Name: Metodo semplice per DNA fluorescenza In Situ Ibridazione di cromosomi Squashed (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Impara l'ibridazione in situ con DNA fluorescente per mappare sequenze eterocromatiche su cromosomi mitotici di Drosophila. Questo metodo semplice utilizza sonde oligonucleotidiche e microscopia a fluorescenza.

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Ringraziamo Zhaohua Irene Tang del Dipartimento di Scienze W. M. Keck per l'uso del suo microscopio ad epifluorescenza e il laboratorio Werren per aver donato Nasonia per le dissezioni. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da una borsa di studio NIH-NRSA (5F32GM105317-02) per l'AML.

1. Tissue Dissection e Fixation (60 min) <ol><li> Per cervelli Drosophila, 3 ° posto instar larve in una goccia di 1x PBS (tampone fosfato salino). Scegli grande 3 ° instar larve che sono attivamente strisciando da fiale o bottiglie che non sono sovraffollate. <ol><li> Utilizzare uno ultrafine paio pinzette per afferrare i ganci bocca e un altro paio pinzette per afferrare 2/3 per tutta la lunghezza del corpo (figura 1A, B). Tirare delicatamente i ganci bocca per esporre il cervello, gangli ventrale, ghiandole salivari e parte del tratto digerente larvale. Utilizzare le pinzette per separare il cervello e gangli ventrale (Figura 1A, B) dalle altre tessuti e posto in una goccia di 1x PBT (tampone fosfato salino con Tween) su un piatto di plastica Petri. </li></ol></li><li> Per Nasonia dissezioni testicolo, scegliere maschio pupe di 3 giorni di età (corpi giallo con gli occhi rossi). Maschio Nasonia hanno piccole lunghezze pad ala relative a females durante la fase di pupa (Figura 1C). <ol><li> Tenere la pupa in alto dell&#39;addome vicino alla regione toracica con una coppia pinzetta, e con l&#39;altra coppia pinzetta, afferrare la punta molto distale dell&#39;addome e tirare fuori i testicoli tear-forma-drop (saranno circondati da grasso corpo che può essere scosso delicatamente; Figura 1D). Staccare tutte le parti del corpo esterno dei testicoli, che impediscono una corretta schiacciamento, e posto in una goccia di 1x PBT su un piatto di plastica Petri. </li></ol></li><li> Per ogni diapositiva, sezionare un totale di quattro o cinque campioni di tessuto (es., Drosophila cervello larvali o testicoli Nasonia). NOTA: Più di cinque campioni porteranno a nuclei sovraffollate e cromosomi. </li><li> Facoltativamente, per raggiungere una certa separazione dei cromatidi fratelli nelle regioni eucromatiche di cromosomi mitotici, trattare il tessuto con una soluzione ipotonica: trasferire cervelli da 1x PBT a un calo dello 0,5% di sodio citrato per 5-10 (non più di 10) min. NOTA: Colchicina (un inibitore mitotico) può essere utile per aumentare il numero di figure mitotiche in metafase 11. Tuttavia, il suo utilizzo non è necessaria se si utilizzano molto grande larve sane, e anche indesiderabile perché può influenzare negativamente la risoluzione dei cromosomi, la diffusione e la morfologia. </li><li> Inserire una goccia (~ 20 microlitri) di soluzione fissativo (2,5% paraformaldeide in 45% di acido acetico) sulla superficie di un vetrino Sigmacote trattati pulita. NOTA: Preparare la soluzione fissativa fresca per ogni giorno di utilizzo. Soluzioni fissativo che vanno 1,8-3,7% paraformaldeide nel 45% di acido acetico per ottenere i migliori risultati per i pesci. Utilizzando tessuti diversi cervelli o testicoli, o adattare questo protocollo per immuno-FISH può richiedere la sperimentazione di diversi fissativi (per un elenco di diversi fissativi, vedi 12). </li><li> Trasferire accuratamente ciascun campione di tessuto dal buffer dissezione (1x PBT) nella goccia di fissativo con le pinzette ultrafini, Minimizing trasferimento di dissezione tampone nella soluzione fissativo. Posizionare i campioni di tessuto in modo che siano uniformemente distanziati l&#39;uno dall&#39;altro entro la goccia fissativo. Incubare i tessuti in fissativo per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare con cura una diapositiva faccia poli-lisina rivestite giù sul slittamento dei tessuti e la copertura. Non premere a questo punto, ma invece permettono ai due di contattare leggermente