Metodo semplice per DNA fluorescenza In Situ Ibridazione di cromosomi Squashed

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare l'ibridazione del DNA in situ per mappare sequenze eterocromatiche su cromosomi mitotici. Ciò si ottiene sezionando prima il cervello di larve di Drosophila terza in stella o un altro tessuto di interesse. Il secondo passo è fissare il fazzoletto su un vetrino coprioggetto.

Successivamente, il fazzoletto viene schiacciato tra il vetrino coprioggetto e un vetrino. Per preparare i cromosomi all'ibridazione, il passaggio finale consiste nell'ibridare brevi sonde oligo sintetizzate nel tessuto schiacciato. In definitiva, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per mostrare la localizzazione di sequenze complementari alle sonde oligo sui cromosomi.

Il vantaggio principale di questo metodo rispetto ai metodi esistenti è la sua semplicità. La maggior parte degli altri metodi di ibridazione cromosomica e C 2 comporta lavaggi con grandi quantità di forma ammide, che possono essere costosi e disordinati. Il nostro metodo non richiede lavaggi IDE, il che lo rende una tecnica più economica, pulita e veloce.

Sebbene questo metodo fornisca un modo semplice per mappare visibilmente le sequenze sui cromosomi somatici del cervello di drosophila, può anche essere utilizzato per mappare sequenze su altri tipi di cromosomi provenienti da diversi tessuti nei diversi organismi. Per ogni vetrino da realizzare, preparare quattro o cinque tessuti, ma non di più per le dissezioni cerebrali. Inizia selezionando le larve erranti del terzo stadio e raccogliendole in un drop di un XPBS.

Scegli fiale da raccogliere che non siano sovraffollate. Sotto il cannocchiale di dissezione, usa una pinzetta ultra sottile per afferrare i ganci della bocca e un altro paio per afferrare due terzi della lunghezza del corpo. Quindi tirare delicatamente i ganci della bocca per esporre il cervello, i gangli ventrali, le ghiandole salivari e parti del tratto digestivo.

Quindi, staccare il cervello e i gangli ventrali dagli altri tessuti e trasferirli in una gocciolina di un XPBT su una piastra di plastica. Per le dissezioni del testicolo nasia raccogliere il puy maschio di tre giorni. I puy di tre giorni hanno corpi gialli e occhi rossi.

Quelli con cuscinetti alari più piccoli sono maschi. Afferrare la pupa nella parte superiore dell'addome vicino alla regione toracica con un paio di pinzette e con un secondo paio di pinzette. Afferra la punta molto distale dell'addome, quindi estrai i testicoli a forma di lacrima.

Sono circondati da corpi adiposi che possono essere delicatamente scossi via, staccano eventuali parti esterne del corpo dai testicoli, il che impedirà un corretto schiacciamento e trasferiscono i testicoli in una goccia di un XPBT su una piastra pulita. Una volta raccolti tutti i tessuti, trattarli con una soluzione ipotonica per migliorare la separazione dei cromatidi fratelli. Nelle regioni cromatiche, trasferire i tessuti in una goccia di citrato di sodio allo 0,5% per 10 minuti.

Per ottenere questo effetto, la colchicina non è raccomandata perché può causare artefatti nella morfologia cromosomica. Ora, fissa i fazzoletti usando una pinzetta ultra fine. Trasferirli in una goccia da 20 microlitri di PFA al 2,5% appena prodotto in acido acetico al 45% su un vetrino coprioggetti pulito trattato con sigma coat, distanziare i tessuti in modo uniforme nel fissativo e incubarli per quattro minuti a temperatura ambiente, quindi procedere con lo schiacciamento dei vetrini, iniziare posizionando leggermente un vetrino rivestito di polilisina a faccia in giù sul fazzoletto e sul vetrino coprioggetti.

Lasciare che il vetrino coprioggetti aderisca alla parte inferiore del vetrino senza premere. Trattamento. I vetrini coprioggetti con rivestimento sigma aiutano a garantire che il tessuto di zucca rimanga sul vetrino dopo la rimozione del vetrino. Tuttavia, raramente il fazzoletto potrebbe rimanere attaccato al vetrino coprioggetto.

Durante questa fase, si consiglia di eseguire schiacciamenti di tessuto replicati. Ora capovolgi il vetrino e posizionalo in un pezzo di carta spessa piegato. Quindi, su una superficie stabile, premere con forza il pollice verso il basso sopra il vetrino coprioggetti.

Non premere in modo da far scorrere il coperchio o macchiare il tessuto. Una pressione molto decisa normalmente si traduce in cromosomi ben risolti all'interno del tessuto di zucca. Tuttavia, a volte, è possibile riscontrare variabilità nella qualità dei cromosomi come cromosomi incompleti, schiacciati o frammentati.

Quindi, ancora una volta, si consiglia di eseguire due o tre schiacciamenti di tessuto replicati. Trasferire il gruppo su un blocco di ghiaccio per alcuni minuti, quindi immergerlo nell'azoto liquido fino a quando l'azoto non smette di bollire o più a lungo Dopo aver rimosso il vetrino immediatamente prima che il tessuto si scongeli, utilizzare una lama di rasoio fresca per sollevare un angolo del vetrino coprioggetti. Rimuovendolo.

