Name: Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri un metodo per rilevare le vere cellule B di topo che producono IgE mediante digestione con tripsina, fissaggio e citometria a flusso. Questo protocollo rimuove l'IgE legato ai recettori superficiali per analizzare accuratamente il cambio di classe degli immunoglobulini.

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DRW è sostenuto da sovvenzioni NIH AI089972 e AI113217, e dalla mucosa Immunologia Studi della squadra, e in possesso di un Premio alla Carriera per medici scienziati del Wellcome Fondo Burroughs.

NOTA: Tutti gli esperimenti descritti erano in conformità con le Istituzionale Cura e uso Comitato Animal (IACUC) le linee guida e approvato dal Hospital Children Research animali (ARCH), Boston, Mass. 1. Preparazione dei reagenti <ol><li> 1,000x IL-4 Stock: Diluire citochina IL-4 a 20 pg / ml in H 2 O o 0,1% di siero albumina bovina (BSA). Distribuire in 200 aliquote microlitri provette da 1,5 ml microcentrifuga e conservare a -20 ° C. </li><li> 1,000x anti-CD40: ottenere dal produttore a 1,0 mg / ml, conservare a 4 ° C. </li><li> B stimolazione cellulare multimediale: per 425 ml di terreno RPMI-1640, aggiungere 75 ml di siero di vitello fetale appena scongelati (FCS), 10 ml di 1,0 M tampone HEPES, 5 ml di L-glutammina magazzino, 5 ml penicillina: streptomicina magazzino, 5 ml essenziali media non essenziali Aminoacidi microlitri minimi (MEM-NEAA), e 3,5 di 2-mercaptoetanolo. Tenere i supporti a 4 ° C per un massimo di una settimana. Aggiungere IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 mcg / ml) immediatamente prima dell&#39;usosolo il volume di supporti necessari. </li><li> 2% FCS-FACS Buffer: Aggiungi 10 ml di FCS a 490 ml di 1x PBS. Conservare a 4 ° C. </li><li> 2x soluzione tripsina-EDTA: Diluire 5 ml di soluzione di 10x tripsina-EDTA magazzino (5,0 g tripsina, EDTA 2,0 g per litro) in 20 ml di PBS 1x. Conservare tripsina-EDTA in 2x aliquote di lavoro a 4 ° C. Lasciar riscaldare a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. </li><li> Siero fetale di vitello: Mantenere FCS scongelati a 4 ° C per un massimo di due settimane. Mettere in ghiaccio 15 minuti prima che la procedura di colorazione citoplasmatica. </li><li> Neutral-buffered formalina: Preparare una soluzione di formalina al 10% (3,7% paraformaldeide). Formalina è tossica e quindi gestirlo sotto una cappa di laboratorio mentre indossa appropriate DPI. Conservare formalina a temperatura ambiente in un armadietto di immagazzinaggio chimico. </li><li> Metanolo: Conservare metanolo assoluto (100%) a -20 ° C finché le cellule sono pronte per essere permeabilizzate. Si noti che il metanolo è infiammabile e deve essere conservato in un freezer adeguato. </li></ol> 2.Purificazione e attivazione delle cellule B <ol><li> Da una milza del mouse appena raccolte, preparare una sospensione di cellule singole premendo delicatamente l&#39;organo attraverso un colino cella di 70 micron con lo stantuffo di una siringa da 3 ml. In una provetta da centrifuga da 15 ml conica, raccogliere le cellule in 10 ml di PBS 1x e centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e risospendere pellet in 1 ml di globuli rossi Lysing Buffer per 5 min. Neutralizzare con 13,5 ml di 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li><li> (Opzionale) magneticamente separare le cellule B e che utilizzano anti-CD45R (B220) -labeled perline, seguendo il protocollo di purificazione MACS secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Stimolare le cellule B purificate a 1,0 x 10 6 cellule / ml in scaldato mezzi stimolazione delle cellule B contenente IL-4 (20 ng / ml) e anti-CD40 (1,0 mcg / ml) per 5 giorni a 37 ° C. Iniziare con 8 ml di coltura divisi in 2 pozzetti di una piastra di coltura da 6 pozzetti (4 ml). </li><li> Controllare culturi giornaliero di mantenere a 1,0 x 10 6 cellule / ml. Regolare la concentrazione suddividendo in altri pozzi e diluendo la cultura dei media con la stimolazione