in modo che la polizza di copertura attacca sulla parte inferiore della diapositiva. Invertire la diapositiva in modo che il vetrino è in cima. </li><li> Panino lo slittamento scorrevole / tessuti / copertura all&#39;interno di un pezzo di carta piegato filtro. Su una superficie stabile, con il pollice, premere con fermezza verso il basso sulla posizione direttamente sopra il vetrino. Fare attenzione a non scorrimento laterale del vetrino (ciò causerà macchie del tessuto). </li><li> Immergere il vetrino / tessuti / fodera in azoto liquido (vedi apparecchio in figura 1E, F), e lasciate riposare fino a quando il Azoto ferma bollente (è più fine). Rimuovere il vetrino e immediatamente scattare fuori il vetrino con una lametta fresca sfogliando un angolo del vetrino verso l&#39;alto (evitare di graffiare il tessuto fissato con la lama di rasoio). <ol><li> Pre-raffreddamento della diapositiva / tessuti / copertura di slittamento su un blocco di ghiaccio secco, copertura scivolare fino, per 1-2 minuti prima sommergendo in azoto liquido contribuisce a prevenire le diapositive di cracking. </li></ol></li><li> Posizionare immediatamente il vetrino con il tessuto in una vaschetta Coplin piena di etanolo al 100% a temperatura ambiente e lasciare riposare per almeno 5 minuti (questo tempo può essere più lungo, se necessario). NOTA: Cold 100% etanolo potrebbe anche essere utilizzato. </li><li> Rimuovere il vetrino con il tessuto, liberano dal etanolo in eccesso con un Kimwipe (senza toccare il tessuto fisso), e lasciare il vetrino asciugare per 1 ora. <ol><li> Passare direttamente al punto 2 o mantenere le diapositive a secco in aria bassa umidità o in una camera di essiccazione per settimane anche mesi prima di eseguire l&#39;ibridazione. </li></ol></li></ol> Figura 1: (A) A 3 ° instar Drosophila larva (a destra), con le posizioni indicate per cui per afferrare i ganci bocca (indicato con *) e 2/3 fino in fondo le larve di sezionare il cervello; (Sinistra) uno schema di una larva una stessa fase di sviluppo, raffigurante la posizione relativa del cervello nella testa larvale. (B) Il cervello e gangli ventrale sezionato da un 3 ° instar Drosophila larva (a destra) e uno schema di questo tessuti (a sinistra). (C) 3-giorni-old pupa Nasonia allo stadio giallo occhi corpo-rossi. (D) Una coppia di testicoli sezionato da un vecchio pupa maschio Nasonia 3 giorni (a destra) con le posizioni che indica dove per afferrare la pupa al posteriore dell&#39;addome (indicato con *) ea metà strada sul corpo; (Sinistra) schematico raffigurante maschio e femmina erap pupe; pupe maschio può essere distinto da ali che non si estendono oltre il profilo sagittale (freccia nera), a differenza di femmine che hanno ali che si estendono oltre il profilo; la posizione relativa della coppia testis è mostrato in pupa maschile. (E) Apparecchiatura-una serie di graffette-e metodo (F) utilizzate per immergere i vetrini in un serbatoio di azoto liquido. Stringhe graffetta multipli possono essere utilizzati per immersione simultanea di più diapositive. 2. ibridazione in situ (30 min al giorno 1; 1 h-2,5 ore per lunghi sonde-giorno 2) <ol><li> Aggiungere 1 ml (100 ng) di ciascuna sonda a 20 ml di buffer di 1.1x ibridazione. Pipettare Sonda / tampone di ibridazione sulla superficie del tessuto fissa (evitare di toccare il tessuto). </li><li> Posizionare con cura un vetrino direttamente sul tampone di sonde / ibridazione, facendo in modo che la polizza di copertura è centrata direttamente sopra il tessuto. Il buffer dovrebbe migrare a thdi e bordo esterno del vetrino, senza lasciare bolle d&#39;aria. NOTA: Le piccole bolle che non contattano il tessuto non pongono problemi alla procedura. Rimuovere grandi bolle sollevando attentamente un angolo del vetrino e con attenzione cadere indietro sul vetrino. </li><li> Posizionare il vetrino slittamento / tessuto / copertura sulla superficie di un blocco di pre-riscaldato a 95 ° C (coperchio scivolare). Coprire con un grosso pezzo di foglio di alluminio per evitare l&#39;esposizione alla luce. Sia la diapositiva incubare a 95 ° C per 5 min. NOTA: Un blocco tipico calore con fori per tubi può essere capovolto per fornire una superficie piana su cui posizionare il vetrino / tessuti / copertura di slittamento. </li><li> Rimuovere il vetrino, lasciandolo raffreddare leggermente finché è caldo al tatto. Avvolgere attenzione un pezzo di Parafilm allungato intorno vetrino per sigillare il liquido sottostante. </li><li> Posizionare il vetrino sigillato all&#39;interno di una camera di umidità e posizionare la camera in un incubatore preriscaldato a 30 ° C. Incubare a 30 ° C per 4 ore a tutta la notte.