Intubazione-mediata intratracheale (IMIT) instillazione: A non invasiva, Lung-specifico sistema di rilascio

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire in modo non invasivo i batteri direttamente nei polmoni dei topi. Ciò si ottiene caricando prima un cuscino d'aria da 150 microlitri in una siringa a tenuta di gas, seguito da 50 microlitri della sospensione batterica preparata. Nella seconda fase, un topo anestetizzato viene intubato con un catetere calibro 20 utilizzando un filo guida per facilitare il posizionamento.

Quindi, dopo aver confermato il successo dell'intubazione utilizzando un semplice flussometro, l'inoculo batterico viene erogato attraverso il catetere direttamente nel polmone con un ago smussato lungo 22 gauge. In definitiva, l'inoculazione intratracheale mediata dall'intubazione o l'inoculazione omessa possono essere utilizzate per studiare la malattia del tratto respiratorio inferiore nei topi, evitando il coinvolgimento concomitante del tratto respiratorio superiore. Il vantaggio principale di imit rispetto ai metodi di inoculazione interna è che questa tecnica consente una somministrazione accurata e riproducibile di un inoculo direttamente ai polmoni.

Poiché l'IIT è una tecnica non chirurgica, riduce anche il potenziale di complicanze associate alle procedure chirurgiche intratracheali. Sebbene questo metodo possa fornire un meccanismo affidabile per veicolare batteri nel polmone per studiare la patogenesi, l'IMA può essere applicato anche alla somministrazione di altri reagenti, come i composti ambientali per studiare il danno polmonare, la somministrazione mirata di terapie per il trattamento e la somministrazione di sonde di imaging o SRNA per studiare la biologia polmonare di base. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con la fase di intubazione poiché la fase richiede un posizionamento accurato dell'animale e l'endoscopio automatico per l'inserimento del filo guida.

La dimostrazione visiva di questo metodo è utile in quanto il posizionamento iniziale del filo guida nella trachea è concettualmente difficile da descrivere ai nuovi ricercatori. 15 ore prima dell'installazione, inoculare tre millilitri di coltura in brodo con una singola colonia batterica e far crescere la coltura a 37 gradi Celsius e uno shaker a 200 giri/min. Dopo 15 ore, centrifugare un millilitro di cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri e risospendere il palato in un millilitro di PBS.

Quindi, misurare una diluizione da uno a 10 della sospensione madre batterica a un OD 600 per determinare la concentrazione batterica. Quindi diluire le cellule batteriche in PBS alla concentrazione desiderata di batteri per 50 microlitri di inoculo. Per l'installazione IIT, i topi vengono preparati per IIT somministrando una soluzione di lidocaina al 2% a un topo leggermente anestetizzato mediante topi con ago savale.

Un ritorno all'anestesia mentre la lidocaina fa effetto. Ora aspirare 150 microlitri d'aria in una siringa a rescissione a gas da 250 microlitri, dotata di un ago smussato lungo 22 gauge. Quindi far avanzare lo stantuffo in teflon dal segno di 150 microlitri al segno di 200 microlitri sul corpo della siringa per aspirare 50 microlitri di inoculo batterico quando la siringa è caricata.

LA, un topo sedato supino su una piattaforma di intubazione che fissa l'animale per gli incisivi su un anello senza anello attaccato a una striscia di velcro collegata alla piattaforma. Sollevare il mouse a un'inclinazione di 45 gradi e quindi utilizzare un applicatore di micro cotone per ritrarre la lingua con un movimento rotatorio con la mano dominante. Successivamente, con la mano non dominante, utilizzare un otoscopio operativo dotato di uno speculare per intubazione sia per mantenere la retrazione della lingua che per visualizzare l'epiglottide.

Quindi, tenendo un filo guida infilato in un catetere calibro 20 nella mano dominante, intubare il topo a una profondità di 10 millimetri all'interno della trachea e rimuovere l'otoscopio. Fissare il catetere con la mano non dominante. Quindi collegare brevemente al catetere una lunghezza collegata all'esca di un tubo trasparente 16° contenente un colorante colorato.

Il colorante dovrebbe migrare rapidamente avanti e indietro in risposta alla respirazione dell'animale quando l'animale è stato intubato con successo. Inserire l'ago smussato calibro 22 nel catetere ed erogare l'inoculo direttamente nel polmone con un unico movimento fluido. Quindi rimuovere immediatamente l'ago e il catetere dall'animale e riportare il topo nella sua gabbia con monitoraggio fino a quando l'animale non si è completamente ripreso dall'anestesia.

Per valutare la carica batterica del tessuto polmonare infetto, rimuovere i polmoni utilizzando una tecnica sterile e posizionare il tessuto in una sacca sterile pre-pesata da un'oncia. Dopo aver pesato la sacca del campione e i polmoni, aggiungere un millilitro di PBS sterile al tessuto e rivendere la sacca del campione. Quindi arrotolare delicatamente una pipetta sierologica da 25 millilitri sulla sacca del campione per omogeneizzare il tessuto.

Rimuovere il tessuto collegato attraverso un filtro sterile a parete in poliestere e trattare l'omogenato con tritton X 100 a una concentrazione finale dell'1% per liberare i batteri. Successivamente, utilizzare una pipetta multicanale per eseguire una diluizione seriale di sei volte dell'omogenato in una piastra UBO a 96 pozzetti. Quindi utilizzare un multicanale a otto pozzetti per placcare l'omogeneizzato triplicato aliquote da 10 microlitri su una piastra di agar LBA.

Infine, incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius ed enumerare le unità formanti la colonia il giorno successivo. La somministrazione dei batteri è altamente efficiente con questo metodo con oltre il 98% dell'inoculo di aerogeno di pseudomonas recuperato dai polmoni degli animali instillati in questo esperimento rappresentativo. Inoltre, l'installazione IIT è altamente riproducibile indipendentemente dalla concentrazione dell'inoculo somministrato.

Per visualizzare la distribuzione del materiale instillato tramite il metodo IIT, 50 microlitri di colorante blu brillante Kumasi allo 0,1% possono essere erogati nei polmoni, come appena dimostrato per l'inoculo. Si noti che la distribuzione del colorante a tutti i lobi del polmone una volta padroneggiata. Questo metodo può essere eseguito rapidamente con un team di due ricercatori in un tempo medio di due o tre minuti, compresa l'anestesia, l'inoculazione IMA e il recupero dall'anestesia.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante non fare più di due tentativi falliti di intubare il topo. La mancata intubazione può causare potenziali traumi dovuti all'inserimento del catetere nell'esofago piuttosto che nella trachea. Molti agenti patogeni respiratori, compresi quelli che richiedono il contenimento dell'abs L tre, possono essere efficacemente somministrati dall'imed poiché questa procedura può essere eseguita, come dimostrato nelle cappe di sicurezza e in aggiunta dai ricercatori che indossano una protezione respiratoria completa, compresa una visiera.

Abbiamo dimostrato che l'imit è un metodo molto accurato ed efficiente per la somministrazione di materiali direttamente nei polmoni dei topi. Queste proprietà rendono imit adatto per studi di tipo GLP che richiedono sistemi di modelli altamente riproducibili.