Name: Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Scopri il profilo dei polisomi per analizzare la traduzione selettiva dell'mRNA nelle cellule di mammifero sotto stress. Questo metodo consente di identificare i trascritti altamente tradotti e di studiare i meccanismi di adattamento cellulare.

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Siamo grati ai membri passati e presenti del laboratorio, in particolare Urszula Liwak, per la discussione critica riguardante i protocolli di profilazione dei polisomi e la condivisione dei dati. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni operative degli istituti canadesi di ricerca sanitaria, della Cancer Research Society e del National Science and Engineering Research Council of Canada a MH. MDF è stata sostenuta dal Vanier Canada Graduate Scholarship Doctoral Award e dall'Ontario Graduate Scholarship, e questo lavoro fa parte della sua tesi di dottorato.

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+in+stress+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+cycloheximide+and+related+glutarimide+antibiotics+inhibit+peptide+synthesis+on+reticulocyte+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes.</a> J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).</li>
<li>Tscherne, J. S., Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+synthesis+in+intact+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein synthesis in intact HeLa cells.</a> Antimicrob Agents Chemother. 8 (4), 479-487 (1975).</li>
<li>Damgaard, C. K., Lykke-Andersen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+coregulation+of+5%27TOP+mRNAs+by+TIA-1+and+TIAR%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Translational coregulation of 5'TOP mRNAs by TIA-1 and TIAR.</a> Genes Dev. 25 (19), 2057-2068 (2011).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>McKinney, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reprogramming+of+the+cellular+translational+landscape+facilitates+cytomegalovirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Global reprogramming of the cellular translational landscape facilitates cytomegalovirus replication.</a> Cell Rep. 6 (1), 9-17 (2014).</li>
<li>Jivotovskaya, A. V., Valasek, L., Hinnebusch, A. G., Nielsen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+translation+initiation+factor+3+%28eIF3%29+and+eIF2+can+promote+mRNA+binding+to+40S+subunits+independently+of+eIF4G+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic translation initiation factor 3 (eIF3) and eIF2 can promote mRNA binding to 40S subunits independently of eIF4G in yeast.</a> Mol Cell Biol. 26 (4), 1355-1372 (2006).</li>
<li>Gross, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+Loading+onto+the+mRNA+Cap+Is+Driven+by+Conformational+Coupling+between+eIF4G+and+eIF4E%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome Loading onto the mRNA Cap Is Driven by Conformational Coupling between eIF4G and eIF4E.</a> Cell. 115 (6), 739-750 (2003).</li>
<li>Graber, T. E., Baird, S. D., Kao, P. N., Mathews, M. B., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF45+functions+as+an+IRES+trans-acting+factor+that+is+required+for+translation+of+cIAP1+during+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">NF45 functions as an IRES trans-acting factor that is required for translation of cIAP1 during the unfolded protein response.</a> Cell Death Differ. 17 (4), 719-729 (2010).</li>
<li>Spriggs, K. A., Stoneley, M., Bushell, M., Willis, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-programming+of+translation+following+cell+stress+allows+IRES-mediated+translation+to+predominate%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Re-programming of translation following cell stress allows IRES-mediated translation to predominate.</a> Biol Cell. 100 (1), 27-38 (2008).</li>
<li>Uniacke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oxygen-regulated+switch+in+the+protein+synthesis+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oxygen-regulated switch in the protein synthesis machinery.</a> Nature. 486 (7401), 126-129 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Occhi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mutation+in+the+upstream+open+reading+frame+of+the+CDKN1B+gene+causes+a+MEN4+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel mutation in the upstream open reading frame of the CDKN1B gene causes a MEN4 phenotype.</a> PLoS Genet. 9 (3), (2013).</li>
<li>Faye, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+composition+of+cellular+internal+ribosome+entry+sites+defines+dependence+on+NF45+and+predicts+a+posttranscriptional+mitotic+regulon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide composition of cellular internal ribosome entry sites defines dependence on NF45 and predicts a posttranscriptional mitotic regulon.</a> Mol Cell Biol. 33 (2), 307-318 (2013).</li>
<li>Zong, Q., Schummer, M., Hood, L., Messenger Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+translation+state%3A+the+second+dimension+of+high-throughput+expression+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">RNA translation state: the second dimension of high-throughput expression screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (19), 10632-10636 (1999).</li>