<ol><li> Creare una camera umida da una scatola di punta vuota o contenitori Tupperware con coperchio con Kimwipes inumidite o tovaglioli di carta posti sul fondo. NOTA: Le sonde oligo DNA a singolo filamento sono stati progettati per essere 28-33 basi per raggiungere una temperatura di fusione teorica (T m) di 45-47 ° C. Questi lunghezza e T m intervalli riflettono il fatto che molte sequenze ripetitive che abbiamo studiato sono AT-ricco e quindi hanno bassissimo contenuto GC. Sonde più lunghe probabilmente hanno valori più elevati m T; ciò può comportare superiore sfondo ibridazione alla temperatura di ibridazione standard 30 ° C. Così, alcuni di risoluzione dei problemi con le temperature di ibridazione può essere richiesto per ottenere i migliori risultati. Per trovare la migliore temperatura di ibridazione, aumento (o diminuzione) la temperatura di 5 ° C, in modo incrementale. </li></ol></li><li> Rimuovere con attenzione il Parafilm dalla diapositiva e poi rimuovere con attenzione il vetrino lentamente sollevando un angolo. Wash il vetrino tre volte per 15 minuti ogni lavaggio in tampone SSC 0.1x. Coprire la vaschetta Coplin con un foglio di alluminio durante i lavaggi per ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Se non si usa una lunga sonda biotinilata, passare al punto 2.8. <ol><li> Se si utilizza una sonda lunga biotinilato, asciugare la zona attorno il tessuto con un Kimwipe, facendo attenzione a non toccare il tessuto stesso. Mettere 100 ml di soluzione bloccante sopra il tessuto e coprire delicatamente con un coprioggetto, avendo cura di evitare bolle di cattura. Avvolgere il vetrino su vetrino con Parafilm e posto a 37 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il vetrino e asciugare intorno il tessuto con un Kimwipe. Dispensare 100 l di rodamina-avidina diluito 1: 1000 in SBT su tessuto e coprire delicatamente con un coprioggetto, avendo cura di evitare di intrappolare bolle. Avvolgere il vetrino su vetrino con Parafilm e posto a 37 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere con attenzione il vetrino e lavare il vetrino 3 volte per 5 minuti ciascuno in 4x SSCT e poi3 volte per 5 minuti ciascuno in 0.1x SSC. NOTA: diapositive possono essere lavati per periodi di tempo più lunghi. </li></ol></li><li> Rimuovere il vetrino e asciugare intorno il tessuto con un Kimwipe asciutto per rimuovere il tampone in eccesso (evitare di toccare il tessuto). Posizionare il lato tessuto diapositiva in un luogo buio per 10-15 minuti o fino a quando l&#39;umidità si dissolve completamente. </li><li> Dispensare 11 ml di mezzo di montaggio Vectashield (con 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole-DAPI) sul tessuto. Posizionare accuratamente un coprioggetto pulito (non trattato con Sigmacote) direttamente sopra il centro del mezzo e tessuti di montaggio. Il mezzo di montaggio dovrebbe migrare lentamente verso l&#39;esterno verso i bordi del vetrino. NOTA: Se il mezzo di montaggio non riesce a raggiungere il bordo del vetrino su tutti i lati, poi un ulteriore 1-2 ml di mezzo di fissaggio può essere applicato a una posizione sul bordo del vetrino per riempire il volume necessario. In questo caso, assicurarsi di asciugare ogni eccesso di terreno dalla superficie di scorrimento primatenuta. </li><li> Sigillare i bordi del vetrino con smalto. Evitare la pittura lo smalto sul campione di tessuto. </li><li> Posizionare il vetrino in posizione verticale in un luogo buio e lasciare il chiodo smalto asciutto fino a completa dura (di solito 30 minuti o più). A questo punto, il tessuto immagine o conservare a -20 ° C per 1 settimana per l&#39;imaging tardi. </li></ol> Buffer / Soluzione Ricette 10x PBS <ul><li> 80 g NaCl </li><li> 2,0 g KCl </li><li> 14,4 g Na 2 HPO 4 </li><li> 