Registrazione simultanea elettrofisiologici e micro-iniezioni di agenti inibitori nel cervello del roditore

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di costruire una strada di iniezione economica per microiniettare neurotrasmettitori nel collicolo superiore del ratto, monitorando al contempo l'attività neuronale multi-unità. Ciò si ottiene creando prima una pipetta di vetro utilizzando un capillare di vetro e un estrattore per micropipette verticale. Il secondo passo consiste nell'inserire un filo d'argento nel capillare con una sezione di filo che sporge dall'estremità non conica.

Successivamente la colla viene utilizzata per creare una tenuta ermetica tra la pipetta di vetro e un ago ipodermico. I passaggi finali consistono nel riempire la pipetta con una soluzione di GABA di colore blu cielo di Chicago collegata a una micro siringa riempita di olio minerale e fissata a un micro iniettore. In definitiva, questa costruzione di un'iniezione con parti accessibili e convenienti può essere utilizzata per inattivare le strutture cerebrali profonde mentre registra l'attività neuronale dell'area inattivata prima, durante e dopo l'iniezione di un farmaco.

Ci sono alcuni vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi esistenti come gli impulsi di pressione basati su gas e i sistemi di iniezione fotica. Uno è che si tratta di un metodo efficiente in termini di costi che consente un controllo basato sulla funzione della somministrazione del farmaco, che limita il danno tissutale causato da un'iniezione eccessiva. Un altro vantaggio offerto da questo sistema è una capacità di registrazione combinata, che consente un controllo efficiente sulla componente temporale della disattivazione neurale.

Per preparare le pipette per iniezione di registrazione, tirare prima un capillare di sette centimetri con un diametro esterno di un millimetro per un modello verticale cop. Seven 20 o unità simile. Impostare il riscaldatore su 18 e il solenoide su uno successivo, indossando i guanti, rompere manualmente la punta per fare un'apertura e verificare al microscopio che il diametro interno sia compreso tra 30 e 40 micrometri.

Misuralo con il righello del mirino. Produrrà un'impedenza relativamente bassa da 0,3 a 0,6 mega ohm. Quindi, dall'estremità non conica, inserire un filo d'argento nella pipetta lungo circa sette centimetri e lasciare uno o due centimetri che pendono dalla pipetta.

Piegare questo filo in eccesso ortogonalmente al capillare. Quindi, prendi un ago ipodermico calibro 30 e applica l'adesivo di plastica flessibile sull'asta. Quindi inserire lentamente l'ago nella pipetta.

Per quanto possibile. Aggiungere altro adesivo per creare una tenuta alla giunzione tra la pipetta e l'ago. Con la punta della pipetta rivolta verso l'alto, lasciare asciugare il gruppo per circa 12 ore.

Dopo aver anestetizzato e messo il ratto in una cornice stereotassica, applicare un unguento oftalmico per radersi la testa. Dopo aver applicato un anestetico locale e confermato un piano chirurgico di anestesia, procedere con l'incisione del cuoio capelluto lungo la mediana utilizzando una lama di bisturi numero 10. Questo esporrà le suture coronali e sagittali.

Quindi, utilizzando una spatola chirurgica, identificare i riferimenti anatomici Lambda e bgma. Regolare la posizione della testa in modo che questi punti di riferimento siano livellati sullo stesso piano orizzontale. Poi zero, un puntatore sottile e rigido come un tubo di vetro sulla bgma.

Quindi, regola la posizione del tubo in una posizione di interesse utilizzando le coordinate del bgma. Usa il pennarello per disegnare un quadrato attorno all'area di destinazione per la craniotomia. Ora con il trapano chirurgico sterilizzato, rimuovere lentamente l'osso lungo i segni.

Inizia esercitando la minor pressione possibile e mantieni il trapano in movimento per evitare danni ai tessuti indotti dalla testa dovuti all'attrito quando l'osso è diventato sottile, rimuovi con cura la sezione quadrata con una pinzetta. Non è necessario rimuovere il Dora MA poiché l'iniezione lo penetrerà in avanti. Mantieni la corteccia esposta irrigata con liquido cerebrospinale.

Preparare l'iniezione riempiendo prima una siringa da cinque a 10 microlitri con olio minerale. Successivamente, preparare il farmaco di interesse con un colorante in soluzione fisiologica. Qui lo 0,5% di azzurro cielo di Chicago è mescolato con 300 gaba micromolari.

Ora riempi la pipetta per iniezione caricando prima una siringa da un millilitro con una soluzione preparata, quindi utilizzando la siringa per caricare la pipetta. Quando si rimuove la siringa, mantenere una leggera pressione sullo stantuffo, in modo che il vuoto non rimuova la soluzione dalla strada di iniezione. Verificare la fuoriuscita di liquido in eventuali punti di perdita.

Tamponare il liquido in eccesso e ricontrollare la presenza di perdite. Ora, collegare la siringa micros con olio minerale alla strada di iniezione. Quindi rimuovere la soluzione in eccesso.

Con una garza. Controllare la punta di iniezione. Dovrebbe essere possibile far fluire piccole gocce di soluzione attraverso di esso, altrimenti è bloccato o ora monta saldamente l'iniettore su un sistema di micropompa.

Quindi spostare la posizione della strada di iniezione alle coordinate target e abbassare l'elettrodo al colore superiore, che può essere identificato attraverso la registrazione dei potenziali evocati visivi. Mentre l'elettrodo è abbassato, applicare una piccola pressione positiva applicando una bassa velocità di iniezione per evitare l'intasamento. Interrompere l'iniezione quando la struttura è raggiunta.

Dopo aver inserito l'iniezione, coprire la corteccia esposta con agar caldo per evitare l'essiccazione. Dopo il posizionamento finale dell'elettrodo, attendere 30 minuti per consentire la stabilizzazione del tessuto che circonda l'elettrodo. Quindi iniettare da 400 a 800 nanolitri di soluzione a una velocità di 40 nanolitri al minuto fino a quando non si attiva l'attività neuronale nel colo superiore, l'elettrodo dovrebbe mostrare una riduzione dei picchi durante l'iniezione della soluzione inibitoria.

I potenziali evocati visivamente sono stati ottenuti nel colus superiore. Dopo un flash di 300 millisecondi all'occhio controlaterale dopo l'iniezione di gaba, l'attività di picco in risposta a uno stimolo flash è stata soppressa per 45-60 minuti. Durante questa procedura, è importante verificare la presenza di perdite durante il caricamento e verificare che la soluzione farmacologica scorra liberamente attraverso la punta di iniezione.