<li>Bunnik, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+reveals+translational+control+of+gene+expression+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling reveals translational control of gene expression in the human malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Genome Biol. 14 (11), (2013).</li>
<li>Choudhuri, A., Maitra, U., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+initiation+factor+eIF3h+targets+specific+transcripts+to+polysomes+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Translation initiation factor eIF3h targets specific transcripts to polysomes during embryogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9818-9823 (2013).</li>
<li>Corbin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fragile+X+mental+retardation+protein+is+associated+with+poly%28A%29%2B+mRNA+in+actively+translating+polyribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The fragile X mental retardation protein is associated with poly(A)+ mRNA in actively translating polyribosomes.</a> Hum Mol Genet. 6 (9), 1465-1472 (1997).</li>
<li>Riley, A., Jordan, L. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+5%27+UTRs+regulate+XIAP+expression+under+normal+growth+conditions+and+during+cellular+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct 5' UTRs regulate XIAP expression under normal growth conditions and during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 38 (14), 4665-4674 (2010).</li>
<li>Thermann, R., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+miR2+induces+pseudo-polysomes+and+inhibits+translation+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila miR2 induces pseudo-polysomes and inhibits translation initiation.</a> Nature. 447 (7146), 875-878 (2007).</li>
<li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li>
<li>Graber, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+stalled+polyribosomes+in+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Reactivation of stalled polyribosomes in synaptic plasticity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 16205-16210 (2013).</li>
<li>Wang, Y., Ringquist, S., Cho, A. H., Rondeau, G., Welsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+polyribosome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High-throughput polyribosome fractionation.</a> Nucleic Acids Res. 32 (10), (2004).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling%3A+new+views+of+translation%2C+from+single+codons+to+genome+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale.</a> Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).</li>
<li>Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Profilatura polisomale è una tecnica potente che consente la quantificazione dello stato della traduzione di trascritti specifici in diverse condizioni di trattamento. Si tratta di una tecnica molto semplice principio che tuttavia richiede diverse fasi di esecuzione, alcune delle quali sono critici per la produzione di buoni profili polisoma. Questi passaggi chiave sono: 1) uso di prodotti chimici RNase-free e plasticware, 2) la preparazione di ottimi gradienti di saccarosio (nella nostra esperienza un 10-50% gradienti di saccarosio funzionano meglio per risolvere in modo efficiente 40 / 60S subunità e mRNA con ribosomi legato), e 3 ) utilizzando cellule che sono in crescita esponenziale e non confluenti oltre l&#39;80%, al fine di catturare i più alti tassi di traduzione. Quest&#39;ultimo passo dovrebbe essere presa in considerazione quando si fa trattamenti lunghi cellulari, come knockdown gene o sovraespressione, in modo che la quantità di cellule per piastra sarà una funzione di quanto le cellule saranno confluenti al punto finale. Nei risultati presented qui, polisoma analisi del profilo è stato uno strumento importante per valutare il ruolo PDCD4 nella regolazione traduzione dei IRES-mRNA ospitano XIAP e Bcl-xL 12. Il fatto che non abbiamo osservato alcun cambiamento nei profili generali polisoma su PDCD4 knock-down (Figura 1B) ci ha permesso di concludere che PDCD4 non ha compromesso traduzione globale cellulare nelle condizioni dell&#39;esperimento. Abbiamo poi utilizzato l&#39;analisi di RT-qPCR per determinare la distribuzione del XIAP e Bcl-xL mRNA in cellule trattate con PDCD4 o siRNA di controllo. qPCR è un metodo di scelta per analizzare profili polisoma, rispetto allo standard di RT-PCR o Northern blotting, perché permette di quantitativa piuttosto che un&#39;analisi semi-quantitativa della distribuzione mRNA e per la rilevazione di sottili variazioni nell&#39;efficienza traslazionale tra i trattamenti. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di dimostrare che la distribuzione delle XIAP e Bcl-xL mRNA (espresso come percentuale del target totale mRNA in tutto il gradient) era significativamente spostato in poliribosomi pesanti (mRNA con un gran numero di ribosomi ad essi associati) dopo PDCD4 knock-down (Figura 1D, E), indicando così un aumento di definizione di questi mRNA. Ciò è stato ulteriormente confermato da un aumento XIAP e Bcl-xL livelli di proteina, ma non nei loro livelli di RNA allo stato stazionario (Figura 1F, G). È importante sottolineare che la distribuzione polisoma della variante non-IRES di XIAP è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). In alternativa, l&#39;efficienza traduzionale potrebbe essere presentato come un rapporto di contenuto di mRNA in polisomi (solitamente frazioni 5 a 10) rispetto monosomes (solitamente frazioni 2 a 4) 14. L&#39;uso dei controlli in tutta il protocollo è importante nel convalidare qualsiasi polisoma risultato profiling, come picchi osservati dalle letture di assorbanza a 254 nm non possono da soli essere attribuito ad RNA ribosomiale (detergentes, come Triton X-100 fortemente assorbono in questa regione dello spettro e possono oscurare 40 / 60S picchi nella parte superiore del gradiente). Sfumature in bianco, senza lisato e / o con tampone lisato devono essere eseguiti per determinare il contributo relativo dei buffer per l&#39;assorbanza a 254 nm. Artefatti strutture di ordine superiore possono anche portare a interpretazioni errate di polisomi dove ci sono in effetti nessuno (ad esempio, &quot;pseudo-polisomi&quot; 20). Sequestranti magnesio (utilizzato durante tutta la procedura di stabilizzare ribosomi 80S) con l&#39;EDTA cationi bivalenti chelante aggiunti lisati e al buffer gradiente (20 mM per 15 min) provoca la separazione del ribosoma nei suoi componenti piccoli (40S) e grandi (60S ) subunità. Pertanto, se i picchi di assorbanza a 260 nm registrati sono infatti polisomi, trattamento EDTA collasserà il profilo tale osserverà una singola massima nella parte superiore del gradiente che corrisponde a liberare mRNA e unità ribosomiale (dati non mostrati). Coincidentecon EDTA indotta crollo del profilo, tutti gli obiettivi specifici analizzati da qPCR occorre ora trovato nella parte superiore del gradiente. Il numero dei ribosomi associati ad un mRNA non è sempre un indicatore di quanto efficientemente quel particolare mRNA viene tradotto. Infatti, ci sono contesti specifici in cui traduzione attiva su polisomi diventa stallo 21,22 che il lettore dovrebbe essere a conoscenza. Determinare se trascrizioni sono attivamente impegnati con i macchinari di traduzione può essere fatto da a) trattando il campione con puromicina, che a differenza di EDTA, provoca &#39;run-off&#39; di ribosomi che sono attivamente translocating in un mRNA, oppure b) il trattamento del campione con homoharringtonine che inibisce la traslocazione di solo il primo ribosoma al codone di inizio, di nuovo causando &#39;run-off&#39; di tutti i ribosomi translocating a valle. L&#39;uso di trascritti di controllo per l&#39;analisi qPCR è anche critico. Il Seleczione di trascrizioni che non sono affetti da diverse condizioni di trattamento come alcuni geni housekeeping (GAPDH, actina, tubulina Nucleolina), mRNA ribosomali (18S, RPL13A) o in questo caso la variante non-IRES del XIAP IRES, è importante in verificare se l&#39;effetto del trattamento sulla traduzione è specifica o generalizzata. Queste trascrizioni di controllo possono essere utilizzati per normalizzare la distribuzione dei mRNA analizzati come è stato fatto qui (XIAP e Bcl-xL mRNA sono stati normalizzati per GAPDH mRNA e espressa in percentuale del contenuto totale di mRNA rappresentato dalla somma del contenuto di mRNA in ogni frazione ) o, in alternativa, di destinazione e di controllo mRNA possono essere espressi come valori assoluti ed esposti separatamente. analisi qPCR dei lisati ingresso (solitamente il 10% del volume totale) è un altro passo che il controllo della distribuzione di specifici mRNA. Idealmente, il contenuto di un trascritto di mRNA specifico nel lisato ingresso dovrebbe essere paragonabile alla somma del contenuto di mRNA in tutte le 10 frazioni analizzati. Infine, Un passaggio facoltativo per il controllo per il fenolo: cloroformio fase di estrazione è a picco ogni frazione polisoma con un in vitro trascritto mRNA giornalista (come CAT, cloramfenicolo acetil transferasi) che verrà successivamente quantificato qPCR e può anche essere usato per normalizzare la dati 14. Come con qualsiasi tecnica, la profilatura polisoma presenta alcune limitazioni. Il fatto che di solito un minimo di 10 frazioni (cambiamenti più sottili di efficienza di traduzione può richiedere 20 o più) devono essere raccolti in modo da avere distribuzioni polisoma curato rende questo passaggio limitante, nel senso che solo un massimo di 4 campioni può essere analizzati alla volta per poter gestire comodamente estrazione dell&#39;RNA e analisi qPCR di 40 campioni e controlli di ingresso 4 alla volta. La dimensione del campione può facilmente aggiungere il passo con il numero di trascrizioni devono essere analizzati e il numero di qPCR replica di fare, e questo può essere costoso. Un altro limite di una base-qPCR polisomale profiling unnalisi è che può essere fatto solo su un approccio basato candidato (dove i trascritti da analizzare sono noti in anticipo) e non possono essere applicati per l&#39;analisi dell&#39;intero genoma di traduzione. Tuttavia, all&#39;inizio del 21 ° secolo, gli investigatori hanno cominciato a interrogare i loro RNA polisomale a livello genomico mediante DNA microarrays 15 e più recentemente con sequenziamento di prossima generazione 16,17. In questo approccio potente, profilazione polisomale viene eseguita come descritto in questo protocollo la differenza che, invece di effettuare analisi qPCR delle singole frazioni, monosomes frazioni (frazioni di solito 