Metodo semplice per DNA fluorescenza

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare l'ibridazione in situ del DNA per mappare le sequenze eterocromatiche sui cromosomi mitotici. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando i cervelli di larve di drosophila di terzo stadio, oppure un altro tessuto di interesse. Il secondo passaggio consiste nel fissare il tessuto su un vetrino coprioggetto.

Successivamente, il tessuto viene schiacciato tra il coprioggetto e un vetrino. Per preparare i cromosomi all'ibridazione, l'ultimo passaggio consiste nell'ibridare brevi sonde oligonucleotidiche sintetizzate al tessuto schiacciato. Infine, si utilizza la microscopia a fluorescenza per mostrare la localizzazione delle sequenze complementari alle sonde oligonucleotidiche sui cromosomi.

Il principale vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti è la sua semplicità. La maggior parte degli altri metodi di ibridazione cromosomica e C due prevede lavaggi con grandi quantità di formammide, che può essere costosa e difficoltosa da gestire. Il nostro metodo non richiede lavaggi con formammide, risultando così una tecnica più economica, pulita e rapida.

Sebbene questo metodo fornisca un modo semplice per mappare visivamente le sequenze sui cromosomi somatici dei cervelli di drosophila, può anche essere utilizzato per mappare sequenze su altri tipi di cromosomi provenienti da diversi tessuti in organismi diversi. Per ogni vetrino da preparare, si raccomanda di preparare quattro o cinque tessuti, ma non di più per le dissezioni cerebrali. Iniziare selezionando larve di terzo stadio vaganti e raccogliendole in una goccia di 1x PBS.

Scegliere provette da cui prelevare in cui non vi sia sovraffollamento. Sotto la lente di dissezione, utilizzare pinzette ultrasottili per afferrare i ganci boccali e un altro paio di pinzette per afferrare il corpo a due terzi della sua lunghezza. Quindi tirare delicatamente i ganci boccali per esporre il cervello, i gangli ventrali, le ghiandole salivari e parti del tratto digestivo.

Successivamente, rimuovere con pinzette il cervello e i gangli ventrali dai tessuti circostanti e trasferirli in una goccia di XPBT su una piastra di plastica. Per le dissezioni dei testicoli di nasia, raccogliere maschi di puy di tre giorni. I puy di tre giorni hanno il corpo giallo e gli occhi rossi.

Quelli con le espansioni alari più piccole sono maschi. Afferrare la pupa nella parte superiore dell'addome, vicino alla regione toracica, con una pinzetta e, con una seconda pinzetta, prendere l'estremità più distale dell'addome, quindi estrarre i testicoli di forma ovale.

Sono circondati da corpi adiposi che possono essere delicatamente rimossi agitando, staccare tutte le parti esterne dai testicoli, il che impedirà un corretto schiacciamento, e trasferire i testicoli in una goccia di XPBT 1x su una piastra pulita. Una volta raccolti tutti i tessuti, trattarli con una soluzione ipotonica per migliorare la separazione delle cromatidi sorelle. Nelle regioni e cromatiniche, trasferire i tessuti in una goccia di citrato di sodio allo 0,5% per 10 minuti.

Per ottenere questo effetto, non si consiglia la colchicina perché può causare artefatti nella morfologia dei cromosomi. Fissare ora i tessuti utilizzando pinzette ultrafini. Trasferirli in una goccia di 20 microlitri di PFA al 2,5% appena preparato in acido acetico al 45% su un'ampolla pulita trattata con sigma coat, distribuire i tessuti uniformemente nel fissativo e incubare per quattro minuti a temperatura ambiente; quindi procedere con la schiacciatura delle ampolle, iniziando col posizionare delicatamente un vetrino ricoperto di polilisina, capovolto, sul tessuto e sull'ampolla.

Lasciare che il coprioggetto aderisca alla parte inferiore del vetrino senza premere. Trattare i coprioggetti con sigma coat aiuta a garantire che il tessuto schiacciato rimanga sul vetrino dopo la rimozione del coprioggetto. Tuttavia, raramente il tessuto potrebbe rimanere attaccato al coprioggetto.

Durante questo passaggio, si consiglia di eseguire schiacciamenti del tessuto in replicato. Ora capovolgere il vetrino e posizionarlo all'interno di un foglio di carta spessa piegato. Successivamente, su una superficie stabile, premere con decisione verso il basso, utilizzando il pollice, direttamente sopra il coprioggetto.

Non premere in modo da far scivolare il vetrino, altrimenti il tessuto verrà sfregato. Una pressione molto ferma di solito produce cromosomi ben definiti all'interno del preparato schiacciato. Tuttavia, a volte si può riscontrare una variabilità nella qualità dei cromosomi, come cromosomi incompleti, schiacciati o frammentati.

Pertanto, raccomandiamo nuovamente di eseguire due o tre schiacciamenti del tessuto in replicato. Trasferire l'assemblaggio su un blocco di ghiaccio per alcuni minuti, quindi immergerlo in azoto liquido fino a quando l'azoto smette di bollire o per un tempo più lungo. Dopo aver rimosso immediatamente il vetrino prima che il tessuto si scongeli, utilizzare una lama di rasoio nuova per sollevare un angolo del coprioggetto, rimuovendolo così.