delle cellule B contenente IL-4 freschi e anti-CD40. </li></ol> 3. tripsinizzazione, Fissazione e permeabilizzazione <ol><li> Tripsinizzazione <ol><li> Raccogliere fino a 1.0 x 10 7 cellule coltivate in una provetta conica da 15 ml, centrifugare a 300 xg per 5 min, e decantare il surnatante. </li><li> Lavare con 10 ml di PBS per rimuovere la proteina residua dal supporto di raccolta delle cellule. Ripetere la fase di centrifugazione e decantare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet di cellule nel volume residuo dopo decantazione (circa 100 ml). </li><li> Aggiungere con cautela 800 ml di temperatura ambiente 0,1% (2x) tripsina-EDTA alle cellule. Versare lentamente con un angolo di 45 ° lungo la parete del tubo conico. </li><li> Chiudere la provetta e miscelare delicatamente inclinando il tubo in modo che il liquido corre lungo la lunghezza del tubo di tempo 5-6s. A filante, precipitato bianco potrebbe formarsi nella soluzione. Limitare il tempo tripsinizzazione di sotto di un min. </li><li> Placare la reazione tripsinizzazione con 1 ml di FCS freddo. Diluire il FCS immediatamente aggiungendo 10 ml di PBS freddo. </li><li> Centrifugare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C, poi decantare il supernatante e restituire i tubi in ghiaccio. </li></ol></li><li> Fissazione <ol><li> Risospendere le cellule nel volume residuo dopo decantazione. Se necessario, portare il volume fino a 100 ml con PBS freddo. </li><li> In una cappa aspirante, aggiungere 800 ml di soluzione di formalina tamponata neutra al 10% per le cellule e pipettare su e giù. Il tubo scalderà seguito all&#39;aggiunta di formalina. Incubare a 37 ° C per 10 min. </li></ol></li><li> Permeabilization <ol><li> Impostare un mixer da banco vortex ad una velocità di agitazione delicata. </li><li> Disegna 9 ml di freddo (-20 ° C), metanolo in un 10 ml pipetta sierologica. </li><li> Tenere la provetta contenente le cellule sopra il vortex e iniziare dolcemente shaking cellule. </li><li> Aggiungere metanolo freddo al tubo in modo cade a gocce sulle cellule mentre il tubo è ancora scuotendo modo che il metanolo è continuamente miscelazione. Dopo i primi 2 ml di metanolo la velocità di erogazione può essere aumentata a un flusso lento. </li><li> Lasciate che il tubo di sedersi sul ghiaccio per 30 minuti per completare la permeabilizzazione. In alternativa, le cellule possono essere conservati a -20 ° C per un mese. </li></ol></li></ol> 4. fluorescenza colorazione per IgG1 e IgE di conversione <ol><li> Campione Centrifugare a 300 xg per 5 minuti e decantare la soluzione di metanolo. Un precipitato bianco può sedimentare le cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di temperatura ambiente 1x PBS e centrifugare a 300 xg per 5 minuti per lavare le cellule. Ripetere una volta. Nota: Lavare il pellet con temperatura ambiente PBS dissolve precipitato in più che può formare dopo la fase 4.1. </li><li> Eseguire un lavaggio supplementare con 10 ml di 2% FCS-tampone FACS. </li><li> Distribuire campioni ad un 96-ben piatto rotondo fondoe centrifugare a 300 xg per 5 min. Decantare il surnatante e mettere il piatto su ghiaccio. </li><li> Stain in 60 ml di 2% di buffer FCS-FACS per bene con le seguenti diluizioni degli anticorpi: anti-IgM RPE / Cy7, 1: 200, anti-IgG1 PE, 1: 600, anti-IgE FITC, 1: 100, Anti- CD45R (B220) PerCP-Cy5.5, 1: 200 </li><li> Dopo 5 min di colorazione, lavare la piastra con 150 ml di 2% FCS-tampone FACS e centrifugare per 5 min a 300 x g. </li><li> Risospendere in 400 ml di 2% di buffer FCS-FACS e pipetta attraverso una 40 micron colino cella nylon in 5 ml FACS tubo. </li></ol> 5. Utilizzare la seguente strategia Gating: <ol><li> Isolare CD45R (B220) cellule positive da parte della popolazione brillamento linfociti situato sul / plot SSC FSC (Figura 1). </li><li> Dalle cellule positive B220, utilizzare la trama IgE e IgG1 di rivelare le popolazioni corrispondenti. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno divulgazioni.