2,4 g KH 2 PO 4 </li><li> pH a 7,4, H 2 O a 1 L </li></ul> 1x PBT <ul><li> 5 ml 10x PBS </li><li> 45 ml H 2 O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 20x SSC <ul><li> 175,3 g NaCl </li><li> 88.2 g Na citrato </li><li> in 800 ml H 2 O </li><li> pH 7, H 2 O a 1 L </li></ul> 4x SSCT <ul><li> 200 ml 20x SSC </li><li> 799 ml H 2 </sub&gt; O </li><li> 0,1% Tween 20 </li></ul> 0.1x SSC <ul><li> 5 ml 20x SSC </li><li> 995 ml H 2 O </li></ul> Mix di ibridazione (20 ml; modificato da 11) <ul><li> 10 microlitri formammide </li><li> 4 ml 50% destrano solfato </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 4 microlitri H 2 O </li></ul> SBT 8 (10 ml) <ul><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 0,01 g albumina sierica bovina (BSA) </li><li> 10 microlitri Tween 20 </li><li> 7,9 ml H 2 O </li></ul> Soluzione Blocco 8 (10 ml) <ul><li> 0,3 g BSA </li><li> 10 microlitri Tween 20 </li><li> 2 ml 20x SSC </li><li> 8 ml H 2 O </li></ul> Soluzione fissativa con paraformaldeide (1 ml) <ul><li> 393,75 ml H 2 O (aggiungere acqua prima) </li><li> 450 ml di acido acetico glaciale </li><li> 156.25 microlitri 16% paraformaldeide </li></ul>

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<li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234(2009).</li>
<li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+l%281%29zw10+gene+product%2C+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation%2C+is+redistributed+at+anaphase+onset%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li>
<li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li>
<li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSR+%28paternal+sex+ratio%29+chromosomes%3A+the+ultimate+selfish+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi finanziario o di altro tipo.

ISH DNA è spesso utilizzato per mappare le sequenze specifiche per i cromosomi. Abbiamo descritto un metodo semplice per ISH DNA ottimizzato per alto numero di copie, sequenze eterocromatiche. Invece di utilizzare lavaggi in una soluzione di formammide, che è un requisito in altri protocolli ISH DNA esistenti, poniamo vetrini montati tissutale direttamente su un blocco di pre-riscaldata per denaturare il DNA. Questo metodo aggira l&#39;uso di grandi quantità di formammide. Un passo fondamentale per la produzione di segn...

DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Sonde alle regioni a copia singola all&#39;interno euchromatin possono essere generati attraverso una manciata di approcci, tra cui nick-traduzione o end-etichettatura dei prodotti lunghi di DNA 1,2 e l&#39;incorporazione di deoxygenin (DIG) nucleotidi -attached e il loro riconoscimento attraverso una grande varietà di anticorpi gruppo-coniugato 1-3. Visualizzazione di sequenze eucromatiche in pochi o solo numero copia richiede l&#39;uso di singole, grandi sonde ad alta attività specifica o un cocktail di più, sonde minori che aumentano insieme il segnale. Al contrario, le sequenze altamente ripetitive trovano in heterochromatin, come DNA satellite, sono bersagli facili per ISH DNA perché normalmente esistono come decine di migliaia di ripetizioni raggruppati in regioni cromosomiche singole note come blocchi. Elementi trasponibili possono anche esseretrovata ad alti numeri di copia presso distinto cromosomica loci 2. In questi casi, singole sonde con bassa attività specifica può effettivamente etichettare sequenze eterocromatiche a causa della loro ibridazione in più siti. Sonde a sequenze ripetitive possono essere sintetizzati oligonucleotidi commercialmente come brevi (30-50 bp) e coniugati chimicamente con qualsiasi più gruppi fluorescenti differenti. Mappatura sequenze ripetitive all&#39;interno heterochromatin utilizzando le tecnologie di sequenziamento del genoma-è difficile a causa di problemi incontrati in impalcature edili all&#39;interno di blocchi satellitari altamente ripetitive 4-6,7. Attualmente, ISH si pone come il modo più efficace di mappare queste sequenze a livello sub-cromosoma. Questa strategia è importante per la mappatura gran numero di sequenze ripetitive che vengono scoperte da studi del genoma e del trascrittoma di sequenziamento in corso. L&#39;efficienza e la facilità di mappatura sequenze