Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

L'obiettivo generale del seguente esperimento è distinguere tra mRNA altamente tradotti e mRNA scarsamente tradotti mediante l'immobilizzazione e la separazione dei poliribosomi. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo cicloeide alle cellule per inibire la traslocazione dei ribosomi e la traduzione dell'RNA. Come secondo passaggio, i lisati ottenuti dalle cellule trattate vengono caricati su un gradiente di saccarosio e sottoposti a ultracentrifugazione per separare i poliribosomi accumulati in base alle loro masse.

Successivamente, il gradiente viene suddiviso in frazioni uguali per separare i trascritti tradotti in modo elevato da quelli tradotti in modo scarso nel passaggio finale. Viene utilizzato R-T-Q-P-C-R per rilevare la presenza degli mRNA di interesse all'interno di ciascuna frazione. In definitiva, il ribosome profiling può essere impiegato per rilevare variazioni nella traduzione globale nonché specifica dell'mRNA in risposta a diversi stress fisiologici e patofisiologici.

PolyOne profiling può rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia molecolare e cellulare, come ad esempio quali mRNA vengono selezionati e tradotti durante lo stress S, e come ciò permetta alle cellule di adattarsi a queste condizioni. Per dimostrare questa procedura, si prende come esempio la dottoressa Dar, una studentessa universitaria del laboratorio. Per utilizzare un generatore automatico di gradienti per preparare un gradiente al saccarosio, iniziare accendendo il generatore di gradienti e livellando la piastra che ospiterà i gradienti. Una volta livellata la piastra, fare clic su "fatto".

Quindi, per selezionare il programma a gradiente, aprire il menu grad e selezionare lista. Fare clic su SW 41 e scorrere l'elenco fino a visualizzare il programma 10-50% di gradiente in 11 passaggi e premere Usa. Successivamente, inserire un tubo conico per ultracentrifuga SW 41 nel blocco segnacampioni e utilizzare il pennarello fine fornito per tracciare una linea sul tubo lungo il gradino superiore del blocco.

Posizionare i tubi in un apposito rack su una superficie stabile, quindi collegare le due cannule fornite a due siringhe da 10 millilitri. Pipettare su e giù alcune volte acqua distillata calda contenente RNA nella soluzione di attivazione per lavare le siringhe. Dopo aver rimosso completamente ogni traccia d'acqua, riempire una delle siringhe con saccarosio al 10% più ciclodestrina e inserire la cannula nella parte inferiore del tubo per ultracentrifuga.

Dispensare delicatamente la soluzione fino a superare leggermente il segno fatto sul tubo. Fare attenzione a evitare bolle d'aria. Quindi riempire la seconda siringa con saccarosio al 50% più ciclodestrina e rimuovere il liquido in eccesso dal tubo con un panno pulito.

Utilizzare la cannula per inserire delicatamente la soluzione di saccarosio al 50% nel tubo, fermandosi quando la soluzione raggiunge il livello del segno, quindi rimuovere rapidamente e con movimento uniforme la cannula. La soluzione di saccarosio al 10% dovrebbe salire formando un menisco nella parte superiore del tubo. Successivamente, inclinare leggermente il tubo dell'ultracentrifuga per spostare eventuali bolle d'aria e inserire il tappo utilizzando una micropipetta per rimuovere qualsiasi liquido in eccesso presente nel serbatoio del tappo.

Posizionare i tubi sul generatore di gradiente e quindi premere il pulsante di esecuzione. Osservare che la piastra si inclinerà all'angolo specificato. Attendere cinque secondi, quindi inizieranno le rotazioni per formare il gradiente.

Dopo circa due minuti, la macchina emetterà un segnale acustico che indica il completamento della formazione del gradiente. Trasferire delicatamente le provette su un portaprovette e rimuovere rapidamente i tappi con un unico movimento verso l'alto per evitare di disturbare il gradiente. Quindi caricare delicatamente un'uguale quantità di 260 unità di lisato cellulare precedentemente preparato su ciascun gradiente di saccarosio e centrifugare le provette per un'ora e mezza a 260.343 ×g e a quattro gradi Celsius in un ultracentrifugo.

Per configurare lo strumento per la frazionatura a gradiente, iniziare accendendo lo spettrofotometro. Successivamente, fare clic due volte sull'icona della cartella e poi due volte sulla freccia di ritorno per tornare alla schermata iniziale e impostare il raccoglitore di frazioni sul metodo PolyZone, in modo da assicurare che la valvola del raccoglitore di frazioni sia impostata sullo scarico. Fare clic sulla freccia rivolta verso l'icona del cestino e quindi posizionare un matraccio MIA da 250 millilitri contenente acqua distillata sotto il tubo di raccolta degli scarti.