2-4) e polisomi frazioni (di solito frazioni) sono raggruppati insieme e variazioni nella traduzione globale analizzati da DNA microarray o dell&#39;intero genoma RNA sequencing. Quindi con questo approccio, è possibile valutare tutti gli mRNA la cui distribuzione si sposta dal polisomi a monosomes (diminuzione in traduzione) o viceversa (aumento in traduzione) su un trattamento specificomento. Validazione e quantificazione di specifica distribuzione polisomi di mRNA possono quindi essere fatto da qPCR. Un uso ancora più potente del principio polisomale profiling è profiling ribosoma. Ulteriore estensione alto rendimento di questa tecnica è stato segnalato di recente che consente il monitoraggio simultaneo di centinaia di polisoma 23 frazioni. Ciò fornisce un chiaro vantaggio quando sondare l&#39;efficienza traslazionali delle collezioni mutanti o in una grande scala schermi RNAi. Profiling ribosoma è una tecnica che si avvale di sequenziamento di nuova generazione per mappare frammenti di RNA protetti da ribosomi (impronte ribosoma) impegnati nella sintesi proteica 24,25. In questa tecnica, traslocazione ribosoma può essere inibita con cicloeximide (reversibile) o emetine (irreversibile) seguita da lisi cellulare e la digestione RNasi per produrre una popolazione di impronte ribosoma. I ribosomi sono arricchiti, l&#39;RNA totale è isolato, e contaminando ribosomiale e RNA ribosomiale mitocondriale viene rimosso.Impronte di RNA di circa 26-28 nucleotidi sono isolati, a trascrizione inversa, trasformato in una libreria di cDNA e sequenziati 26. A differenza di profilazione polisoma di serie, questo approccio non solo identifica specifici mRNA che sono regolati traslazione, ma produce anche informazioni mRNA specifico per una risoluzione di codone, come l&#39;occupazione e la densità esatta di ribosomi lungo una trascrizione specifico. Ciò è particolarmente interessante per mRNA con specifiche modalità di traduzione, come mRNA IRES-ospitano, in quanto potrebbe dare più informazioni su dove sulla trascrizione ribosoma-reclutamento si sta verificando.

Regolazione della sintesi proteica (traduzione) è un processo cellulare fondamentale che è intimamente legata alla sopravvivenza cellulare. Dato che la traduzione consuma più del 50% dell&#39;energia della cellula, non è sorprendente che la traduzione è strettamente regolata e che perturbazioni in una versione non sono ben tollerati. Al contrario, molti processi cellulari aberranti richiedere che le macchine di traduzione e l&#39;uscita di traduzione (cioè proteoma) devono essere modificati. Questo è spesso il caso in vari stati di risposta allo stress e malattie, ed è probabilmente meglio esemplificato nel cancro. Uno dei principali vantaggi del controllo traduzionale è la capacità delle cellule di riprogrammare rapidamente la produzione di proteine ​​in risposta a vari trigger esterni ed interni, così bene meccanismo di regolazione che consigli l&#39;equilibrio tra la sopravvivenza delle cellule e la morte 1. Due aspetti del controllo traduzionale sono particolarmente interessanti; comprensione della natura del mec normativohanism (s) ed elementi di comando che consentono una versione specifica, e l&#39;identificazione di specifici mRNA e dei loro prodotti proteici che partecipano alla risposta cellulare al particolare trigger che ha suscitato una versione selettiva in primo luogo. Profilatura polisoma è una tecnica che permette efficace studio di entrambi i processi. L&#39;obiettivo generale della tecnica polisoma profiling è quello di studiare e quantificare lo stato di traduzione di specifici mRNA in condizioni cellulari diversi. Il principio della tecnica è quello di catturare la traduzione dell&#39;mRNA da &#39;&#39; congelamento &#39;&#39; ribosomi traducono attivamente su diversi trascritti e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo una distinzione tra trascrizioni altamente tradotte (vincolato da più ribosomi) e quindi mal quelli tradotti (vincolati da uno o due ribosomi). In questo particolare protocollo, la cicloesimmide antibiotico che si lega allaSubunità ribosomiale 60S e inibisce la produzione di deacetilato tRNA dal sito E ribosoma 2, viene utilizzato per inibire la traslocazione del ribosoma ribosomi e stallo sul mRNA traduzione. Tuttavia, altri agenti bloccanti come emetine tale definizione anche i blocchi di allungamento 3, può essere utilizzato. A differenza del western blotting e 35 S-metionina tecniche di marcatura che misurano l&#39;output finale del processo di traduzione, polisoma profilazione ha il vantaggio di misurare ribosomi associazione con mRNA attivamente tradotte, consentendo così uno studio più dettagliato di meccanismi di conversione in condizioni diverse. Quindi, la tecnica può essere facilmente adattato per studiare specificamente diverse modalità di definizione 4-6, fattori proteine ​​coinvolte nella regolazione definizione 7-9, condizioni di stress che interessano la sintesi proteica 1,10,11 o gli effetti delle strutture di mRNA come IRES oa monte aperte fasi di lettura su proteine ​​synthESIS 12-14. Al giorno d&#39;oggi, polisoma applicazioni di profilatura sono ancora più ampia con l&#39;uso di DNA microarray 15 o sequenziamento di prossima generazione 16,17 per analizzare polisomi-associati mRNA.

