Name: Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Impara la tecnica IMIT per la somministrazione intratracheale non invasiva di batteri nei polmoni di topi. Questo metodo garantisce consegna accurata e riproducibile per studi sulle malattie respiratorie.

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Gli autori sono grati per il supporto da parte del Center for Predicative Medicine Animal Models (Carol Vanover, Ashley Biller e Jennifer Kraenzle) e della Microbiologia (Daniel Cramer e Julie Sotsky) Core Facilities. Questo lavoro è stato sostenuto dai finanziamenti del NIH (HHSN272201000033I a MBL e J.M.W.).

NOTA: Tutte le procedure qui descritte sono stati esaminati e approvati dalla University of Louisville Istituzionale Comitato Biosicurezza (protocollo # 13-056) e Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo # 13-064). 1. Preparazione del colorante <ol><li> Diluire 0,1% (w / v) Coomassie Brilliant Blue in PBS e sterilizzare filtro con un filtro a siringa da 0,45 micron. </li></ol> 2. Preparazione di Pseudomonas aeruginosa cultura <ol><li> 15 ore prima instillazione, inoculare 3 ml di brodocoltura con una singola colonia batterica. </li><li> Crescere la coltura 15 ore a 37 ° C su un agitatore (200 rpm). </li><li> Centrifuga 1 ml di coltura in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml 12.000 xg per 30 sec. </li><li> Rimuovere il mezzo e risospendere il pellet in 1 ml di PBS. </li><li> Diluire un&#39;aliquota del magazzino sospensione batterica 1:10 in PBS e misurare il diametro esterno 600 della sospensione batterica diluita per determinare lala concentrazione batterica. </li><li> Diluire la sospensione batterica magazzino in PBS alla concentrazione desiderata di inoculo batterico, utilizzando un volume di consegna di 50 microlitri per IMIT inoculazione. </li></ol> 3. IMIT instillazione <ol><li> Inserire un gruppo di topi in isoflurano camera di induzione di anestesia e anestetizzare con un 2 - miscela di isoflurano / ossigeno 3%. </li><li> All&#39;inizio iniziale di sedazione, collottola il mouse, tenendo premuto il mouse verticale, e somministrare 10 ml di una soluzione di lidocaina 2% mediante sonda gastrica dell&#39;ago alla parte posteriore della gola e consentire alla soluzione di scendere verso l&#39;epiglottide. Ritorna il mouse alla camera di anestesia. <ol><li> Lasciare almeno 5 minuti per consentire la lidocaina prendere pieno effetto come anestetico locale. </li></ol></li><li> Quando i topi hanno raggiunto il livello desiderato di sedazione (tasso di ~ 60 bpm respirazione), ridurre la isoflurano al 2% per mantenere la sedazione. </li><li> Precarico tintura o inoculo batterico in 250 ml a tenuta di gasprecisione siringa in forma con un lungo ago smussato 22 G. <ol><li> Prima elaborare 150 microlitri di aria, misurati mediante lo stantuffo della siringa teflon. Successivamente, elabora 50 ml di inoculo facendo avanzare lo stantuffo Teflon dal marchio 150 microlitri al segno 200 microlitri sul corpo siringa. NOTA: Quando il campione viene espulso in un mouse intubato, la sospensione 50 microlitri sarà trasportato primo, seguito da un cuscino d&#39;aria 150 microlitri che distribuirà l&#39;inoculo nel polmone. </li></ol></li><li> Rimuovere un mouse dalla camera di induzione e giaceva supino su una piattaforma intubazione. Fissare il mouse alla piattaforma agganciando i suoi incisivi con un O-ring attaccato al velcro strip, e fissare il velcro alla piattaforma. Sollevare il mouse per una pendenza di 45 °. </li><li> Usando un applicatore di cotone micro, ritrarre la lingua con un moto di rollio, con la mano dominante. </li><li> Con la mano non dominante, utilizzare una misura otoscopio operativo con una specula intubazione sia maintain la ritrattazione della lingua e visualizzare la glottide. </li><li> Con la mano dominante, utilizzare un filo guida filettato attraverso un catetere 20 G intubare il mouse, sedere il catetere ad una profondità da 10 mm nel trachea mouse (catetere è in forma di un manicotto in silicone con 10 mm di catetere esposta). Rimuovere l&#39;otoscopio / specula. </li><li> Verificare che il mouse è stato intubato correttamente, garantendo il catetere con la mano non dominante, mentre per breve tempo il collegamento di un Luer lunghezza collegata di 1/16 &quot;tubo trasparente contenente un colorante. NOTA: Il colorante viene rapidamente migrazione avanti e indietro in risposta alla respirazione. </li><li> Non procedere con i passi successivi, se la conferma di intubazione non è stata stabilita, a questo punto. Se l&#39;intubazione tentata non è riuscita, ripristinare il filo del catetere e la guida per un ulteriore tentativo a intubazione. NOTA: È sconsigliabile tentare più di due intubazioni di un topo in una sessione senza causare traumi al mouse. </li><li> Continuare afissare il catetere con la mano non dominante, mentre l&#39;inserimento della siringa di precisione / ago smussato contenente il cuscino di sospensione / aria liquida. </li><li> Erogare aria / liquido direttamente nei polmoni in un unico movimento fluido e rimuovere immediatamente l&#39;ago / catetere dal mouse. </li><li> Ritorna il mouse in una gabbia e permettere il recupero dall&#39;anestesia. </li></ol> 4. Caratterizzazione di IMT di consegna <ol><li> Dopo IMIT instillazione, eutanasia il mouse da CO 2 asfissia in un post-inoculazione momento opportuno. </li><li> Fissare il mouse eutanasia su una tavola di dissezione e godersi il torace e l&#39;addome con il 70% EtOH usando una bottiglia a zampillo. </li><li> Se la valutazione della distribuzione di un agente di imaging nel polmone, rimuovere i polmoni dal animale con tecnica sterile e visualizzare i polmoni come appropriato per l&#39;imaging. NOTA:. I polmoni possono essere preparate per ulteriori tecniche di colorazione istologiche mediante fissazione o crioconservazione del caso &lt;/ Li&gt; <li> Se la valutazione della carica batterica del tessuto polmonare infetto, togliere i polmoni dall&#39;animale con tecnica sterile. Luogo polmoni in una sterile, pre-pesate 1 sacchetto di campionamento oz. Pesare e registrare il peso del sacchetto di campionamento + polmoni. <ol><li> Aggiungere 1 ml di PBS sterile, 1x per ogni sacchetto di campionamento + tessuti. Richiudere sacchetto di campionamento. </li><li> Omogeneizzare i tessuti da dolce a rotazione un 25 ml pipetta sierologica nel sacchetto di campionamento + tessuto. </li><li> Generare diluizioni seriali del polmone omogenato in PBS sterile e piastra su piastra di agar (LB, o se del caso alla specie batteriche in fase di studio): <ol><li> Condurre una diluizione in serie di sei volte in un U-basso a 96 pozzetti da pipettatore multicanale allora piastra campioni in triplicato dal multicanale sulla piastra di agar. </li></ol></li><li> Incubare le piastre di agar per una notte a 37 ° C ed enumerare le unità formanti colonie il giorno successivo. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

