Name: La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara a valutare le proprietà delle cellule staminali nel carcinoma ovarico umano con saggi di sferoidi a cellula singola e multipla. Questo metodo identifica popolazioni di cellule staminali tumorali con maggiore accuratezza.

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Questo studio è stato supportato da una sovvenzione della Baden-Württemberg Stiftung (Adult Stem Cells Program II) assegnata a C.L. Ringraziamo la Dott.ssa Martina Konantz per il contributo critico e la revisione del manoscritto. Ringraziamo Emmanuel Traunecker e Toni Krebs del DBM FACS Facility (Ospedale universitario di Basilea) per l'assistenza nello smistamento FACS.

1. Generazione di Ovcar-3 umane cellule di carcinoma ovarico stabilmente trasdotte con lentivirus contenente il Reporter Construct SOX2 Regione Regulatory <ol><li> Generare particelle lentivirali trasfettando la linea cellulare 293T-imballaggi HEK con un costrutto giornalista riconoscere una regione regolatoria SOX2 come descritto 10,21. NOTA: Il giornalista costruire inoltre contiene un dominio destabilizzazione del sistema Shield ProteoTuner avanti della proteina tdTomato fluorescenza. Shield1 lega al dominio destabilizzazione impedendo così il proteasoma a degradare la proteina fluorescente 22. </li><li> Trasdurre OVCAR-3 celle con particelle lentivirali per un periodo di tempo di 24 ore. Successivamente, rimuovere il surnatante virale e lavare le cellule con tampone fosfato salino (PBS) e coltivate in mezzo completo (RPMI supplementato con 10% FBS, 100 U / ml di penicillina, 100 mg / ml di streptomicina). </li><li> 48 ore più tardi, 10 ug / ml puroMycin sono stati aggiunti alle culture e mantenuto per 5 giorni per consentire la selezione di cellule trasdotte correttamente. </li></ol> 2. Preparazione di cellule Ordinamento e placcatura <ol><li> Aggiungi Shield1 a 1: 1.000 diluizione 24 ore prima della separazione delle cellule. Utilizzare stabilmente trasdotte Ovcar-3 celle senza trattamento Shield1 come controlli negativi (Figura 1). Aspirare i media da pallone, lavare le cellule con PBS 1x e trypsinize cellule con 0,05% tripsina-EDTA per 3 min. </li><li> Smettere di tripsina utilizzando terreno completo (vedi sopra), contare il numero di cellule, le cellule centrifugare a 300 xg a RT (15 - 25 ° C) per 5 min. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere le cellule con cura in 0,5 - 1 ml di PBS sterile. </li><li> Utilizzare 40 micron filtro cap filtro cella per ottenere cella singola sospensione. </li><li> Regolare conta delle cellule a 5 milioni di cellule per ml. </li><li> Preparare basso attaccamento piastre ultra 96 ​​pozzetti con 100 microlitri sfere medio (MEGM completato con fattori di crescita, citochine, e supplementi,B-27, eparina di sodio; o DMEM / F12 addizionato con fattori di crescita, citochine e integratori, B-27, eparina di sodio, con o senza l&#39;aggiunta di 1% metilcellulosa, vedi anche tabella 1). Facoltativamente aggiungere antibiotici per il mezzo ad una concentrazione di 100 U / ml penicillina e 100 ug / ml di streptomicina per minimizzare il rischio di possibili contaminazioni. </li><li> Ordina RFP + e cellule RFP- in preparati piastre a 96 pozzetti dall&#39;alto, 1 cella per pozzetto (single cell-based sfere test) e di 100 cellule per bene (più saggio sfere a base di cellule), rispettivamente. Eseguire sorta su disponibile in commercio cell sorter (vedi Materiali) utilizzando la modalità singola cella, Sort installazione: 100 μ ugello, pressione della guaina 20 psi, e la resa maschera 0, maschera purezza 32, maschera di fase 16. </li><li> Valutare placcatura efficienza microscopicamente segnando pozzetti contenenti cellule (per il saggio basato su cellule singole) e contando il numero di cellule in singoli pozzetti (per il dosaggio più basato su cellule; Figura 2 </strong&gt;). </li><li> Incubare le cellule in condizioni standard in ambito di media (per la composizione vedi punto 2.6) a 37 ° C e 5% di CO 2. Supplemento giornaliero bFGF (20 ng / ml) e EGF (20 ng / ml). </li><li> Dopo una settimana, contare