ripetute sui cromosomi montati scorrevoli sarebbero Greatly rafforzata da un protocollo semplificato per ISH DNA. Per esempio, i protocolli esistenti per ISH DNA coinvolgono diversi lavaggi di tessuti ibridizzati in soluzione formammide 2,8, aggiungendo così sostanzialmente il tempo necessario per le sequenze di mappatura e produrre anche grandi quantità di rifiuti chimici per questa costosa reagente. Qui si descrive un metodo di revisione ISH DNA che aggira la necessità di lavaggi formammide e utilizza attrezzature di laboratorio di base e reagenti. Questo metodo è stato originariamente progettato per la rapida mappatura altamente ripetitive sequenze di DNA in regioni eterocromatiche di neuroblasti larvali Drosophila utilizzando oligonucleotidi sintetizzati in commercio che coniugate con coloranti fluorescenti. Tuttavia, questo metodo funziona anche per la mappatura sequenze ripetute utilizzando sonde grandi sintetizzati attraverso altri mezzi e 9,10 per diversi tipi di tessuto e cromosomi diversi. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per mappare le sequenze eucromatiche utilizzando più o multiple sonde brevi all&#39;interno della sequenza euchromatic di interesse.

<table><tbody><tr><td>Vetrini rivestiti in poli-L-lisina (possono essere utilizzati anche vetrini normali)</td><td>Pinzette Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafini (calibro 5)</td><td>Vetrini coprioggetti Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm Trattato</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote per immersione per 15 secondi, asciugando e rimuovendo tutte le tracce di Sigmacote in modo che il vetrino sia chiaro</td></tr><tr><td>Carta da filtro Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr>Carta <td></td><td></td><td></td><td>oleata di paraffina</td></tr><tr><td>Blocco termico con termometro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td></td><td></td><td></td>a secco</tr><tr><td>Lamette da</td><td></td><td></td><td></td>barba</tr><tr><td>Camera di umidità Scatola</td><td></td><td></td><td>vuota per puntali per pipette o Tupperware, foderata con salviette di carta inumidite o</td></tr><tr><td>barattoli</td><td></td> Kimwipes Coplin<td></td><td>con scanalature per vetrini</td></tr><tr><td>Foglio di</td><td></td><td></td><td></td>alluminio</tr><tr><td>Pipette Pasteur Provette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>per microfuge da 1,5 ml</td></tr><tr><td>Smalto</td><td></td><td></td><td>per unghie Micropipetta P20 trasparente o colorata</td></tr><tr><td>e punte</td><td></td><td></td><td></td>in plastica</tr><tr><td>Graffette</td><td></td><td></td><td>20 - 25 graffette metalliche standard collegate per formare a chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagenti</td></tr><tr><td>16% paraformaldeide di grado EM</td><td>Reagenti</td><td></td><td></td>per microscopia elettronica</tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td><td></td>liquido</tr><tr><td>100% Etanolo, grado</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr> chimico<td colspan="4">Sintetizzato commercialmente, marcato in fluorescenza oligo</td></tr><tr><td>Sonda biotinilata lunga</td><td>Invitrogen; Passaggi alternativi 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>es., nick tradotto e biotinilato con BioNick di Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Passaggi alternativi 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>per il rilevamento di una sonda biotinilata lunga</td></tr><tr><td>Tampone di ibridazione</td><td>Ricetta sopra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Ricetta sopra</td><td></td><td>soluzione salina-citrato di sodio + Tween</td></tr><tr><td>0,1x SSC</td><td>Ricetta sopra</td><td></td><td>soluzione salino-sodio citrato</td></tr><tr><td>Ricetta</td><td>sopra</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Ricetta sopra</td><td></td><td>SSC, albumina sierica bovina, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Ricetta sopra</td><td></td><td>soluzione salina tamponata con fosfato + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td>Soluzione ipotonica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>citrato di sodio allo 0,5% in H2O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield con vettore DAPI</td><td> laboratori</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodo semplice per dna fluorescenza<em&gt; in situ</em&gt; ibridazione di cromosomi squashed