IMIT instillazione offre miglioramenti chiave per modelli di malattie respiratorie già esistenti nella capacità di infondere riproducibile reagenti direttamente nei polmoni. Si tratta di un approccio veloce che si trova in posizione ideale per una squadra di due ricercatori, uno dei quali gestisce la logistica di anestesia e ingabbiamento, e l&#39;altro che esegue la tecnica IMIT. I grandi studi possono essere condotti utilizzando IMIT con un impegno medio di tempo di 2 - 3 minuti per mouse. Poiché l&#39;approccio fa uso di isoflurano come anestetico, topi recuperare rapidamente dall&#39;anestesia, riducendo il tempo di allevamento di animali controllo attraverso il recupero. L&#39;aspetto più tecnicamente impegnativo del metodo IMIT è il passo iniziale di intubazione topi. Gli individui che imparano a svolgere IMIT sono in grado di concentrarsi su questo primo passo di posizionamento del catetere e la garanzia che l&#39;intubazione è stato raggiunto attraverso la conferma visiva di movimento tintura. Il vantaggio di questo approccio è che il polmone-specific instillazione è garantita attraverso l&#39;uso della conferma di intubazione, che aumenta la fiducia sia del nuovo ricercatore nonché l&#39;esperto tentativo di intubazione un animale difficile. Gli elementi chiave per ottimizzare la probabilità di una intubazione di successo sono: i) il raggiungimento di un sedazione profonda per dare il tempo di lavoro sufficienti, ii) il corretto posizionamento del specula in bocca per permettere una buona visualizzazione della epiglottide, iii) l&#39;inserimento di una buona profondità del specula in modo che la linguetta rimane retratto durante tutta la procedura, e iv) utilizzo della piattaforma di ribaltamento per supportare mani del ricercatore in modo che la procedura è condotta rilassata e con un comportamento costante. Uno dei limiti della procedura IMIT è legato alla frequenza degli eventi IMIT instillazione. A causa del trauma potenziali associati con intubazione perso, non è consigliabile che più di due tentativi di intubazione essere condotti in una singola sessione (fino a due miss). IMITha un ottimo potenziale nella sua capacità di essere utilizzato per fornire terapie nel polmone murino, i regimi terapeutici ma che si avvalgono di consegna molto frequente di reagente nei polmoni non possono essere adatti per IMIT. Può essere possibile che IMIT potrebbe essere utilizzato quotidianamente per fornire reagenti in un polmone murino senza causare traumi significativi, ma solo se condotta da un ricercatore altamente qualificato, come la maggior parte dei traumi associati con intubazione è pensato per essere associato ad un evento intubazione perdere . Tale IMIT ad alta frequenza dovrebbe essere discusso con i veterinari locali e IACUC. Un potenziale limite ulteriore IMIT è la dimensione del mouse che viene intubato. La procedura IMIT sopra descritta è stata sviluppata usando topi di circa 17-22 g, dove è stato trovato un catetere 20 G per essere un formato adatto per la trachea di topi in questo intervallo di grandezza. Cateteri più grandi sono stati utilizzati con successo nei topi anziani; lo sviluppo iniziale di IMIT muso facciata di un catetere 18 G topi BALB / c che sono&gt; 20 g. È importante sottolineare che, se si utilizzano i formati alternativi cateteri, aghi smussati devono essere di provenienza che si adattano il lume del catetere e sono tagliati ad una lunghezza che si estende appena 1 millimetro al di là della punta del catetere. Intubazione di topi di dimensioni inferiori a 17 g può essere possibile, ma non è raccomandato a causa della esperienza richiesta, e richiederebbe l&#39;uso di cateteri più piccoli e specula che sono descritti in precedenza. Abbiamo usato IMIT per la consegna di diversi patogeni respiratori oltre a P. aeruginosa, compresi B. pseudomallei 9 e Klebsiella pneumoniae 10. Il modello IMIT ha conseguito notevoli progressi per i nostri studi di B. malattie respiratorie pseudomallei, dopo aver individuato che l&#39;inoculazione intranasale provoca un precoce, morbilità URT-correlata di topi piuttosto che l&#39;endpoint malattia sistemica osservata nella malattia umana 9. B. pseudomallei è un Tier 1 Selecagente t di impatto biodefense, e come si stanno sviluppando tali, modelli di malattie respiratorie per l&#39;esposizione di aerosol che modelli un biodefense correlato potenziale via di ingresso per patogeni come arma. Dato che i modelli attuali aerosol provocano l&#39;infezione sia della URT e LRT, gli stessi potenziali fenotipi presto morbilità abbiamo individuato per il modello intranasale di B. malattie respiratorie pseudomallei può applicare al modello di aerosol. Un futuro adattamento del modello IMIT potrebbe essere una consegna di aerosol intubazione-mediata (IMAD), in cui i topi sono intubato per la consegna porta aerosol solo nel polmone. Ventilatori meccanici sono attualmente disponibili per mantenere l&#39;anestesia isoflurano, che potrebbe essere adattato per fornire una, piuttosto che a base liquida, sfida patogeno aerosol. IMIT stato sviluppato inizialmente come un approccio per ottimizzare l&#39;erogazione dei batteri al polmone, ma ha anche un&#39;applicazione per la consegna di altri reagenti nel polmone del mouse. Come disdiscussi sopra, consegna intranasale di composti in topi determina una bassa efficienza, consegna altamente variabile dei reagenti nell&#39;organo bersaglio del polmone. Consegna intranasale di Positron Emission Tomography (PET) reagenti di imaging al polmone murino ha prodotto un rendimento di consegna del 40% 11, mentre abbiamo dimostrato che IMIT offre un&#39;ottima alternativa per l&#39;altra consegna del polmone si avvicina con il suo&gt; 98% di efficacia consegna e la distribuzione multilobare. Questo miglioramento somministrazione mirata al polmone ha il potenziale per aumentare la riproducibilità di consegna terapeutico per il trattamento della malattia polmonare. IMIT simile potrebbe offrire vantaggi agli studi di: i) l&#39;impatto delle sostanze irritanti polmonari ambientali, ii), del cancro del polmone studi fenotipici, iii) specifici siRNA-polmone knock-down.