il numero di emergenti sfere tumorali utilizzando un microscopio standard 4X o 10X di ingrandimento e un microscopio a fluorescenza per rilevare il segnale di fluorescenza dal sistema reporter integrato. Contare sfere con un diametro superiore a 100 micron come &quot;grandi&quot; sfere e sfere di diametro 50 - 100 micron come &quot;piccole&quot; sfere (Figura 3). Essere sicuri che si contano sfere reali e non CELL cluster. NOTA: In saggi cellulari singola formazione sfera è più facile segnare microscopicamente dopo 10 (contro 7) giorni di coltura. </li><li> Calcolare la percentuale di cellule che formano sfera in RFP + e cellule rispettivamente RFP- in saggi cellulari singoli (una piastra a 96 pozzetti per ogni singolo esperimento) o più cellule-basfere sed saggi (uno anche per ogni singolo esperimento) presentato dalla Shaw et al. 16 NOTA: Percentuale di cellule che formano sfera (%) = (numero di sfere) / (numero di cellule seminate) x 100 </li></ol> 3. Passaging seriale di sfere <ol><li> Posizionare il contenuto di ciascun pozzetto in un idoneo tubo sterile e centrifugare a 300 xg per 10 min a RT. Per il multi-cellulari sfere saggi, raccogliere insieme le sfere di un bene. Lavare il ben 3 - 5 volte con PBS e centrifugare 2 min più. Per i singoli cellulari-sfere saggi, raccogliere le singole sfere. A causa del basso numero di cellule, utilizzare 1,5 ml tubi per centrifugazione e lavaggio passi. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 200 ml di 0,05% tripsina-EDTA. </li><li> Per realizzare la separazione cellulare ottimale, incubare la sospensione cellulare a 37 ° C per 5 minuti in un agitatore morbido. Ottimizzare tripsinizzazione tempo per la vostra linea cellulare a basso tasso di morte cellulare: se no grandesfere è visibile triturare delicatamente con un puntale 100 microlitri. In caso di grandi sfere sono ancora presenti, incubare con tripsina altri 3 minuti e poi procedere al passo triturazione. In caso di singolo saggi cellulari assicurarsi di ottimizzare i tempi per la resa ottimale delle cellule delle cellule viventi durante la fase di tripsinizzazione. </li><li> Per inattivare la tripsina, aggiungere 500 microlitri mezzo completo e centrifugare a 300 xg per 10 min, in caso di saggi cellulari singoli, centrifugare per altri 2 minuti. </li><li> Rimuovere accuratamente le cellule surnatante e risospendere in sfere di media. </li><li> Utilizzare un filtro tappo filtro cella 40 micron per ottenere una cella singola sospensione. </li><li> In caso di utilizzo RFP + e le cellule RFP- in saggi di multi-cellulari bassed, valutare la percentuale di cellule fluorescenti in ogni pozzetto dopo risospensione tramite citofluorimetro analisi. </li><li> Per i saggi replating serie di singole cellule, di semi 1 cella per bene in un nuovo minimo attaccamento piastra a 96 pozzetti ultra preparati come sopra. Da una sfera individuale, seminare circa 20 singoli pozzi. Per i saggi replating di multi-sfere primarie a base di cellule, le cellule di semi ottenuti da un pozzetto di sfere primarie in una nuova piastra a 96 pozzetti e contano i numeri cellulari giorno successivo al microscopio. </li><li> Valutare la proporzione di cellule che formano sfera in sfere secondarie test utilizzando la formula descritta al punto 2.11. </li></ol> Analisi 4. Risultato <ol><li> Analizzare i risultati di esperimenti condotti in triplicato indipendenti e utilizzare Test t su due lati per analizzare i valori normalmente distribuiti e altrimenti Mann-Whitney-test per l&#39;analisi statistica. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Sfere culture sono un metodo ampiamente utilizzato per saggiare il potenziale delle cellule staminali del cancro e arricchire per le cellule staminali, come in una vasta gamma di cellule tumorali umane 15,25,26. In queste condizioni di coltura, le cellule tumorali che non hanno la capacità di auto-rinnovamento sono tenuti a differenziare e infine sottoposti a morte cellulare. Anche se possono inizialmente formare gruppi di cellule o persino sfere tumorali soprattutto a dosaggi primarie, non sono in grado di s...