<table><tbody><tr><td>Gradient Master 108 creatore di gradienti automatizzato</td><td>BIOCOMP</td><td>107-201M</td><td></td></tr><tr><td>Auto Densi-Flow creatore di gradienti a due camere</td><td>LABCONCO</td><td>4517000</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Ultracentrifuge&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>Modello # L-100-XP</td><td></td></tr><tr><td>Fraction Fractionator</td><td>TELEDYNE ISCO</td><td>69-3873-246</td><td>Composto da: sistema di perforazione del tubo, pompa peristaltica, rivelatore UA-6 con filtri da 254 e 280 nm e collettore di frazioni Foxy R1</td></tr><tr><td>Software di acquisizione dati WinDaq</td><td>DATAQ INSTRUMENTS</td><td>WINDAQ/LITE</td><td></td></tr> <tr><td>http://www.dataq.com/products/software/acquisition.htmProvette per ultracentrifuga Pollyallomer (per SW41, 14 x 89 mm)</td>Provette da centrifuga da 2 ml senza nucleasi <td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>(naso di delfino)</td>Provette da centrifuga <td>da</td> 2 ml senza nucleasi <td>DiaMed PRE1900-N</td><td></td></tr><tr><td>(fondo piatto)</td><td>SafeSeal</td><td>12000</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio (senza nucleasi)</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td>MW = 342,3 g/mol</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>SIGMA</td><td>C7698</td><td>MW = 281,4 g/mol. Risospendere in DMSO e mantenere a -80C per sotrage a lungo termine. Attenzione: TOSSICO! Può causare vie respiratorie e irritazione della pelle. Indossare la mascherina durante la pesatura.</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (senza nucleasi)</td><td>OmniPur</td><td>7710</td><td>MW = 58,44 g/mol</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O (senza nucleasi)</td><td>OmniPur</td><td>5980</td><td>MW = 203,3 g/mol</td></tr><tr><td>Tris Base (senza nucleasi)</td><td>J.T. Baker</td><td>4109-01</td><td>MW = 121,14 g/mol</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>OmniPur</td><td>9400</td><td>Attenzione: TOSSICO! Può causare vie respiratorie e irritazione cutanea</td></tr><tr><td>RNasina ribonucleasi ricombinante Inibitore</td><td>Promega</td><td>N2515</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Soluzione di inattivazione della RNnasi</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue Coprecipitante (15 mg/ml)</td><td>Invitrogen, Life Technologies</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Acido-Fenolo:Cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Ambion, Life Technologies</td><td>AM9722</td><td>Attenzione: TOSSICO ! Può causare irritazione del tratto respiratorio, nonché irritazione e corrosione della pelle</td></tr></tbody></table>

valutazione della selective mrna traduzione in cellule di mammifero per polisoma profiling

Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling

Regolazione della sintesi proteica rappresenta un punto di controllo chiave nella risposta cellulare allo stress. In particolare, RNA discreto elementi regolatori sono stati mostrati per permettere alla traduzione selettiva di specifici mRNA che codificano per proteine ​​tipicamente richiesti per una particolare risposta allo stress. L&#39;identificazione di questi mRNA, così come la caratterizzazione dei meccanismi di regolamentazione responsabili della traduzione selettiva è stata in prima linea di biologia molecolare per qualche tempo. Profiling polisoma è un metodo pietra miliare in questi studi. L&#39;obiettivo di polisoma profiling è quello di catturare la traduzione dell&#39;mRNA immobilizzando ribosomi traducono attivamente diverse trascrizioni e separare i poliribosomi risultanti da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio, consentendo così una distinzione tra trascrizioni altamente tradotti e quelli mal tradotti. Questi possono poi essere ulteriormente caratterizzate da metodi tradizionali biochimica e biologia molecolare. È importante sottolineare che, combinando polysome profilatura con approcci genomici ad alto rendimento consente una vasta analisi di scala di regolazione traduzionale.

