello studio
- Valutare le caratteristiche delle cellule staminali nelle cellule del carcinoma ovarico.
- Confrontare l'efficacia dei saggi di formazione di sfere basati su singole cellule rispetto a quelli basati su più cellule.
- Identificare popolazioni potenziali di cellule staminali tumorali all'interno dei tumori.
Metodi Utilizzati
- Selezione di cellule transdotte con lentivirus reporter di SOX2-RFP.
- Isolamento di cellule positive e negative per RFP per la semina.
- Analisi microscopica della formazione di sfere primarie.
- Dissociazione e riseminamento delle colture di sfere primarie per analisi secondarie.
Risultati principali
- I saggi basati su singole cellule hanno fornito risultati più affidabili.
- I saggi basati su più cellule hanno mostrato variabilità in base alla densità cellulare.
- È stata identificata la proporzione di cellule staminali del carcinoma ovarico con capacità di formare sfere.
- La metodologia è applicabile ad altri tipi di cancro.
Conclusioni
- Si raccomandano saggi basati su singole cellule per un'identificazione accurata delle cellule staminali tumorali.
- I saggi multicellulari possono essere utili, ma richiedono un'attenta considerazione della densità cellulare.
- Questo approccio può migliorare la comprensione della dinamica delle cellule staminali tumorali nei tumori.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'identificazione accurata delle popolazioni di cellule staminali tumorali è fondamentale per ridurre i rischi nella validazione degli obiettivi oncologici e migliorare l'affidabilità predittiva nei modelli preclinici. I saggi di formazione di sfere basati su singole cellule forniscono un'analisi funzionale più affidabile della staminalità, minimizzando gli artefatti derivanti dalla densità cellulare e dall'aggregazione, e supportano un'analisi meccanicistica nelle fasi iniziali della scoperta. Questo approccio consente ai team biofarmaceutici di prioritizzare bersagli con una validazione biologica più solida e di ridurre l'abbandono nelle fasi avanzate dovuto a una comprensione incompleta del bersaglio.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando e valutando la capacità di formazione di sfere in sottopopolazioni di cellule staminali tumorali presunte.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale degli obiettivi mediante la misurazione quantitativa dell'efficienza di formazione delle sfere in cellule RFP-positive rispetto a cellule RFP-negative.
- Valore predittivo: Aumenta la fiducia nella selezione degli obiettivi distinguendo le vere cellule con caratteristiche staminali dalle loro progenie differenziate, sulla base di marcatori di autorinnovamento e differenziamento.
Sviluppo di screening e saggi
- Prontezza del saggio: La piastratura di singole cellule in un mezzo per sferoidi a adesione ultra-bassa consente una quantificazione standardizzata e riproducibile delle unità formanti sferoidi.
- Output quantitativo: Permette la valutazione della formazione di sferoidi primari e secondari per analizzare la capacità di autorenovamento attraverso passaggi seriali.
- Considerazione sulla scalabilità: L'integrazione di metilcellulosa nei saggi multicellulari riduce gli artefatti meccanici e la variabilità dipendente dalla densità, migliorando la robustezza del saggio per applicazioni di screening.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: I saggi delle sferoidi collegano la scoperta alla validazione preclinica fornendo un corrispettivo funzionale della frequenza delle cellule iniziatrici del tumore.
- Allineamento del Biomarcatore: La persistenza del segnale RFP nelle sferoidi derivate da cellule positive al reporter SOX2 sostiene l'uso dei reporter fluorescenti come biomarcatori traslazionali della stemness.
- Avanzamento Basato sul Rischio: La formazione differenziale di sferoidi tra popolazioni RFP-positive e RFP-negative consente la stratificazione di sottogruppi cellulari per studi meccanicistici o terapeutici successivi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione di un composto promettente, in cui saggi funzionali sulle cellule staminali forniscono informazioni sulla fiducia nel bersaglio e orientano lo screening di composti in sistemi pertinenti alla malattia.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi sui marcatori delle cellule staminali e sull'attività delle vie di segnalazione collegando l'espressione di SOX2-RFP alla formazione funzionale di sfere.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi tramite piastramento di singole cellule o condizioni multicellulari con aggiunta di metilcellulosa, garantendo una quantificazione riproducibile delle sfere.
- Analisi: Produce letture quantitative come la frequenza di formazione delle sfere e la capacità di ripiastreggio secondario, supportando l'analisi comparativa tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Favorisce la continuità preclinica identificando cellule con capacità di auto-rinnovamento che potrebbero correlare con l'insorgenza tumorale in vivo.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma funzionale riutilizzabile applicabile a diversi modelli di tumori solidi per l'arricchimento e la validazione delle cellule staminali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nell'identificazione delle cellule staminali tumorali fornendo un'analisi funzionale diretta delle proprietà di staminalità.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità grazie a condizioni di semina standardizzate e all'eventuale utilizzo di metilcellulosa per ridurre gli artefatti dipendenti dalla densità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di proseguimento o interruzione del progetto aumentando la fiducia nella biologia del bersaglio e riducendo il rischio di perseguire popolazioni cellulari non staminali.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei bersagli in base alla frequenza validata delle cellule staminali tumorali e alla loro capacità di autorenovazione, adeguandola al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel sorting cellulare, nelle tecniche di coltura sterile di sfere e nella microscopia a fluorescenza per il tracciamento del reporter.
- Presuppone l'accesso alla citometria a flusso o al FACS per l'isolamento di singole cellule e a infrastrutture per la trasduzione lentivirale.
- Necessita di un'ottimizzazione della densità di semina e della formulazione del mezzo, inclusa la supplementazione con fattori di crescita (bFGF, EGF).
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende ad altri tipi di tumore o sistemi reporter oltre il SOX2-RFP.
- È limitato dalla necessità di ripiantaggio seriale e di colture a lungo termine per valutare l'autorinnovamento, con conseguente aumento dei tempi e delle risorse richieste.