La stimolazione di topo milza cellule B in coltura con anti-CD40 e IL-4 simulerà T helper di tipo 2 (T H 2) le interazioni, il passaggio di classe incoraggiante IgG1 e IgE 5. Cellule B possono essere attivate per la RSI nel contesto di splenociti totale 12 o come purificati cellule B della milza 11. Come indicato nel protocollo (passo 2.3), B arricchimento delle cellule è opzionale, ed è a discrezione dello sperimentatore per determinare se sarebbe vantaggioso. Positivo separa...

Durante immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) in topi e nell&#39;uomo, il IgH μ esoni regione costanti (Cu) vengono cancellati e sostituiti da uno dei diversi gruppi di downstream esoni regione costanti (C H s) (es Cγ, Cε e Cα), risultando in un interruttore dalla produzione di IgM alla produzione di altre classi di Ig (ad esempio IgG, IgE, o IgA). CSR avviene entro interruttore (S) le regioni, che sono 1-10 sequenze kb situati 5 &#39;per ogni set di C H 1 s. L&#39;attivazione indotta citidina deaminasi (AID) enzima avvia CSR attraverso l&#39;attività citidina deamination. IgE è un mediatore chiave della malattia allergica 2 e una maggiore comprensione di come IgE è prodotto e regolato può aprire le porte a nuovi approcci terapeutici per la malattia atopica. In topi e nell&#39;uomo, IgE è isotipo Ig più strettamente regolata. IgE è normalmente rilevato livelli migliaia di times meno di altri IgH isotipi 3, ma possono essere molto elevati negli stati di malattia 4. Tuttavia, la RSI per IgE non è completamente comprensibile. In vitro attivazione delle cellule B con IL-4 in combinazione con anti-CD40 o LPS, induce la RSI sia IgG1 e IgE 5. Cellule B attivate esprimono il recettore a bassa affinità IgE FcεRII / CD23 2,6, che lega IgE solubile secreta nella cultura dopo CSR. Perciò quando si analizzano con citometria a flusso, le cellule B con il recettore legato IgE macchia simile a B cellule che esprimono endogenamente IgE 7. Mentre è noto che il mouse B cellule esprimono il recettore a bassa affinità IgG FcγRIIB1 (CD32) 8, nella nostra esperienza non sembra interferire con la misura di commutazione classe IgG1. Tuttavia, quando si misura IgE commutazione dopo l&#39;attivazione delle cellule B nella cultura, non specifica di superficie legato IgE può oscurare l&#39;analisi. Con i metodi di colorazione comuni, le cellule non-IgE-esprimono macchia positivo per IgE. Delineato qui è una strategia che è stata utilizzata per condurre test di CSR e rilevare vere cellule-IgE esprimono B da topi 9-11. Il trattamento delle cellule B attivate con tripsina, un reagente di laboratorio comune a digerire le proteine, rimuove sia cytophylic e la membrana superficiale legata IgE. Permeabilizzazione successiva e colorazione per citoplasmatica IgE rivela così le vere cellule-IgE che producono.