I topi sono stati utilizzati per modellare numerose manifestazioni della malattia umana, compresa una miriade di malattie respiratorie. Modelli di malattia surrogate sono spesso in grado di ricapitolare tutti gli aspetti di una malattia modellato, in genere a causa di importanti fisiologica o differenze immunitarie nei due modelli di accoglienza. Pertanto, l&#39;obiettivo di migliorare i sistemi di modello è quello di sviluppare approcci che consentono surrogati a specchio più da vicino un processo patologico o ospitano risposta come osservato nel sistema host originale. Ci sono parecchie differenze fisiologiche fondamentali tra i topi e gli esseri umani nel meccanismo con cui si ispirano l&#39;aria. Inclusi in queste differenze sono significative differenze raziometriche di dimensioni tra vie aeree superiori e LRT. È stato stimato che i topi possiedono&gt; 100 volte la superficie URT rispetto agli esseri umani, normalizzati contro totale 1,2 capacità polmonare. Così, turbinati nasali del mouse consentono più ampio filtraggio dell&#39;aria inspirata per facilitare una maggiore velocità di breathing, che può avere un impatto significativo sugli studi di polmonite se l&#39;infezione della cavità nasale svolge un ruolo significativo nella progressione della malattia. Diversi approcci sono stati impiegati per infondere batteri nei polmoni di topi per studiare le malattie respiratorie simile a quella umana. Il più comune di questi approcci è inoculazione intranasale, in cui una sospensione liquida viene applicato in una o entrambe le narici di un mouse. Mentre relativamente semplice, avvertimenti come volume instillazione e tipo di anestesia utilizzati possono influenzare l&#39;efficienza della instillazione nel LRT via intranasale inoculazione 3-5. In particolare, Miller et al. hanno dimostrato che l&#39;instillazione intranasale di Francisella tularensis in volumi meno di 50 ml non hanno comportato l&#39;instillazione dei batteri nel LRT 6. Essi hanno inoltre osservato meglio LRT instillazione quando si usa isoflurano per via inalatoria rispetto a iniettato ketamina / xylazina per l&#39;anestesia. Tuttavia, la nostra esperienze con Yersinia pestis inoculazione intranasale indica inoculazione più coerente può essere raggiunto utilizzando ketamina / xylazina rispetto a isoflurano (MBL, dati non pubblicati). Queste differenze potrebbero essere attribuite a patogeno usata o variabilità nella procedure di laboratorio, ma soprattutto evidenziare il potenziale di variabilità in questa tecnica. Inoltre, polmoni raccolte poco dopo instillazione intranasale mostrano che una percentuale relativamente bassa dell&#39;inoculo batterico iniziale raggiunge il polmone (nel caso di Y. pestis, solo il 10% sono stati recuperati 1 ora dopo l&#39;instillazione 7), suggerendo che un gran numero di batteri potrebbe essere mantenuta nel URT (o ingerito nel tratto GI). In alcuni modelli di malattia, questo significativo deposito di batteri sulla mucosa URT può confondere la nostra comprensione della progressione della malattia se l&#39;organismo è in grado di colonizzare la cavità nasale murino in modo incompatibile con la malattia umana. Per esempio, usando in vivo &lt;/ Em&gt; di imaging, è stato osservato che Burkholderia pseudomallei, che non colonizzano l&#39;URT umana, provoca un&#39;infezione opportunistica schiacciante della cavità nasale murino al momento della consegna con il metodo instillazione intranasale 8. Altri metodi per instillare i batteri nei polmoni di topi sono stati impiegati nella ricerca sulle malattie infettive. Tuttavia, rispetto al instillazione intranasale questi metodi tendono a richiedere maggiore competenza tecnica e / o costose attrezzature senza eliminare il rischio di infezione da iniziazione in più siti (ad esempio, aerosol [URT e LRT]; transoral [tubo digerente e LRT], e intratracheale chirurgica [LRT e sangue]). Date le complicazioni potenziali che potrebbero essere associati con i siti secondari di infezione, abbiamo cercato di sviluppare un approccio endotracheale che bypassa vie aeree superiori e fornisce patogeno direttamente nei polmoni di topi anestetizzati, ma limita anche inoculat accidentaleione nel flusso sanguigno o del tratto gastrointestinale. A tal fine, l&#39;intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione è stato sviluppato come una procedura non chirurgica che garantisce LRT instillazione di inoculo, includendo una fase intermedia per verificare il corretto posizionamento del catetere prima della instillazione. Questo metodo viene descritto usando colorante instillazione di dimostrare visivamente ampia distribuzione dell&#39;inoculo nel polmone, e P. aeruginosa instillazione per dimostrare la consegna altamente efficace (&gt; 98% dell&#39;inoculo) di questo metodo per il polmone. È importante sottolineare che, mentre originariamente sviluppato per la consegna batterica, IMIT offre anche un efficace strumento per: i) instillazione di varie molecole per lo studio di altri modelli di malattie respiratorie, ii) la consegna terapeutiche particolari-polmone, e iii) studi di funzionalità polmonare di base, tra cui mirate consegna di siRNA al polmone.