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

DNA ibridazione in situ (ISH DNA) è un metodo comunemente utilizzato per le sequenze di mappatura a specifiche regioni cromosomiche. Questo approccio è particolarmente efficace per la mappatura delle sequenze altamente ripetitive alle regioni eterocromatiche, dove approcci computazionali affrontare sfide proibitive. Qui si descrive un protocollo semplificato per ISH DNA che aggira lavaggi formammide che sono passi standard in altri protocolli ISH DNA. Il nostro protocollo è ottimizzato per l&#39;ibridazione con brevi singole sonde filamento di DNA che portano coloranti fluorescenti, che segnano in modo efficace le sequenze di DNA ripetute all&#39;interno di regioni cromosomiche eterocromatiche tutta una serie di diversi tipi di tessuto insetto. Tuttavia, le applicazioni possono essere estese da usare con sonde più grandi e la visualizzazione di sequenze singola copia (non ripetitivi) DNA. Dimostriamo questo metodo mappando diverse sequenze ripetitive diversi di cromosomi schiacciate da Drosophila melanogaster cellule neurali e Nasoniavitripennis spermatociti. Mostriamo modelli di ibridazione sia per le piccole, le sonde sintetizzati commercialmente e per una sonda più grande per il confronto. Questa procedura utilizza semplici forniture di laboratorio e reagenti, ed è ideale per gli investigatori che hanno poca esperienza con l&#39;esecuzione di ISH DNA.

Per illustrare questo metodo, si ibridati una serie di piccoli oligonucleotidi sintetizzati in commercio che sono stati modificati chimicamente con coniugati fluorescenti (Figura 2) e una sonda più biotinilato (fatta attraverso la traduzione nick di un prodotto di PCR; Figura 2B), ai cromosomi da diversi tessuti differenti tipi (vedi tabella 1). Le sequenze bersaglio inclusi ripetizioni satelliti situati in pericentromeriche (eterocromatiche) regioni dei cromosomi mitot...

Qui, presentiamo un metodo semplice per eseguire l'ibridazione in situ del DNA a fluorescenza (DNA ISH) per visualizzare sequenze eterocromatiche ripetitive su cromosomi montati su vetrini. Il metodo richiede un numero minimo di reagenti ed è versatile per l'uso con sonde corte o lunghe, tessuti diversi e per la rilevazione con segnali basati sulla fluorescenza o non sulla fluorescenza.

Metodo semplice per DNA fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione di cromosomi Squashed

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare l'ibridazione in situ del DNA per mappare le sequenze eterocromatiche sui cromosomi mitotici. Questo viene ottenuto innanzitutto dissezionando i cervelli di larve di drosophila di terzo stadio, oppure un altro tessuto di interesse. Il secondo passaggio consiste nel fissare il tessuto su un vetrino coprioggetto.Successivamente, il tessuto viene schiacciato tra il coprioggetto e un vetrino. Per preparare i cromosomi all'ibridazione, l'ultimo passaggio consiste nell'ibridare brevi sonde oligonucleotidiche sintetizzate al tessuto schiacciato. Infine, si utilizza la microscopia a fluorescenza per mostrare la localizzazione delle sequenze complementari alle sonde oligonucleotidiche sui cromosomi.Il principale vantaggio di questo metodo rispetto ai metodi esistenti è la sua semplicità. La maggior parte degli altri metodi di ibridazione cromosomica e C due prevede lavaggi con grandi quantità di formammide, che può essere costosa e difficoltosa da gestire. Il nostro metodo non richiede lavaggi con formammide, risultando così una tecnica più economica, pulita e rapida.Sebbene questo metodo fornisca un modo semplice per mappare visivamente le sequenze sui cromosomi somatici dei cervelli di drosophila, può anche essere utilizzato per mappare sequenze su altri tipi di cromosomi provenienti da diversi tessuti in organismi diversi. Per ogni vetrino da preparare, si raccomanda di preparare quattro o cinque tessuti, ma non di più per le dissezioni cerebrali. Iniziare selezionando larve di terzo stadio vaganti e