<table><tbody><tr><td>Anti-Topo IgE FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553415</td><td>clone R35-72</td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse IgG1 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>550083</td><td>clone A85-1</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>BDH</td><td>BDH1135-4LP</td><td>Mantenere a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Filtro per celle Falcon 40 &micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per celle Falcon 70 &micro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Hu/Mo CD45R(B220) PerCP-Cy5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4052-82</td><td>clone RA3-6B2</td></tr><tr><td>anti-Mouse/Rat CD40</td><td>eBioscience</td><td>16-0402-85</td><td>clone HM40-3</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (10x)</td><td>Lifetechnologies (Corning)</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD45R (B220) microsfere&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-049-501</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di purificazione MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech</td><td>214-14</td><td>Ricostituire in acqua o soluzione di formalina BSA allo 0,1%,</td></tr><tr><td>tamponata neutra, 10%</td> Soluzione di tripsina-EDTA <td>Sigma Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>(10x)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174-100 ml</td><td>5,0 g di tripsina, 2,0 g di EDTA&#8226; 4 Na per litro di 0,9% NaCl</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100 ml</td><td>10.000 U Penicillina; 10 mg/ml Streptomicina (100x)</td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo (99%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Tampone per lisi dei globuli rossi</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse IgM RPE/Cy7</td><td>SouthernBiotech</td><td>1140-17</td><td>clone 1B4B1</td></tr><tr><td>HyClone Siero fetale di vitello</td><td>Thermo</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr>Terreni <td></td><td></td> di<td>stimolazione delle cellule B</td> I <td>mezzi di stimolazione delle cellule B sono costituiti da RPMI con siero fetale di vitello (15%), 20 mM HEPES, 1x MEM-NEAA, 2,0 mM L-glutammina,&nbsp; 1x Penicillina-Streptomicina (Penicillina: 100 U/ml, Streptomicina: 100 &; g/ml), beta-mercaptoetanolo (7 & micro; L/L), IL-4 (20 ng/ml) e anti-CD40 (1 &micro; g/ml)</td></tr></tbody></table>

rilevazione di true ige-esprimono mouse b cells lineage

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B linfociti immunoglobuline catena pesante (IgH) ricombinazione switch di classe (CSR) è un processo in cui inizialmente espresso IgM passa ad altri isotipi IgH, come IgA, IgE e IgG. Misurazione di IgH CSR in vitro è un metodo fondamentale per lo studio di un certo numero di processi biologici che vanno dalla ricombinazione e riparazione del DNA agli aspetti della immunologia molecolare e cellulare. Test in vitro CSR coinvolge citofluorimetrica superficie di misurazione espressione Ig sulle cellule B attivate. Mentre la misurazione di IgA e IgG sottoclassi è semplice, misurazione delle IgE con questo metodo è problematico a causa IgE solubile legame FcεRII / CD23 espresso sulla superficie delle cellule B attivate. Qui si descrive una procedura unica per la misurazione accurata delle IgE-produzione di cellule del mouse B che hanno subito la RSI nella cultura. Il metodo si basa sulla tripsina-mediata scissione di complessi IgE-CD23 sulla superficie delle cellule, consente il rilevamento di IgE-cellule produttrici B lineage da cycolorazione toplasmic. Questa procedura offre una soluzione conveniente per l&#39;analisi di citometria di flusso della RSI a IgE.

Questa procedura è stata implementata con successo per studiare la RSI a IgE in cellule del mouse B. Per dimostrare l&#39;efficienza di misura della RSI, abbiamo stimolato le cellule B della milza di topo con anti-CD40 e IL-4 come descritto in precedenza 11. Dopo cinque giorni di stimolazione, le cellule sono state raccolte ed elaborate utilizzando il protocollo sopra descritto e colorati con fluorescenza marcata IgM, IgG1, IgE, gli anticorpi e B220 (CD45R). Gated sui linfociti sabbiatura (figura 1),<...