<table><tbody><tr><td>Roditore, Cavalletto da lavoro</td><td>inclinabile Hallowell EMC</td><td>000A3467</td><td>La base deve essere staccata quando si lavora in un BSC</td></tr><tr><td>Otoscopio operativo Testa</td><td>Welch Allyn</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>Otoscopio 3,5 V Li Batteria</td><td>Welch Allyn</td><td>71900</td><td></td></tr><tr><td>Intubazione del topo Speculum corto, Autoclavabile</td><td>Hallowell EMC</td><td>200A3589S</td><td></td></tr><tr><td>Anse incisive</td><td>Hallowell EMC</td><td>210A3490A</td><td></td></tr><tr><td>Applicatore a punta fine in cotone</td><td>Puritan</td><td>871-PC DBL&nbsp;</td><td>Utilizzato per la retrazione della lingua</td></tr><tr><td>Catetere per flebo, 20 G</td><td>Exel Int</td><td>26741</td><td>Opzionale: montare un manicotto in silicone con superficie del catetere esposta da 10 mm</td></tr><tr><td>Siringa a tenuta di gas, 250 ul</td><td>Hamilton</td><td>81120</td><td>Utilizzato per l'erogazione di inoculo liquido mediante</td></tr><tr><td>ago smussato IMIT, 22 G</td><td>Hamilton</td><td>91022</td><td>Taglio a misura per sporgere di 1 mm dal catetere da 20 G</td></tr><tr><td>Filo guida (filo in fibra ottica, 0,5 mm)</td><td>TheFiberOpticStore.com</td><td>FOF .50</td><td>Taglio a 6 "di lunghezza: utilizzato come filo guida per l'intubazione</td></tr><tr><td>Siringa Tuberculin, 1 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>Assemblare con filo in fibra ottica come filo guida</td></tr><tr><td>Brilliant Blue R (Coomassie)</td> <td>Sigma</td><td>B0149</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubo, 1/16"</td> <td>Saint Gobain</td><td>ALC00002&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Luer maschio 1/16" barb</td><td>Cole Parmer</td><td>45503-22</td><td></td></tr><tr><td>Luer femmina 1/16" barb</td><td>Cole Parmer</td><td>45500-00</td><td></td></tr><tr><td>Lidocaina, USP</td><td>Spectrum</td><td>LI102</td><td>pH lidocaina in soluzione al 2% (p/v) pH7.0</td></tr><tr><td>Sacchetto per campioni, 1 oz</td><td>Whirl-Pak</td><td>B01067</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con fondo a U,</td><td></td><td>Greiner sterile 650161</td><td></td></tr></tbody></table>