Abbiamo recentemente descritto un nuovo ruolo per il tumore soppressore PDCD4 come un inibitore selettivo di traduzione degli mRNA codificanti inibitori di apoptosi XIAP e Bcl-xL 12 IRES-ospitare. Profiling polisoma era una tecnica fondamentale per dimostrare il coinvolgimento specifico di PDCD4 nella traduzione IRES-mediata. HEK293 cellule sono state trasfettate per esaurire i livelli endogeni di PDCD4 (Figura 1A) e poi sottoposti ad polisoma analisi del profilo. Abbiamo osservato che la riduzione dei livelli di PDCD4 non ha compromesso la traduzione globale cellulare, come giudicato dalla mancanza di cambiamenti nel profilo polisoma quando si confrontano i siCTRL e siPDCD4 cellule trattate (Figura 1B). Allo stesso modo, polisoma distribuzione di non-IRES variante di XIAP 19 è rimasta invariata tra le cellule trattate e non trattate (Figura 1C). Al contrario, polisoma distribuzione dei mRNA due IRES-ospitano, XIAP e Bcl-xL, è risultata significativamente modificata. In assenza di PDCD4 la distribuzione di questi due mRNA viene spostata in ribopolysomes pesanti (Figura 1D, E). Dal momento che questo non è accompagnato da variazioni dei livelli di steady-state di XIAP e Bcl-xL mRNA (Figura 1F) Questi risultati dimostrano una maggiore traduzione di XIAP e Bcl-xL in cellule con livelli PDCD4 ridotti, che è stato ulteriormente confermato mediante Western blotting (Figura 1G). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52295/52295fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Profiling polisoma identifica PDCD4 come inibitore selettivo della traduzione XIAP e Bcl-xL (A) HEK293 cellule sono state trattate con PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL), non-targeting siRNA, lisati e sottoposti ad analisi Western blot con anti-PDCD4 e gli anticorpi anti-nucleolina per verificare il grado di PDCD4 knock-down. (B) PDCD4 è stato abbattuto come in (A) eI lisati cellulari sono stati sottoposti a polisoma profilatura. Profilo polisoma Rappresentante è mostrato nel pannello superiore; distribuzione del XIAP non IRES (C), Bcl-xL (D), e XIAP IRES (E) mRNA relativi a quella della GAPDH è mostrato come la percentuale di mRNA totale (% mRNA) di ogni frazione. (F) fissa livelli di mRNA -state sono stati misurati mediante RT-qPCR in PDCD4 siRNA o di controllo (CTRL) siRNA cellule trattate. (G) I lisati da (A) sono stati anche sottoposti ad analisi Western Blot con anticorpi anti-XIAP, anti-Bcl-xL, e anticorpi anti-nucleolina. (NB. I dati presentati nella figura 1 sono stati originariamente pubblicati in 12) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52295/52295fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

La capacità delle cellule di adattarsi allo stress è fondamentale per la loro sopravvivenza. La regolazione della traduzione dell'mRNA è una di queste strategie di adattamento, che prevede una rapida regolazione del proteoma. Qui, forniamo un protocollo standardizzato di profilazione dei polisomi per identificare mRNA specifici che vengono tradotti selettivamente in condizioni di stress.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

Regulation of protein synthesis represents a key control point in cellular response to stress. In particular, discreet RNA regulatory elements were shown ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è distinguere tra mRNA altamente tradotti e mRNA scarsamente tradotti mediante l'immobilizzazione e la separazione dei poliribosomi. Questo viene ottenuto innanzitutto aggiungendo cicloeide alle cellule per inibire la traslocazione dei ribosomi e la traduzione dell'RNA. Come secondo passaggio, i lisati ottenuti dalle cellule trattate vengono caricati su un gradiente di saccarosio e sottoposti a ultracentrifugazione per separare i poliribosomi accumulati in base alle loro masse.Successivamente, il gradiente viene suddiviso in frazioni uguali per separare i trascritti tradotti in modo elevato da quelli tradotti in modo scarso nel passaggio finale. Viene utilizzato R-T-Q-P-C-R per rilevare la presenza degli mRNA di interesse all'interno di ciascuna frazione. In definitiva, il ribosome profiling può essere impiegato per rilevare variazioni nella traduzione globale nonché specifica dell'mRNA in risposta a diversi stress fisiologici e patofisiologici.PolyOne profiling può rispondere a domande fondamentali nei campi della