Ora selezionare le seguenti impostazioni sul registratore grafico: regolare la manopola di sensibilità per impostare lampada e ottica, il filtro di riduzione del rumore su 1,5, la manopola del separatore dei picchi su off, la velocità del grafico su 30 centimetri all'ora e la manopola di regolazione della linea di base, situata in alto sull'unità dello spettrofotometro, su apertura massima. Successivamente, inserire siringa e cilindro nella pompa e utilizzare le viti fornite e la chiave esagonale per fissarli saldamente al loro posto.

Utilizzare il comando rev a velocità elevata per riempire la siringa con la soluzione di lavaggio. Successivamente, posizionare la pompa in posizione verticale e utilizzare il comando forward per espellere l'aria attraverso il tubicino. Poi, installare un tubo per ultracentrifuga riempito con acqua priva di RNA nel supporto e quindi perforare il tubo con la cannula fino a quando sono visibili i due segni neri.

Il foro di erogazione si trova tra le due marcature. Avviare la pompa per siringa in modalità manuale diretta a 6,0 millilitri al minuto. Quando la soluzione di lavaggio riempie un terzo del tubo, passare alla velocità variabile con una portata di 1,0 millilitro al minuto.

Ora ruotare la manopola di regolazione della linea di base sullo spettrofotometro fino a quando la tensione sul grafico non raggiunge lo zero. L'acqua inizierà a uscire dal tubo di scarico nel matraccio el Mya. Successivamente, impostare la sensibilità desiderata a 1,0 au.

Dopo aver regolato la sensibilità, premere il pulsante "baseline" e ruotare la manopola di compensazione del registratore per impostare la linea di base al 10% della scala del registratore grafico. Una volta ottenuta una linea di base stabile, spegnere l'interruttore della pompa e la manopola della velocità del grafico. Dopo che la pompa si è arrestata, posizionarla sulla posizione "rev" per recuperare la soluzione di chasing finché non raggiunge il primo segno sulla cannula foratrice.

Quindi rimuovere il tubo della centrifuga, disperdere eventuali bolle nella cannula con una piccola quantità di soluzione di spinta e rimuovere qualsiasi residuo di acqua che potrebbe essersi accumulato dalla cella di flusso per frazionare il gradiente. Successivamente, installare il tubo della centrifuga contenente il gradiente di saccarosio nel supporto e perforare il tubo con la cannula. Quindi posizionare dieci microtubi da due millilitri nei vani da due a undici del vassoio del frazionatore e un tubo per i rifiuti nel vano uno, in modo che i tappi non sporgano verso l'alto.

Impostare la manopola di controllo della pompa su manuale e la portata della pompa a siringa su 6,0 millilitri al minuto. Quindi premere il pulsante di riproduzione sul collettore di frazioni non appena il braccio raggiunge il primo tubo. Premere il pulsante di pausa per posizionare il braccio e aprire la valvola di erogazione delle frazioni.

Quindi utilizzare il comando di avanzamento per avviare la pompa e monitorare la penna del registratore grafico. Quando la penna inizia a deviare verso l'alto, indicando che il campione sta passando attraverso la cella di flusso, sostituire rapidamente il tubo di scarto con il tubo numero uno. Successivamente, quando viene raccolta la prima goccia, passare rapidamente i comandi a avvio remoto, arresto e flusso di 1,0 millilitro al minuto e premere play per consentire all'interfaccia del collettore di frazioni di raccogliere frazioni da un millilitro ogni minuto.

Infine, dopo che la soluzione di caccia blu è entrata nell'ultimo tubo, premere stop. Il profiling PolyZone è una tecnica fondamentale per dimostrare il coinvolgimento specifico del PD CD4 nella traduzione mediata da IRA. Ad esempio, in questo esperimento, le cellule HEC 2 93 sono state transfezionate in modo transitorio per ridurre i livelli endogeni di PDC D quattro, e successivamente sottoposte ad analisi di profiling PolyZone.

La riduzione dei livelli di PDC D quattro non ha compromesso la traduzione globale del gene, come indicato dall'assenza di variazioni nel profilo PolyZone. Confrontando le cellule controllo SI e quelle trattate con IPD CD quattro, la distribuzione dei polisomi per una variante non IRAs di XIAP non è risultata modificata tra cellule trattate e non trattate. Al contrario, la distribuzione dei polisomi per le due mRNA contenenti IS, XIAP e BCL XL, è risultata significativamente alterata.

In assenza di PD CD4, la distribuzione di queste due mRNA è stata spostata nei ribosomi pesanti. Poiché questo non è accompagnato da cambiamenti nei livelli di stato stazionario di mRNA di XIAP e BCL XL, questi risultati dimostrano il potenziamento della traduzione di XIAP e BCL XL in cellule con livelli ridotti di PDC D four, come ulteriormente confermato dal Western blossoming. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come misurare la traduzione dell'mRNA preparando la regione al saccarosio e separando i polisomi mediante ultracentrifugazione.