intubazione-mediata intratracheale (imit) instillazione: a non invasiva, lung-specifico sistema di rilascio

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Studi sulle malattie respiratorie in genere comportano l&#39;uso di modelli murini come sistemi sostitutivi. Tuttavia, ci sono notevoli differenze fisiologiche tra il topo e respiratorio umano, in particolare nelle loro vie respiratorie superiori (URT). In alcuni modelli, queste differenze nella cavità nasale murino possono avere un impatto significativo sulla progressione della malattia e la presentazione nel tratto respiratorio inferiore (LRT) quando si utilizzano tecniche di instillazione intranasale, potenzialmente limita l&#39;utilità del modello di topo per studiare queste malattie. Per questi motivi, sarebbe vantaggioso sviluppare una tecnica di instillare batteri direttamente nei polmoni topo per studiare la malattia LRT in assenza di coinvolgimento delle vie aeree superiori. Abbiamo chiamato questa specifica tecnica di fornitura intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione del polmone. Questa tecnica non invasiva minimizza il potenziale per instillazione nel sangue, che può verificarsi durante tradizio più invasiveapprocci chirurgici onal intratracheali infezione, e limita la possibilità di consegna tratto digestivo incidentale. IMIT è un processo in due fasi in cui i topi vengono prima intubati, con una fase intermedia di garantire il posizionamento del catetere corretta nella trachea, seguiti da inserimento di un ago smussato nel catetere di mediare consegna diretta dei batteri nei polmoni. Questo approccio permette un&#39;efficacia&gt; 98% della fornitura nei polmoni un&#39;eccellente distribuzione del reagente nel polmone. Così, IMIT rappresenta un nuovo approccio per studiare le malattie LRT e spedizione terapeutica direttamente nel polmone, migliorando sulla capacità di utilizzare topi come surrogati per studiare malattie respiratorie umane. Inoltre, la precisione e la riproducibilità del sistema di erogazione rende anche suscettibili di buona prassi di laboratorio (GLP), così come la consegna di una vasta gamma di reagenti che richiedono elevata efficienza di consegna al polmone.