biologia molecolare e cellulare, come ad esempio quali mRNA vengono selezionati e tradotti durante lo stress S, e come ciò permetta alle cellule di adattarsi a queste condizioni. Per dimostrare questa procedura, si prende come esempio la dottoressa Dar, una studentessa universitaria del laboratorio. Per utilizzare un generatore automatico di gradienti per preparare un gradiente al saccarosio, iniziare accendendo il generatore di gradienti e livellando la piastra che ospiterà i gradienti. Una volta livellata la piastra, fare clic su "fatto".Quindi, per selezionare il programma a gradiente, aprire il menu grad e selezionare lista. Fare clic su SW 41 e scorrere l'elenco fino a visualizzare il programma 10-50% di gradiente in 11 passaggi e premere Usa. Successivamente, inserire un tubo conico per ultracentrifuga SW 41 nel blocco segnacampioni e utilizzare il pennarello fine fornito per tracciare una linea sul tubo lungo il gradino superiore del blocco.Posizionare i tubi in un apposito rack su una superficie stabile, quindi collegare le due cannule fornite a due siringhe da 10 millilitri. Pipettare su e giù alcune volte acqua distillata calda contenente RNA nella soluzione di attivazione per lavare le siringhe. Dopo aver rimosso completamente ogni traccia d'acqua, riempire una delle siringhe con saccarosio al 10% più ciclodestrina e inserire la cannula nella parte inferiore del tubo per ultracentrifuga.Dispensare delicatamente la soluzione fino a superare leggermente il segno fatto sul tubo. Fare attenzione a evitare bolle d'aria. Quindi riempire la seconda siringa con saccarosio al 50% più ciclodestrina e rimuovere il liquido in eccesso dal tubo con un panno pulito.Utilizzare la cannula per inserire delicatamente la soluzione di saccarosio al 50% nel tubo, fermandosi quando la soluzione raggiunge il livello del segno, quindi rimuovere rapidamente e con movimento uniforme la cannula. La soluzione di saccarosio al 10% dovrebbe salire formando un menisco nella parte superiore del tubo. Successivamente, inclinare leggermente il tubo dell'ultracentrifuga per spostare eventuali bolle d'aria e inserire il tappo utilizzando una micropipetta per rimuovere qualsiasi liquido in eccesso presente nel serbatoio del tappo.Posizionare i tubi sul generatore di gradiente e quindi premere il pulsante di esecuzione. Osservare che la piastra si inclinerà all'angolo specificato. Attendere cinque secondi, quindi inizieranno le rotazioni per formare il gradiente.Dopo circa due minuti, la macchina emetterà un segnale acustico che indica il completamento della formazione del gradiente. Trasferire delicatamente le provette su un portaprovette e rimuovere rapidamente i tappi con un unico movimento verso l'alto per evitare di disturbare il gradiente. Quindi caricare delicatamente un'uguale quantità di 260 unità di lisato cellulare precedentemente preparato su ciascun gradiente di saccarosio e centrifugare le provette per un'ora e mezza a 260.343 ×g e a quattro gradi Celsius in un ultracentrifugo.Per configurare lo strumento per la frazionatura a gradiente, iniziare accendendo lo spettrofotometro. Successivamente, fare clic due volte sull'icona della cartella e poi due volte sulla freccia di ritorno per tornare alla schermata iniziale e impostare il raccoglitore di frazioni sul metodo PolyZone, in modo da assicurare che la valvola del raccoglitore di frazioni sia impostata sullo scarico. Fare clic sulla freccia rivolta verso l'icona del cestino e quindi posizionare un matraccio MIA da 250 millilitri contenente acqua distillata sotto il tubo di raccolta degli scarti.Ora selezionare le seguenti impostazioni sul registratore grafico: regolare la manopola di sensibilità per impostare lampada e ottica, il filtro di riduzione del rumore su 1,5, la manopola del separatore dei picchi su off, la velocità del grafico su 30 centimetri all'ora e la manopola di regolazione della linea di base, situata in alto sull'unità dello spettrofotometro, su apertura massima. Successivamente, inserire siringa e cilindro nella pompa e utilizzare le viti fornite e la chiave esagonale per fissarli saldamente al loro posto.Utilizzare il comando rev a velocità elevata per riempire la siringa con la soluzione di lavaggio. Successivamente, posizionare la pompa in posizione verticale e utilizzare il comando forward per espellere l'aria attraverso