C'è una crescente evidenza che i carcinomi ovarici sono costituiti da miscele eterogenee di cellule e ospitano le cosiddette "cellule staminali tumorali" (CSC) responsabili dell'inizio, del mantenimento e della recidiva della malattia dopo le terapie citotossiche convenzionali1-3. Pertanto, lo sviluppo di strategie molecolari mirate alle CSC ovariche è un obiettivo importante e promette di migliorare la terapia delle pazienti con carcinoma ovarico.
Un prerequisito per la comprensione delle caratteristiche molecolari delle CSC è il loro isolamento affidabile dalle non-CSC. Tuttavia, l'identificazione delle CSC ovariche sembra impegnativa. Mentre l'espressione di CD133 e l'attività dell'aldeide deidrogenasi (ALDH)4,5 marcano le CSC ovariche, alcuni dati indicano che questi marcatori sono instabili6. Coerentemente, nel carcinoma ovarico, ad eccezione ad esempio nel carcinoma mammario7, l'espressione di ALDH1 si associa con esito favorevole8 e l'espressione della variante CD44 del marcatore delle cellule staminali proposto non ha valore prognostico9. Più recentemente, abbiamo dimostrato che l'espressione della proteina SOX2 delle cellule staminali embrionali conferisce staminalità alle cellule di carcinoma ovarico10 e che un'elevata espressione di SOX2 si associa a carcinomi ovarici e mammari clinicamente aggressivi11,12. Pertanto, in questo rapporto utilizziamo un costrutto reporter lentivirale contenente una proteina di fluorescenza rossa (RFP) la cui espressione è controllata da una regione regolatoria SOX2, come metodo per isolare le CSC ovariche putative.
Per definizione, le CSC possono sia auto-rinnovarsi che differenziarsi, dando origine a tutti i tipi di cellule tumorali. Le popolazioni putative di CSC devono essere analizzate in saggi funzionali eseguiti in vivo. Per ovvie ragioni, nelle cellule umane tali test funzionali sono limitati a saggi di xenotrapianto, che comprendono principalmente il trapianto di cellule tumorali umane in topi immunocompromessi10,13.
Un metodo alternativo in vitro è stato offerto da Brent Reynolds e Sam Weiss che per primi hanno riportato il cosiddetto saggio della neurosfera come un test surrogato che valuta il potenziale staminale nelle cellule neurali14. Dontu e colleghi hanno successivamente confermato l'uso di questo test per la valutazione del potenziale delle cellule staminali nelle cellule mammarie15,16. Qui, le cellule mammarie umane sono state piastrate in numero diverso in terreno privo di siero integrato con fattore di crescita epidermico (EGF), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF), B-27 ed eparina e coltivate in condizioni non aderenti per sette-dieci giorni prima che la formazione della sfera fosse valutata al microscopio. Seguendo questo protocollo con alcuni aggiustamenti nel numero di cellule, nel terreno di crescita e negli integratori, diversi gruppi hanno esplorato il potenziale delle cellule staminali in vitro di diversi tipi di cancro come i tumori del seno17, del cervello18, del pancreas19 e del colon20. Nel carcinoma ovarico, abbiamo recentemente riportato la fattibilità del test delle sfere e confrontato i suoi risultati con quelli raccolti in modelli murini di xenotrapianto in vivo 10. Abbiamo scoperto che la sovraespressione della proteina SOX2 delle cellule staminali aumenta sia la formazione di sfere in vitro che la tumorigenicità in vivo delle cellule di carcinoma ovarico umano10. Tuttavia, la frequenza delle cellule che iniziano la sfera era superiore alla frequenza delle cellule che iniziano il tumore misurata in vivo10, suggerendo che il test della sfera può portare a risultati falsi positivi per motivi tecnici o, in alternativa, il test in vivo può essere inefficiente e portare a risultati falsi negativi.
In questo rapporto, analizziamo in modo più dettagliato i saggi di sfere ovariche multicellulari, esaminiamo i diversi protocolli disponibili in letteratura e li confrontiamo con un saggio basato su una singola cellula. Dimostriamo che il saggio basato su singole cellule fornisce risultati più accurati e riproducibili rispetto ai saggi basati su più cellule, che possono essere fortemente influenzati dalla densità delle cellule piastre, a meno che la metilcellulosa non venga aggiunta alle colture per immobilizzare le cellule. Tuttavia, anche nei saggi basati su singole cellule, il potenziale di inizio della sfera in vitro è osservato con una frequenza più elevata rispetto al potenziale di inizio del tumore in vivo.