Per visualizzare la distribuzione di materiale instillato attraverso il metodo IMIT, 50 ml di 0,1% Coomassie Brilliant Blue tintura è stato instillato nei polmoni di un topo anestetizzato. Il mouse è stato immediatamente eutanasia ei polmoni sono stati rimossi dalla necroscopia sterile. La figura 1 mostra che il colorante è stato consegnato a tutti i lobi del polmone. Per determinare la quantità di batteri consegnato ai polmoni tramite il metodo IMIT, tre gruppi di topi (n = 3) sono stati instillato con tre differenti concentrazioni di P. aeruginosa (1.21 x 10 8, 1.21x10 7, e 1,21 x 10 6 unità formanti colonie [CFU] per 50 microlitri). Subito dopo IMIT instillazione, i topi sono stati sacrificati, polmoni rimossi e numeri batteriche sono state enumerate e confrontate con i inoculums (Figura 2). Consegna dell&#39;inoculo è molto efficace tramite questo metodo, con&gt; 98% dell&#39;inoculo recuperato dai polmoni di instillatoanimali. Inoltre, IMIT instillazione era altamente riproducibile indipendentemente dalla concentrazione di inoculo (R 2 = 0,9951). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig1highres.jpg" /> Figura 1: IMIT instillazione distribuisce inoculo nel corso dei polmoni polmoni di topi instillato con 50 ml di 0,1% Coomassie Brilliant Blue spettacolo colorante blu distribuite in tutti i lobi.. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52261/52261fig2highres.jpg" /> Figura 2:. IMIT instillazione di batteri nei polmoni topi sono stati instillato con P. aeruginosa e il numero di batteri instillati nei polmoni (Log 10 CFU - recuperata) sono stati confrontati con l&#39;inoculo stimato (Log 10 CFU - distribuito). Ogni cerchio rappresenta la UFC / polmone di un mouse individuale (n = 3 per ogniDose batterica).