Attenzione a non graffiare il tessuto. Quindi posizionare rapidamente il vetrino in un barattolo Coplin riempito con etanolo al 100% e lasciare in ammollo per almeno cinque minuti. Rimuovere il vetrino, asciugare l'eccesso di etanolo senza toccare il tessuto e lasciare asciugare all'aria per un'ora.

I vetrini possono quindi essere conservati per settimane o mesi in una camera a disidratazione. Iniziare aggiungendo 100 nanogrammi di ogni sonda a 20 microlitri di buffer di ibridazione 1,1 x per ottenere una soluzione di 22 microlitri di buffer di ibridazione 1 x. Quindi pipettare la miscela sul tessuto fissato, lasciando il tessuto intatto, e applicare delicatamente un coprioggetto.

Una piccola bolla d'aria che non entra in contatto con il tessuto non presenterà problemi, ma la presenza di ulteriori bolle richiede la riapplicazione del vetrino coprioggetto. Posizionare il vetrino sul lato piatto di un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius e coprirlo con della stagnola. Attendere cinque minuti, durante i quali è possibile preparare la camera umida aggiungendo tovaglioli di carta bagnati a una scatola per puntali.

Quindi rimuovere il vetrino. Avvolgere con cura il vetrino in parafilm stirato e trasferirlo in una camera umidificata composta da un tovagliolo umido all'interno di una scatola per puntali. Incubare il vetrino nella camera per quattro ore fino a tutta la notte a 30 gradi Celsius. Questa temperatura è adatta per sonde con contenuto basso di GC, ma per sonde con contenuto più elevato di GC potrebbe essere necessario effettuare alcune operazioni di risoluzione dei problemi variando le temperature di ibridazione.

Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione il film di parafilm e sollevare lentamente il coprioggetto da un angolo. Quindi lavare il vetrino tre volte in tampone 0,1 XSSC per 15 minuti per ogni lavaggio. Coprire il barattolo con della stagnola durante i lavaggi per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

Per sonde biotinilate lunghe, aggiungere rod domine avadon e lavare prima di procedere. In primo luogo, asciugare l'area intorno al tessuto e ricoprire il tessuto con 100 microlitri di soluzione bloccante. Quindi applicare delicatamente un nuovo coprioggetto senza intrappolare bolle d'aria.

Avvolgere nuovamente il vetrino con il paraffina. Quindi, incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per 30 minuti. In secondo luogo, al termine dell'incubazione, rimuovere il coprioggetto e asciugare delicatamente attorno al tessuto con un fazzoletto.

Quindi, applicare sul tessuto 100 microlitri di rumine avadon diluito da uno a 1000 in SBT. Procedere coprendo, avvolgendo e incubando il vetrino come fatto con il blocco. Infine, rimuovere con attenzione il coprioggetto e lavare il vetrino.

Eseguire tre lavaggi in quattro x SSC T, seguiti da tre lavaggi in 0,1 x SSC. Ogni passaggio di lavaggio deve durare almeno cinque minuti. Proseguendo con il protocollo, asciugare i vetrini tamponando via il tampone in eccesso senza toccare il tessuto.

Quindi posizionare il vetrino con il lato del tessuto rivolto verso l'alto in un luogo buio per 10-15 minuti o fino a quando l'umidità non sarà completamente evaporata. A questo punto, montare il vetrino utilizzando 11 microlitri di vector shield con DPI e abbassare con attenzione un coprioggetto non rivestito sigma coat. Se il mezzo non raggiunge tutti i bordi, aggiungere qualche microlitro in più di mezzo dal bordo e rimuovere con cura l'eccesso.

Quindi sigillare il vetrino con lo smalto per unghie e conservare il preparato in posizione verticale in un luogo buio durante l'asciugatura dello smalto, che di solito richiede almeno mezz'ora. Successivamente, conservare il preparato a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana e acquisire l'immagine del tessuto il prima possibile. Un insieme di brevi oligonucleotidi sintetizzati commercialmente, con coniugati fluorescenti, e una sonda più lunga biotinilata ottenuta mediante traduzione di Nick, sono stati ibridati tutti a cromosomi provenienti da diversi tipi di tessuto.

Utilizzando la metodologia descritta, la sonda per la ripetizione satellitare di 359 paia di basi di Drosophila Melanogaster ha riconosciuto un ampio blocco di diverse mega paia di basi sul cromosoma X e una regione molto più piccola sul cromosoma tre. Una sonda più lunga contro il satellite risponditore ha rilevato blocchi ripetitivi costituiti da un numero relativamente basso di copie ripetute, pari a circa 700. Pertanto, questo metodo consente la visualizzazione di blocchi satellitari molto piccoli.

Quando il passaggio del trattamento con soluzione ipotonica è stato raddoppiato nella durata fino a 10 minuti, la separazione dei cromatidi fratelli è aumentata notevolmente. Questa procedura può essere abbinata ad altri metodi, come la colorazione con anticorpi, al fine di rispondere a domande del tipo se determinate proteine della cromatina siano localizzate in sequenze specifiche.