L'analisi in vitro della ricombinazione del cambio di classe nei topi è impegnativa a causa delle molecole IgE citofile legate ai recettori Fc sulla superficie delle cellule B. Descriviamo un metodo per la rilevazione delle IgE utilizzando la scissione mediata dalla tripsina delle IgE legate alla superficie prima della fissazione e della permeabilizzazione per la colorazione a fluorescenza citoplasmatica.

Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di distinguere le cellule B che esprimono vere IgE dalle cellule B, che esprimono altri isotipi di IgE secrete. Durante il cambio di classe in vitro, i saggi si legano alle proteine della superficie delle cellule B, il che oscura la capacità di misurare il passaggio di classe alle IgE. L'obiettivo viene raggiunto rimuovendo le molecole di IgE legate al recettore prima dell'analisi mediante l'uso della tripsina, che non scompone specificamente le proteine della superficie cellulare lasciando intatte le molecole di immunoglobuline intracellulari prodotte endogenamente.In secondo luogo, le proteine intracellulari vengono esposte fissando le cellule B con la formina e permeano le cellule con metanolo. Successivamente, le cellule vengono colorate con anticorpi marcati in fluorescenza per rivelare le immunoglobuline intracellulari. I risultati mostrano una distinta popolazione di cellule B IgE positive.Se la tripsina viene utilizzata sulla base dell'analisi della citometria a flusso, gli studi sulla biologia delle IgE sono stati limitati a causa della difficoltà di rilevare le cellule produttrici di IgE. Questo metodo fornisce una soluzione accessibile che i laboratori possono facilmente adottare per accelerare la nostra comprensione di questa interessante molecola. Questa tecnica è vantaggiosa rispetto ai metodi esistenti per eliminare l'effetto delle IgE legate al recettore.Ad esempio, è meno costoso rispetto al blocco delle IgE superficiali con anticorpi anti IgE e più tollerante di un trattamento di lavaggio acido. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'analisi della classe delle cellule B di topo, il passaggio al trattamento delle IgE con tripsina prima della colorazione potrebbe essere applicato anche ad altri protocolli che richiedono la rimozione delle proteine di superficie da una milza di topo appena raccolta. Preparare una sospensione a cellula singola.Premere delicatamente l'organo attraverso un colino cellulare da 70 micron utilizzando lo stantuffo di una siringa da tre millilitri. Raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga conica da 15 millilitri contenente 10 millilitri di un XPBS. Successivamente centrifugare le celle a 300 Gs per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Decantare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi. Lasciare andare la reazione di lisi per cinque minuti prima di neutralizzarla con 13,5 millilitri di un XPBS. Quindi centrifugare nuovamente le celle a 300 Gs per cinque minuti e risospendere il pellet nel volume residuo.Ora aggiungi alle cellule un terreno di stimolazione delle cellule B calde contenenti IL quattro e anti CD 40. Iniziate con una coltura da otto millilitri divisa in due pozzetti di una piastra di coltura a sei pozzetti e stimolate le cellule a 37 gradi Celsius per cinque giorni. Controllare la coltura ogni giorno per mantenere le cellule a 1 milione per millilitro.Regolare una concentrazione dividendo le colture in altri pozzetti e diluendo con la stimolazione delle cellule B. Supporti contenenti IL quattro nuovi e anti CD 40. Inizia raccogliendo fino a 10 milioni di cellule B stimolate in una provetta conica da 15 millilitri.Quindi centrifugarli a 300 g per cinque minuti e decantare il surnatante per rimuovere la proteina residua dal terreno di raccolta cellulare. Lavare le cellule B con 10 millilitri di PBS seguito da un'altra centrifugazione e decantazione della stalla Dopo la decantazione, risospendere il pellet di cella nel volume residuo di circa 100 microlitri e aggiungere con cura 800 microlitri di viaggi a temperatura ambiente allo 0,1% in EDTA. Aggiungere lentamente la soluzione lungo la parete laterale