Intubazione endotracheale-mediata (IMIT) instillazione di reagenti è un eccellente metodo non invasivo per lo studio di malattie respiratorie, come pure un metodo per instillare reagenti terapeutici direttamente nel polmone. Si tratta di un metodo rapido e altamente riproducibile che è adatto per la prova preclinica.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire in modo non invasivo i batteri direttamente nei polmoni dei topi. Ciò si ottiene caricando prima un cuscino d'aria da 150 microlitri in una siringa a tenuta di gas, seguito da 50 microlitri della sospensione batterica preparata. Nella seconda fase, un topo anestetizzato viene intubato con un catetere calibro 20 utilizzando un filo guida per facilitare il posizionamento.Quindi, dopo aver confermato il successo dell'intubazione utilizzando un semplice flussometro, l'inoculo batterico viene erogato attraverso il catetere direttamente nel polmone con un ago smussato lungo 22 gauge. In definitiva, l'inoculazione intratracheale mediata dall'intubazione o l'inoculazione omessa possono essere utilizzate per studiare la malattia del tratto respiratorio inferiore nei topi, evitando il coinvolgimento concomitante del tratto respiratorio superiore. Il vantaggio principale di imit rispetto ai metodi di inoculazione interna è che questa tecnica consente una somministrazione accurata e riproducibile di un inoculo direttamente ai polmoni.Poiché l'IIT è una tecnica non chirurgica, riduce anche il potenziale di complicanze associate alle procedure chirurgiche intratracheali. Sebbene questo metodo possa fornire un meccanismo affidabile per veicolare batteri nel polmone per studiare la patogenesi, l'IMA può essere applicato anche alla somministrazione di altri reagenti, come i composti ambientali per studiare il danno polmonare, la somministrazione mirata di terapie per il trattamento e la somministrazione di sonde di imaging o SRNA per studiare la biologia polmonare di base. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la fase di intubazione poiché la fase richiede un posizionamento accurato dell'animale e l'endoscopio automatico per l'inserimento del filo guida.La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto il posizionamento iniziale del filo guida nella trachea è concettualmente difficile da descrivere ai nuovi ricercatori. 15 ore prima dell'installazione, inoculare tre millilitri di coltura in brodo con una singola colonia batterica e far crescere la coltura a 37 gradi Celsius e uno shaker a 200 giri/min. Dopo 15 ore, centrifugare un millilitro di cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e risospendere il palato in un millilitro di PBS.Quindi, misurare una diluizione da uno a 10 della sospensione madre batterica a un OD 600 per determinare la concentrazione batterica. Quindi diluire le cellule batteriche in PBS alla concentrazione desiderata di batteri per 50 microlitri di inoculo. Per l'installazione IIT, i topi vengono preparati per IIT somministrando una soluzione di lidocaina al 2% a un topo leggermente anestetizzato mediante topi con ago savale.Un ritorno all'anestesia mentre la lidocaina fa effetto. Ora aspirare 150 microlitri d'aria in una siringa a rescissione a gas da 250 microlitri, dotata di un ago smussato lungo 22 gauge. Quindi far avanzare lo stantuffo in teflon dal segno di 150 microlitri al segno di 200 microlitri sul corpo della siringa per aspirare 50 microlitri di inoculo batterico quando la siringa è caricata.LA, un topo sedato supino su una piattaforma di intubazione che fissa l'animale per gli incisivi su un anello senza anello attaccato a una striscia di velcro collegata alla piattaforma. Sollevare il mouse a un'inclinazione di 45 gradi e quindi utilizzare un applicatore di micro cotone per ritrarre la lingua con un movimento rotatorio con la mano dominante. Successivamente, con la mano non dominante, utilizzare un otoscopio operativo dotato di uno speculare per intubazione sia per mantenere la retrazione della lingua che per visualizzare l'epiglottide.Quindi, tenendo un filo guida infilato in un catetere calibro 20 nella mano dominante, intubare il topo a una profondità di 10 millimetri all'interno della trachea e rimuovere l'otoscopio. Fissare il catetere con la mano non dominante. Quindi collegare brevemente al catetere una lunghezza collegata all'esca di un tubo trasparente 16° contenente un colorante colorato.Il colorante dovrebbe migrare rapidamente avanti e indietro in risposta alla respirazione dell'animale quando l'animale è stato intubato con successo. Inserire l'ago smussato calibro 22 nel catetere ed erogare l'inoculo direttamente nel polmone con un unico movimento fluido. Quindi rimuovere immediatamente l'ago e il catetere dall'animale e riportare il topo nella sua gabbia con monitoraggio fino a quando l'animale non si è completamente ripreso dall'anestesia.Per valutare la carica batterica del tessuto polmonare infetto, rimuovere i polmoni utilizzando una tecnica sterile e posizionare il tessuto in una sacca sterile pre-pesata da un'oncia. Dopo aver pesato la sacca del campione e i polmoni, aggiungere un millilitro di PBS sterile al tessuto e rivendere la sacca del campione. Quindi arrotolare delicatamente una pipetta sierologica da 25 millilitri sulla sacca del campione per omogeneizzare il tessuto.Rimuovere il tessuto collegato attraverso un filtro sterile a parete in poliestere e trattare l'omogenato con tritton X 100 a una concentrazione finale dell'1% per liberare i batteri. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per eseguire una diluizione seriale di sei volte dell'omogenato in una piastra UBO a 96 pozzetti. Quindi utilizzare un multicanale a otto pozzetti per placcare l'omogeneizzato triplicato aliquote da 10 microlitri su una piastra di agar LBA.Infine, incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius ed enumerare le unità formanti la colonia il giorno successivo. La somministrazione dei batteri è altamente efficiente con questo metodo con oltre il 98% dell'inoculo di aerogeno di pseudomonas recuperato dai polmoni degli animali instillati in questo esperimento rappresentativo. Inoltre, l'installazione IIT è altamente riproducibile indipendentemente dalla concentrazione dell'inoculo somministrato.Per visualizzare la distribuzione del materiale instillato tramite il metodo IIT, 50 microlitri di colorante blu brillante Kumasi allo 0,1% possono essere erogati nei polmoni, come appena dimostrato per l'inoculo. Si noti che la distribuzione del colorante a tutti i lobi del polmone una volta padroneggiata. Questo metodo può essere eseguito rapidamente con un team di due ricercatori in un tempo medio di due o tre minuti, compresa l'anestesia, l'inoculazione IMA e il recupero dall'anestesia.Durante il tentativo di questa procedura, è importante non fare più di due tentativi falliti di intubare il topo. La mancata intubazione può causare potenziali traumi dovuti all'inserimento del catetere nell'esofago piuttosto che nella trachea. Molti agenti patogeni respiratori, compresi quelli che richiedono il contenimento dell'abs L tre, possono essere efficacemente somministrati dall'imed poiché questa procedura può essere eseguita, come dimostrato nelle cappe di sicurezza e in aggiunta dai ricercatori che indossano una protezione respiratoria completa, compresa una visiera.Abbiamo dimostrato che l'imit è un metodo molto accurato ed efficiente per la somministrazione di materiali direttamente nei polmoni dei topi. Queste proprietà rendono imit adatto per studi di tipo GLP che richiedono sistemi di modelli altamente riproducibili.