raccogliendole in una goccia di 1x PBS.Scegliere provette da cui prelevare in cui non vi sia sovraffollamento. Sotto la lente di dissezione, utilizzare pinzette ultrasottili per afferrare i ganci boccali e un altro paio di pinzette per afferrare il corpo a due terzi della sua lunghezza. Quindi tirare delicatamente i ganci boccali per esporre il cervello, i gangli ventrali, le ghiandole salivari e parti del tratto digestivo.Successivamente, rimuovere con pinzette il cervello e i gangli ventrali dai tessuti circostanti e trasferirli in una goccia di XPBT su una piastra di plastica. Per le dissezioni dei testicoli di nasia, raccogliere maschi di puy di tre giorni. I puy di tre giorni hanno il corpo giallo e gli occhi rossi.Quelli con le espansioni alari più piccole sono maschi. Afferrare la pupa nella parte superiore dell'addome, vicino alla regione toracica, con una pinzetta e, con una seconda pinzetta, prendere l'estremità più distale dell'addome, quindi estrarre i testicoli di forma ovale.Sono circondati da corpi adiposi che possono essere delicatamente rimossi agitando, staccare tutte le parti esterne dai testicoli, il che impedirà un corretto schiacciamento, e trasferire i testicoli in una goccia di XPBT 1x su una piastra pulita. Una volta raccolti tutti i tessuti, trattarli con una soluzione ipotonica per migliorare la separazione delle cromatidi sorelle. Nelle regioni e cromatiniche, trasferire i tessuti in una goccia di citrato di sodio allo 0,5% per 10 minuti.Per ottenere questo effetto, non si consiglia la colchicina perché può causare artefatti nella morfologia dei cromosomi. Fissare ora i tessuti utilizzando pinzette ultrafini. Trasferirli in una goccia di 20 microlitri di PFA al 2,5% appena preparato in acido acetico al 45% su un'ampolla pulita trattata con sigma coat, distribuire i tessuti uniformemente nel fissativo e incubare per quattro minuti a temperatura ambiente; quindi procedere con la schiacciatura delle ampolle, iniziando col posizionare delicatamente un vetrino ricoperto di polilisina, capovolto, sul tessuto e sull'ampolla.Lasciare che il coprioggetto aderisca alla parte inferiore del vetrino senza premere. Trattare i coprioggetti con sigma coat aiuta a garantire che il tessuto schiacciato rimanga sul vetrino dopo la rimozione del coprioggetto. Tuttavia, raramente il tessuto potrebbe rimanere attaccato al coprioggetto. Durante questo passaggio, si consiglia di eseguire schiacciamenti del tessuto in replicato. Ora capovolgere il vetrino e posizionarlo all'interno di un foglio di carta spessa piegato. Successivamente, su una superficie stabile, premere con decisione verso il basso, utilizzando il pollice, direttamente sopra il coprioggetto. Non premere in modo da far scivolare il vetrino, altrimenti il tessuto verrà sfregato. Una pressione molto ferma di solito produce cromosomi ben definiti all'interno del preparato schiacciato. Tuttavia, a volte si può riscontrare una variabilità nella qualità dei cromosomi, come cromosomi incompleti, schiacciati o frammentati.Pertanto, raccomandiamo nuovamente di eseguire due o tre schiacciamenti del tessuto in replicato. Trasferire l'assemblaggio su un blocco di ghiaccio per alcuni minuti, quindi immergerlo in azoto liquido fino a quando l'azoto smette di bollire o per un tempo più lungo. Dopo aver rimosso immediatamente il vetrino prima che il tessuto si scongeli, utilizzare una lama di rasoio nuova per sollevare un angolo del coprioggetto, rimuovendolo così.Attenzione a non graffiare il tessuto. Quindi posizionare rapidamente il vetrino in un barattolo Coplin riempito con etanolo al 100% e lasciare in ammollo per almeno cinque minuti. Rimuovere il vetrino, asciugare l'eccesso di etanolo senza toccare il tessuto e lasciare asciugare all'aria per un'ora.I vetrini possono quindi essere conservati per settimane o mesi in una camera a disidratazione. Iniziare aggiungendo 100 nanogrammi di ogni sonda a 20 microlitri di buffer di ibridazione 1,1 x per ottenere una soluzione di 22 microlitri di buffer di ibridazione 1 x. Quindi pipettare la miscela sul tessuto fissato, lasciando il tessuto intatto, e applicare delicatamente un coprioggetto.Una piccola bolla d'aria che non entra in contatto con il