<table><tbody><tr><td>Piastra a basso attacco</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr><tr><td>MEGM</td><td>Lonza</td><td>CC-3151</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>Idrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Lonza</td><td>CC-4136</td><td>SingleQuots&trade; Kit</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>concentrazione finale: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>concentrazione finale: 20 ng/ml</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen/ Gibco</td><td>17504-044</td><td>concentrazione finale: 1X</td></tr><tr><td>Eparina-Natrium-25000 IE</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.02</td><td>diluizione 1:1.000</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s PBS (1X)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Shield1</td><td>Clontech</td><td></td><td>diluizione 632189 1:1.000</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (polvere)</td><td>Gibco</td><td>42400-010</td><td></td></tr><tr><td>Metilcellulosa</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina dicloridrato</td><td>Applichem</td><td>A2856</td><td></td></tr><tr><td>Cell selezionatore</td><td>BD</td><td></td><td>Aria III selezionatore cellulare Analizzatore</td></tr><tr><td>FACS</td><td>BD</td><td></td><td>Citometro a flusso Accuri c6</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td></td><td>IX50 Osiris</td></tr></tbody></table>

la valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano utilizzo multi e single cell-based spheres assays

Evaluation of Stem Cell Properties in Human Ovarian Carcinoma Cells Using Multi and Single Cell-based Spheres Assays

Anni di ricerca indicano che i tumori ovarici ospitano una miscela eterogenea di cellule, tra cui una sottopopolazione delle cosiddette "cellule staminali tumorali" (CSC) responsabili dell'inizio, del mantenimento e della recidiva del tumore dopo le chemioterapie convenzionali. L'identificazione delle CSC ovariche è quindi un obiettivo importante. Un metodo comunemente usato per valutare il potenziale delle CSC in vitro è il saggio delle sfere, in cui le cellule vengono piastrate in condizioni di coltura non aderenti in un terreno privo di siero integrato con fattori di crescita e la formazione di sfere viene valutata dopo pochi giorni. Qui, esaminiamo i protocolli attualmente disponibili per i saggi sulle sfere del carcinoma ovarico umano ed eseguiamo un'analisi fianco a fianco tra i saggi basati su più cellule comunemente usati e un sistema più accurato basato sulla placcatura a singola cellula. I nostri risultati indicano che sia i saggi basati su più cellule che quelli basati su sfere a singola cellula possono essere utilizzati per studiare la formazione di sfere in vitro. I saggi basati su singole cellule, più laboriosi e costosi, sono più adatti per la valutazione funzionale delle singole cellule e portano a risultati complessivamente più accurati, mentre i saggi basati su più cellule possono essere fortemente influenzati dalla densità delle cellule piastrate e richiedere esperimenti di titolazione iniziali. L'integrazione di metilcellulosa con saggi basati su più cellule può essere utilizzata efficacemente per ridurre gli artefatti meccanici.

In sfere convenzionali saggi, quasi il 40% delle RFP + OVCAR-3 celle contro il 20% delle cellule RFP- ha dato luogo a una sfera singolo tumore nel primario test sfere (Figura 4A). Inoltre, sfere formate da RFP + cellule erano di dimensioni maggiori di quelle formate da cellule RFP-. Quando placcato in saggi cellulari singoli, cellule RFP + anche formati più sfere di cellule RFP-, confermando i risultati di cui sopra. Tuttavia, c&#39;è stata una tendenza verso un minor numero...

I saggi delle sfere in vitro sono comunemente usati per identificare le cellule staminali tumorali. Qui confrontiamo saggi basati su sfere singole con più cellule. I saggi più laboriosi basati su singole cellule o l'integrazione di metilcellulosa forniscono risultati più accurati, mentre i saggi basati su più cellule eseguiti in mezzo liquido possono essere fortemente influenzati dalla densità cellulare.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

Years of research indicates that ovarian cancers harbor a heterogeneous mixture of cells including a subpopulation of so-called &#8220;cancer stem ...

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare le proprietà delle cellule staminali delle cellule di carcinoma ovarico umano utilizzando saggi basati su sfere multicellulari e singole. Ciò si ottiene selezionando prima le cellule SOX due reporter RFP lentivirus Trasdotte mediante trattamento con Pur Mycin nella seconda fase, le cellule RFP positive e RFP negative vengono isolate e piastrate dai fatti come colonie di cellule singole o multiple per pozzetto. Successivamente, la formazione della sfera primaria viene analizzata al microscopio e quindi le colture della sfera primaria vengono dissociate e riplaccate per l'analisi della formazione della sfera secondaria.In definitiva, questi saggi a sfera vengono utilizzati per calcolare la percentuale di cellule staminali putative di cancro ovarico che mostrano capacità di formazione di sfere. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali tumorali, come ad esempio quali sono alcune potenziali popolazioni di cellule staminali tumorali e qual è la frequenza nell'intera sacca tumorale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'identificazione delle cellule staminali del cancro ova

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Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.

Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

Descriviamo metodologie per la creazione...

Eterotipica tridimensionale<em&gt; In Vitro</emModellazione&gt; di stromale-epiteliali interazioni Durante iniziazione e la progressione del cancro ovarico

Ovarico invasione delle cellule di cancro nel rivestimento mesoteliali del peritoneo è un processo dinamico nel tempo. Utilizzando un analizzatore in tempo reale, la capacità invasiva delle cellule tumorali ovariche in una cella modello di co-coltura sferoide-mesoteliali può essere quantificato in periodi di tempo prolungati, fornendo approfondimenti fattori che regolano il processo metastatico.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono implicati nel tumore recidiva a causa di chemioresistenza. Abbiamo ottimizzato un protocollo per la selezione ed espansione di cellule staminali tumorali da linee cellulari di carcinoma ovarico. Trattando le cellule con il cisplatino chemioterapico e coltura in una cellula staminale promuovere media che arricchiscono per le culture CSC non aderenti.

Arricchimento per chemioresistente Ovarian Cancer Stem Cells da linee cellulari umane

I test di mammosfera fluttuante possono studiare il sottogruppo di cellule di cancro al seno staminali che sopravvivono in condizioni di sospensione e mostrano una tumorigenesi migliorata quando impiantate nei topi.  Questo protocollo fornisce una comoda misura in vitro della capacità di formare sfere, un proxy per la tumorigenesi in vivo, facilitando al contempo l'analisi del panorama trascrizionale associato allo stelo.

Mammosphere saggio Formazione di Human Breast Cancer tessuti e linee cellulari

Le cellule staminali del cancro del pancreas (CSC) possono essere espanse in vitro utilizzando la tecnica di coltura della sfera indipendente dall'ancoraggio, che rappresenta un potente strumento per studiare la biologia delle CSC e può servire come primo passo per sviluppare nuove terapie mirate alle CSC. Qui viene fornita la metodologia per l'espansione, l'analisi e il targeting delle CSC pancreatiche.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

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Istituzione di Cancer Stem colture cellulari da umana convenzionale osteosarcoma

Questo protocollo descrive la generazione di sferoidi derivati dal paziente e l'analisi a valle, tra cui la quantificazione della proliferazione, il test di citotossicità, la citometria di flusso, la colorazione dell'immunofluorescenza e l'imaging confocale, al fine di valutare il farmaco potenziale dei candidati come terapie anti-neoplastiche. Questo protocollo supporta la medicina di precisione con l'identificazione di farmaci specifici per ogni paziente e lo stadio della malattia.

Paziente fisiologico Derivato da spheroid 3D per lo screening farmacologico anti-neoplastico per colpire le cellule staminali tumorali

Lo scopo di questa metodologia è quello di identificare le cellule staminali tumorali (CSC) nelle linee cellulari del cancro e nei campioni tumorali umani primari con il protocollo di formazione della sfera, in modo robusto, utilizzando saggi funzionali e caratterizzazione fenotipica con citometria di flusso e occidentale Macchia.

Ottenere le sfere delle cellule staminali tumorali da tumori ginecologici e tumori del cancro

Le cellule staminali del cancro ovarico (OCSC) sono responsabili dell'inizio del cancro, della recidiva, della resistenza terapeutica e delle metastasi. Si ritiene che la nicchia vascolare OCSC promuova l'autorinnovamento degli OCSC, portando alla chemioresistenza. Questo protocollo fornisce la base per stabilire un modello di nicchia vascolare OCSC riproducibile in vitro.

Valutazione delle proprietà angiogenetiche delle cellule staminali del cancro ovarico utilizzando il sistema di co-coltura tridimensionale, NICO-1

Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l'appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.

Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

Impara a valutare le proprietà delle cellule staminali nel carcinoma ovarico umano con saggi di sferoidi a cellula singola e multipla. Questo metodo identifica popolazioni di cellule staminali tumorali con maggiore accuratezza.

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays (Video) | JoVE Journal

La valutazione delle proprietà sulle cellule staminali in cellule di carcinoma ovarico umano Utilizzo multi e single cell-based Spheres Assays

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