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Instillazioni intratracheale soluti consegnare direttamente nei polmoni. Questa procedura obiettivi la consegna del instillate nelle regioni distali del polmone, ed è quindi spesso incorporati in studi volti a studiare alveoli. Forniamo un protocollo dettagliato di sopravvivenza per l'esecuzione di instillazioni intratracheale nei topi.

Diretta instillazione tracheale di soluti in polmone mouse

Illustriamo non chirurgica consegna dei materiali di prova nei polmoni di topi anestetizzati attraverso la trachea. Questo metodo permette l'esposizione dei polmoni a patogeni batterici e virali, citochine, anticorpi, perline, prodotti chimici o coloranti. Approfondiremo la raccolta ed elaborazione dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante (LDLNs) per la citometria a flusso.

Non chirurgica instillazione di topi con analisi dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante mediante citometria di flusso

Questo video descrive un approccio intrabronchiale per somministrare selettivamente un agente sperimentale nel polmone destro e sinistro distale. Nel protocollo presentato, somministreremo bleomicina per via intrabronchiale in un topo per ottenere un modello migliore per la fibrosi polmonare.

Consegna intrabronchiale: una tecnica per somministrare selettivamente un agente sperimentale in un polmone di topo

L'uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell'uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

Questo articolo presenta un metodo rapido e semplice per l'amministrazione bleomicina direttamente nella trachea del mouse tramite intubazione. I principali vantaggi di questo metodo sono che è altamente riproducibile, facile da padroneggiare, e non richiede attrezzature specializzate o tempi di recupero lunghi.

Un metodo migliore per Rapid intubazione della trachea nei topi

La somministrazione intratracheale (IT) di agenti sperimentali nei topi spesso si traduce in consegna asimmetrica ai polmoni distali.  In questa relazione, descriviamo un approccio intrabronchiale diretto (IB) per cannulare ogni polmone in topi viventi non chirurgici.  Questo approccio può essere utilizzato per somministrare selettivamente gli agenti a un polmone o può essere adattato per migliorare la somministrazione simmetrica dell'agente a entrambi i polmoni.

Amministrazione intrabronchiale diretta per migliorare la deposizione selettiva dell'agente all'interno del polmone del mouse

Le formulazioni in polvere secca per inalazione hanno un grande potenziale nel trattamento delle malattie respiratorie. Prima di entrare in studi sull'uomo, è necessario valutare l'efficacia della formulazione della polvere secca in studi preclinici. Viene presentato un metodo semplice e non invasivo per la somministrazione di polvere secca nei topi attraverso la via intratracheale.

Somministrazione intratracheale della formulazione di polvere secca nei topi

Questa tecnica di instillare farmaci direttamente nella trachea dei roditori neonatali è importante per studiare l'impatto di farmaci o biologici somministrati localmente sulle malattie polmonari neonatali. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato anche per indurre lesioni polmonari in modelli animali.

Un metodo minimamente invasivo per l'instillazione intratracheale di farmaci nei roditori neonatali per il trattamento delle malattie polmonari

Qui, proponiamo un protocollo per la somministrazione di lipopolisaccaridi intratracheali (LPS) tramite intubazione endotracheale orofaringea non invasiva. Questo metodo riduce al minimo il trauma della procedura chirurgica per l'animale e fornisce accuratamente LPS alla trachea e quindi ai polmoni.

Instillazione di lipopolisaccaridi intratracheali non invasivi nei topi

Questo protocollo mostra come il posizionamento ottimale di un topo e l'inserimento transorale di un otoscopio basato su telecamera consentano la visualizzazione della glottide, l'intubazione rapida con un trauma tissutale minimo e l'erogazione costante di liquidi ai polmoni.

Metodologia migliorata per l'erogazione di liquidi al polmone di topo: intubazione con un otoscopio consumer

La terapia cellulare offre un intervento promettente per la fibrosi polmonare utilizzando cellule progenitrici per riparare i tessuti danneggiati e migliorare la funzione polmonare. Poiché l'imaging svolge un ruolo fondamentale nel tracciamento dell'integrazione cellulare, in questo articolo descriviamo il tracciamento in vivo guidato dall'imaging con particelle magnetiche della terapia cellulare per la fibrosi polmonare in un modello murino.

Tracciamento in vivo guidato da immagini di cellule progenitrici epiteliali polmonari distali trapiantate per la fibrosi polmonare mediante imaging con particelle magnetiche

Impara la tecnica IMIT per la somministrazione intratracheale non invasiva di batteri nei polmoni di topi. Questo metodo garantisce consegna accurata e riproducibile per studi sulle malattie respiratorie.

Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

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