tessuto non presenterà problemi, ma la presenza di ulteriori bolle richiede la riapplicazione del vetrino coprioggetto. Posizionare il vetrino sul lato piatto di un blocco riscaldante a 95 gradi Celsius e coprirlo con della stagnola. Attendere cinque minuti, durante i quali è possibile preparare la camera umida aggiungendo tovaglioli di carta bagnati a una scatola per puntali.Quindi rimuovere il vetrino. Avvolgere con cura il vetrino in parafilm stirato e trasferirlo in una camera umidificata composta da un tovagliolo umido all'interno di una scatola per puntali. Incubare il vetrino nella camera per quattro ore fino a tutta la notte a 30 gradi Celsius. Questa temperatura è adatta per sonde con contenuto basso di GC, ma per sonde con contenuto più elevato di GC potrebbe essere necessario effettuare alcune operazioni di risoluzione dei problemi variando le temperature di ibridazione.Dopo l'incubazione, rimuovere con attenzione il film di parafilm e sollevare lentamente il coprioggetto da un angolo. Quindi lavare il vetrino tre volte in tampone 0,1 XSSC per 15 minuti per ogni lavaggio. Coprire il barattolo con della stagnola durante i lavaggi per ridurre al minimo l'esposizione alla luce.Per sonde biotinilate lunghe, aggiungere rod domine avadon e lavare prima di procedere. In primo luogo, asciugare l'area intorno al tessuto e ricoprire il tessuto con 100 microlitri di soluzione bloccante. Quindi applicare delicatamente un nuovo coprioggetto senza intrappolare bolle d'aria.Avvolgere nuovamente il vetrino con il paraffina. Quindi, incubare il vetrino a 37 gradi Celsius per 30 minuti. In secondo luogo, al termine dell'incubazione, rimuovere il coprioggetto e asciugare delicatamente attorno al tessuto con un fazzoletto.Quindi, applicare sul tessuto 100 microlitri di rumine avadon diluito da uno a 1000 in SBT. Procedere coprendo, avvolgendo e incubando il vetrino come fatto con il blocco. Infine, rimuovere con attenzione il coprioggetto e lavare il vetrino.Eseguire tre lavaggi in quattro x SSC T, seguiti da tre lavaggi in 0,1 x SSC. Ogni passaggio di lavaggio deve durare almeno cinque minuti. Proseguendo con il protocollo, asciugare i vetrini tamponando via il tampone in eccesso senza toccare il tessuto.Quindi posizionare il vetrino con il lato del tessuto rivolto verso l'alto in un luogo buio per 10-15 minuti o fino a quando l'umidità non sarà completamente evaporata. A questo punto, montare il vetrino utilizzando 11 microlitri di vector shield con DPI e abbassare con attenzione un coprioggetto non rivestito sigma coat. Se il mezzo non raggiunge tutti i bordi, aggiungere qualche microlitro in più di mezzo dal bordo e rimuovere con cura l'eccesso.Quindi sigillare il vetrino con lo smalto per unghie e conservare il preparato in posizione verticale in un luogo buio durante l'asciugatura dello smalto, che di solito richiede almeno mezz'ora. Successivamente, conservare il preparato a meno 20 gradi Celsius per un massimo di una settimana e acquisire l'immagine del tessuto il prima possibile. Un insieme di brevi oligonucleotidi sintetizzati commercialmente, con coniugati fluorescenti, e una sonda più lunga biotinilata ottenuta mediante traduzione di Nick, sono stati ibridati tutti a cromosomi provenienti da diversi tipi di tessuto.Utilizzando la metodologia descritta, la sonda per la ripetizione satellitare di 359 paia di basi di Drosophila Melanogaster ha riconosciuto un ampio blocco di diverse mega paia di basi sul cromosoma X e una regione molto più piccola sul cromosoma tre. Una sonda più lunga contro il satellite risponditore ha rilevato blocchi ripetitivi costituiti da un numero relativamente basso di copie ripetute, pari a circa 700. Pertanto, questo metodo consente la visualizzazione di blocchi satellitari molto piccoli.Quando il passaggio del trattamento con soluzione ipotonica è stato raddoppiato nella durata fino a 10 minuti, la separazione dei cromatidi fratelli è aumentata notevolmente. Questa procedura può essere abbinata ad altri metodi, come la colorazione con anticorpi, al fine di rispondere a domande del tipo se determinate proteine della cromatina siano localizzate in sequenze specifiche.

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