Fare attenzione a non graffiare il tessuto. Quindi posizionare rapidamente il vetrino in un barattolo di coplin riempito con etanolo al 100% e lasciare in ammollo per almeno cinque minuti. Rimuovere il vetrino, rimuovere l'etanolo in eccesso senza toccare il fazzoletto e lasciare asciugare il vetrino all'aria per un'ora.

I vetrini possono quindi essere conservati per settimane o mesi in una camera di essiccazione. Iniziare con l'aggiunta di 100 nanogrammi di ciascuna sonda a 20 microlitri di tampone di ibridazione 1,1 x per una soluzione di 22 microlitri di un tampone di ibridazione. Quindi pipettare la miscela sul fazzoletto fissato, lasciando intatto il fazzoletto e applicare delicatamente un vetrino coprioggetti.

Una piccola bolla d'aria che non entra in contatto con il tessuto non presenterà problemi, ma eventuali bolle in più, giustificano la riapplicazione del vetrino coprioggetto. Posiziona il vetrino sul lato piatto di un blocco termico a 95 gradi Celsius e coprilo con un foglio. Attendi cinque minuti durante i quali puoi preparare la camera di umidità aggiungendo tovaglioli di carta bagnati a una scatola di mance.

Quindi rimuovere il vetrino. Avvolgere con cura il vetrino in una paraforma tesa e trasferirlo in una camera umidificata composta da un asciugamano umido In una scatola di puntali, incubare il vetrino nella camera per quattro ore fino a una notte a 30 gradi Celsius. Questa temperatura funziona bene per le sonde a basso contenuto di GC, ma per le sonde con un contenuto di GC più elevato, potrebbe essere necessaria una risoluzione dei problemi con le temperature di ibridazione.

Dopo l'incubazione, rimuovere con cautela la pellicola para e sollevare lentamente il vetrino coprioggetto di un angolo. Quindi lavare il vetrino tre volte in tampone XSSC 0,1 per 15 minuti per lavaggio. Copri il barattolo con un foglio durante i lavaggi per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.

Per le sonde biotinilate lunghe, aggiungere avaria domine avadon e lavare prima di procedere. In primo luogo, asciugare l'area intorno al tessuto e coprire il tessuto con 100 microlitri di soluzione bloccante. Quindi applicare delicatamente un nuovo vetrino coprioggetti senza intrappolare le bolle.

Ancora una volta, avvolgi la diapositiva con param. Quindi incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per 30 minuti. In secondo luogo, dopo l'incubazione, rimuovere il vetrino coprioggetto e tamponare il fazzoletto con una salvietta.

Quindi sul tessuto, applicare 100 microlitri di uno a 1000 rumina avadon diluito in SBT. Proseguire coprendo, avvolgendo e incubando il vetrino come fatto con il blocco. Infine, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetto e lavare il vetrino.

Utilizzare tre lavaggi in quattro x SSC T, seguiti da tre lavaggi in 0.1 XSSC. Ogni fase di lavaggio deve durare almeno cinque minuti. Procedendo con il protocollo, asciugare i vetrini tamponando il tampone in eccesso senza toccare il tessuto.

Quindi posizionare il fazzoletto del vetrino con il lato rivolto verso l'alto in un luogo buio per 10-15 minuti o fino a quando l'umidità non si dissipa completamente. Ora, montare il vetrino utilizzando 11 microlitri di scudo vettoriale con DPI e abbassare con cautela su un vetrino coprioggetti non sigma. Se il mezzo non raggiunge tutti i bordi, applicare qualche altro microlitro di supporto dal bordo e rimuovere l'eccesso.

Quindi sigillare il vetrino coprioggetto con lo smalto per unghie e conservare il vetrino in posizione verticale in un luogo buio mentre lo smalto si asciuga, cosa che di solito richiede almeno mezz'ora. Quindi conservare il vetrino a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana e visualizzare il tessuto il prima possibile. Una serie di piccoli oligo sintetizzati commercialmente con coniugati fluorescenti e una sonda biotinilata più lunga realizzata da Nick Translation sono stati tutti ibridati con cromosomi di diversi tipi di tessuto.

Utilizzando la metodologia descritta, la sonda per la ripetizione della coppia di basi Drosophila Melanogaster 359 ha riconosciuto un grande blocco di coppie di megabasi multiple sull'x e una regione molto più piccola sul cromosoma tre. Una sonda più lunga contro il satellite di risposta ha rilevato blocchi di ripetizioni costituiti da un numero di copie ripetute relativamente basso, pari a circa 700. Pertanto, questo metodo consente la visualizzazione di blocchi satellitari molto piccoli.

Quando la fase di trattamento con soluzione ipotonica è stata raddoppiata in durata a 10 minuti, la separazione dei cromatidi fratelli è aumentata a est. Questa procedura può essere abbinata ad altri metodi, come la colorazione degli anticorpi, per rispondere a domande come alcune proteine della cromatina localizzate in sequenze specifiche.