del tubo.Aggiungere un'inclinazione, quindi tappare il tubo e mescolarlo delicatamente facendo scorrere il liquido lungo la lunghezza del tubo. Cinque o sei volte un precipitato bianco filamentoso potrebbe formarsi nella soluzione entro un minuto. Spegnere la reazione con un millilitro di FCS freddo.Mantieni le celle sul ghiaccio. Ora sono ancora vivi e possono esprimere nuove proteine di superficie. Diluire immediatamente l'FCS aggiungendo 10 millilitri di PBS freddo.Rimuovere eventuali detriti galleggianti con una pipetta. Centrifugare le celle a quattro gradi Celsius. Decantare immediatamente la trappola e risospendere le cellule nel volume residuo.Se necessario, portare il volume fino a 100 microlitri con PBS freddo, procedendo rapidamente in una cappa aspirante a 800 microlitri di pipetta di formina tamponata neutra al 10%, la miscela su e giù per la provetta inizierà a riscaldarsi: una volta miscelata, incubare le cellule nel fissativo per 10 minuti a 37 gradi Celsius. Nel frattempo, installare un miscelatore a vortice da banco a una velocità di agitazione delicata e preparare il metanolo a 20 gradi Celsius per l'uso. Quando le cellule hanno finito di incubare.Aspirare nove millilitri di metanolo in una pipetta sierologica. Quindi, stappato delicatamente il tubo, agitando il tubo aggiungendo il metanolo goccia a goccia. Dopo aver erogato due millilitri di metanolo, accelerare gradualmente fino a un flusso lento.Ora lascia riposare la provetta sul ghiaccio per 30 minuti per permeare le cellule. In alternativa, le celle possono essere conservate a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per un massimo di un mese. Iniziare la procedura di colorazione centrifugando prima le celle permeabili e decantando il metanolo.Un precipitato bianco può pellettare con le cellule. Successivamente lavare le celle mescolando in 10 millilitri di temperatura ambiente una centrifugazione XPBS e decantazione. Eseguire questa fase di lavaggio due volte.Quindi, eseguire un ulteriore lavaggio con 10 millilitri di fax FCS al 2%, tamponare e risuspendare. Il pellet nel volume residuo procede caricando il campione in un pozzetto di una piastra inferiore rotonda da 96 pozzetti. Molti campioni vengono in genere elaborati in parallelo.Caricare da 20 a 50 microlitri utilizzando una centrifuga a piastre e centrifugare le celle a 300 Gs per cinque minuti. Quindi decantare il rullare e mettere il piatto sul ghiaccio. Ora colorare le cellule in ogni pozzetto, aggiungere 60 microlitri di tampone fax FCS al 2% contenente quattro diversi anticorpi.Lascia incubare le cellule nella macchia per cinque minuti dopo la colorazione. Lavare le celle aggiungendo 150 microlitri di pelliccia tampone fax al 2%FCS. Quindi centrifugare la piastra come prima, quindi decantare la soluzione e sospendere nuovamente le cellule.Utilizzare 400 microlitri di buffer fax FCS al 2%. Ora pipettare le cellule attraverso un colino di nylon da 40 micron in un tubo fax da cinque millilitri per il cancello fax. Le cellule isolando prima le cellule CD 45 R positive, note anche come B due cellule 20 positive dalla popolazione di linfociti esplosivi sul grafico F-S-C-S-S-C poi dalle due cellule B 20 positive.Utilizzare il grafico IgE e IgG one per rivelare le popolazioni corrispondenti utilizzando questa procedura. La ricombinazione del cambio di classe in IgE è stata studiata nelle cellule B di topo utilizzando una strategia di gating basata sui linfociti blastanti. Una chiara popolazione di cellule IgE positive non potrebbe essere discriminata in modo pulito senza la tripsina delle cellule tripsina prima della fissazione e la permeazione ha permesso la separazione delle cellule produttrici di IgE grazie alla rimozione delle IgE legate alla superficie Una volta padroneggiate.Questa tecnica di colorazione può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente. Lavorare con formalina e metanolo può essere pericoloso. Pertanto, durante l'esecuzione di questa procedura è necessario utilizzare sempre un fuma e dispositivi di protezione individuale adeguati.

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