Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

L'obiettivo di questa procedura è quello di coltivare ed elettrooperare embrionale di topo, coclea exvivo. Al fine di studiare vari aspetti dello sviluppo cocleare, tra cui la differenziazione della morfogenesi e gli eventi di crescita, ciò si ottiene ottenendo prima la testa da un embrione embrionale di topo del 13° giorno. Successivamente, esporre le orecchie interne rimuovendo il cervello e isolarle dall'osso temporale in via di sviluppo staccandole dalla base del cranio.

Quindi rimuovere la cartilagine sovrastante e aprire il dotto cocleare per ottenere l'epitelio sensoriale del cocleare. Il passaggio finale consiste nella coltura della cocleare sezionata con o senza elettroporazione per un massimo di una settimana. In definitiva, gli impianti possono essere analizzati per l'imaging di cellule vive o per la colorazione immunologica fissa e analizzati mediante imaging confocale, La coltura dell'embrionale di topo.

Cochlear explan fornisce un eccellente sistema per studiare vari aspetti dell'organogenesi, come la proliferazione, la specificazione del solfato e la polarità nella coclea in via di sviluppo e il modo in cui questi eventi contribuiscono alla crescita e alla differenziazione. Quindi questa tecnica permette di eseguire manipolazioni farmacologiche e monitorare le funzioni geniche ex vivo. E così questa tecnica, accoppiata con il trasferimento genico tramite elettroporazione, potrebbe alterare l'espressione del gene di interesse e monitorare la sua funzione a livello di singola cellula.

Per iniziare questa procedura, posizionare una testa di embrione di topo E 13 in una capsula sterile contenente una soluzione di dissezione fredda. Sotto un microscopio da dissezione, immobilizzare la testa dell'embrione posizionando spilli minuziosi attorno alla regione dell'occhio. Quindi, utilizzando due paia di pinze sterili, rimuovere con cura la pelle e aprire il cranio sul lato dorsale lungo la linea mediana.

Successivamente, rimuovi il cervello dalla cavità cranica. Le orecchie interne situate all'interno delle ossa temporali possono essere identificate dal rivestimento del vaso sanguigno che le circonda. Quindi, seziona le orecchie interne dalle ossa temporali posizionando la pinza sotto il tessuto e isolando l'orecchio interno dalla base del cranio.

Successivamente, trasferire le orecchie interne sezionate in un nuovo piatto contenente una soluzione di dissezione fredda. Ora orienta l'orecchio interno in modo che il lato ventrale sia rivolto verso l'alto. Stabilizzare l'orecchio interno inserendo delicatamente l'estremità affilata degli spilli dei minuchini attraverso la parte vestibolare.

Usando una pinza ultra fine, taglia la cartilagine sovrastante praticando un'incisione vicino alla finestra ovale. Assicurarsi che la pinza non sia inserita troppo in profondità nella cartilagine poiché la cartilagine sovrastante a volte viene fusa con il dotto cocleare. Quindi rimuovere con cautela la cartilagine dalla cocleare.

Successivamente, esporre l'epitelio sensoriale posizionando la pinza alla base o all'apice del dotto cocleare ed estrarre delicatamente il tetto della cocleare. Come ultimo passaggio, rimuovere con cura il tessuto connettivo sottostante dall'epitelio sensoriale esposto in modo che la base dell'esplano cocleare sia piatta. Successivamente, isolare la cocleare sezionata dalla porzione vestibolare dell'orecchio interno.

Trasferire l'epitelio sensoriale cocleare sezionato nella matrice della membrana basale Pozzetto di coltura rivestito utilizzando una paletta sterile da 1,5 millimetri Se è necessaria un'ulteriore pulizia per rimuovere il tessuto in eccesso, questo può essere eseguito durante questa fase. Quindi orientare l'explan cocleare con la superficie luminale dell'epitelio rivolta verso l'alto. Aspirare la soluzione DMEM della matrice della membrana basale per appiattire accuratamente il tessuto e aggiungere delicatamente 150 microlitri di terreno di coltura fresco alla piastra.

Assicurarsi che ogni x explan a aderisca bene al vetrino coprioggetto rivestito e non galleggi nel terreno di coltura. Successivamente, trasferire delicatamente il cocleare micro sezionato in una piastra di coltura sterile da 150 millimetri e posizionarlo in un incubatore per colture tissutali. A 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per tre a sei DIV.

Dopo 1D IV.Esaminare la coltura al microscopio da dissezione per assicurarsi che l'esplano cocleare aderisca bene alla piastra di coltura. Quindi continuare a incubare la coltura in vivo per il periodo di tempo desiderato prima di elaborarla per l'immunoistochimica per l'elettroporazione. Per prima cosa, sterilizzare un piatto di vetro rivestito di sigaro da 100 millimetri mediante sterilizzazione in autoclave o immersione in etanolo al 70% per circa 20 minuti.

Quindi lasciarlo asciugare all'aria su un banco pulito prima dell'uso. Ora prepara il DNA da un vettore di espressione a scelta utilizzando un kit di preparazione maxi o MIDI appropriato. I vettori di espressione utilizzati in questo protocollo sono un costrutto di espressione H one e un costrutto di espressione neuro D.

E la concentrazione finale di DNA dovrebbe essere di almeno un microgrammo per microlitro in RNA di DNA sterili in acqua libera per operare elettro il DNA nella spiegazione cocleare enica. Aggiungere 10 microlitri di soluzione di DNA al plasma in un piatto fresco ricoperto di sigaro da 100 millimetri. Quindi trasferire un explan cocleare completamente sezionato nella soluzione di DNA con la superficie luminale dell'epitelio rivolta verso l'alto.

Inclinare leggermente il cocleare in modo che sia perpendicolare al piano del piatto. Quindi posizionare la paletta dell'elettrodo negativo verso l'epitelio sensoriale e la paletta dell'elettrodo positivo vicino alla base del cocleare utilizzando l'elettrolatore. Eroga da nove a 10 impulsi da 24 millivolt con una durata dell'impulso di 30 millisecondi.

Successivamente aggiungere 100 microlitri di terreno di coltura caldo al cocleare elettrolitico. Ripetere le procedure per tutta la coclea cocleare e per il DNA di tutti i geni di interesse prima di trasferire la coclea elettrolitica nel piatto rivestito di matrice a membrana basale per la placcatura. Quindi coltivare tutta la coclea elettrolitica in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per il periodo di tempo desiderato, che verrà quindi elaborato per l'immunocitochimica.

Queste immagini mostrano gli impianti cocleari embrionali del giorno 13 dai pub di topi di tipo selvaggio CD uno, che vengono elettroporati con un costrutto TH, EEG FP o neuro D uno EGFP Reporter. Sono stati immunomarcati con un marcatore specifico per le cellule ciliate, anti myo seven A o un marcatore neuronale due a uno in rosso. Le cellule elettroclassificate, che possono essere visualizzate dall'espressione di EGFP, sono visibili in tutta la cresta epiteliale maggiore, nella cresta epiteliale minore e nelle cellule epiteliali sensoriali.

Le cellule epiteliali cocleari neuro D one trasfettate dopo cinque DIV hanno acquisito il fenotipo neuronale con processi dendritici, la maggior parte dei quali erano positivi per due uno o un T oh H uno. Le cellule trasfettate erano positive per myo sette. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro ore per un litro di informazioni da otto a 10 pop.

Ciò consentirà un ampio tempo per la coltura di dissezione, l'elettroporazione e la placcatura dell'explan.