il tubicino. Poi, installare un tubo per ultracentrifuga riempito con acqua priva di RNA nel supporto e quindi perforare il tubo con la cannula fino a quando sono visibili i due segni neri.Il foro di erogazione si trova tra le due marcature. Avviare la pompa per siringa in modalità manuale diretta a 6,0 millilitri al minuto. Quando la soluzione di lavaggio riempie un terzo del tubo, passare alla velocità variabile con una portata di 1,0 millilitro al minuto.Ora ruotare la manopola di regolazione della linea di base sullo spettrofotometro fino a quando la tensione sul grafico non raggiunge lo zero. L'acqua inizierà a uscire dal tubo di scarico nel matraccio el Mya. Successivamente, impostare la sensibilità desiderata a 1,0 au.Dopo aver regolato la sensibilità, premere il pulsante "baseline" e ruotare la manopola di compensazione del registratore per impostare la linea di base al 10% della scala del registratore grafico. Una volta ottenuta una linea di base stabile, spegnere l'interruttore della pompa e la manopola della velocità del grafico. Dopo che la pompa si è arrestata, posizionarla sulla posizione "rev" per recuperare la soluzione di chasing finché non raggiunge il primo segno sulla cannula foratrice.Quindi rimuovere il tubo della centrifuga, disperdere eventuali bolle nella cannula con una piccola quantità di soluzione di spinta e rimuovere qualsiasi residuo di acqua che potrebbe essersi accumulato dalla cella di flusso per frazionare il gradiente. Successivamente, installare il tubo della centrifuga contenente il gradiente di saccarosio nel supporto e perforare il tubo con la cannula. Quindi posizionare dieci microtubi da due millilitri nei vani da due a undici del vassoio del frazionatore e un tubo per i rifiuti nel vano uno, in modo che i tappi non sporgano verso l'alto.Impostare la manopola di controllo della pompa su manuale e la portata della pompa a siringa su 6,0 millilitri al minuto. Quindi premere il pulsante di riproduzione sul collettore di frazioni non appena il braccio raggiunge il primo tubo. Premere il pulsante di pausa per posizionare il braccio e aprire la valvola di erogazione delle frazioni.Quindi utilizzare il comando di avanzamento per avviare la pompa e monitorare la penna del registratore grafico. Quando la penna inizia a deviare verso l'alto, indicando che il campione sta passando attraverso la cella di flusso, sostituire rapidamente il tubo di scarto con il tubo numero uno. Successivamente, quando viene raccolta la prima goccia, passare rapidamente i comandi a avvio remoto, arresto e flusso di 1,0 millilitro al minuto e premere play per consentire all'interfaccia del collettore di frazioni di raccogliere frazioni da un millilitro ogni minuto.Infine, dopo che la soluzione di caccia blu è entrata nell'ultimo tubo, premere stop. Il profiling PolyZone è una tecnica fondamentale per dimostrare il coinvolgimento specifico del PD CD4 nella traduzione mediata da IRA. Ad esempio, in questo esperimento, le cellule HEC 2 93 sono state transfezionate in modo transitorio per ridurre i livelli endogeni di PDC D quattro, e successivamente sottoposte ad analisi di profiling PolyZone.La riduzione dei livelli di PDC D quattro non ha compromesso la traduzione globale del gene, come indicato dall'assenza di variazioni nel profilo PolyZone. Confrontando le cellule controllo SI e quelle trattate con IPD CD quattro, la distribuzione dei polisomi per una variante non IRAs di XIAP non è risultata modificata tra cellule trattate e non trattate. Al contrario, la distribuzione dei polisomi per le due mRNA contenenti IS, XIAP e BCL XL, è risultata significativamente alterata.In assenza di PD CD4, la distribuzione di queste due mRNA è stata spostata nei ribosomi pesanti. Poiché questo non è accompagnato da cambiamenti nei livelli di stato stazionario di mRNA di XIAP e BCL XL, questi risultati dimostrano il potenziamento della traduzione di XIAP e BCL XL in cellule con livelli ridotti di PDC D four, come ulteriormente confermato dal Western blossoming. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come misurare la traduzione dell'mRNA preparando la regione al saccarosio e separando i polisomi mediante ultracentrifugazione.

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Questo articolo descrive un protocollo per l'estrazione di tradurre ribosomi delle cellule eucariotiche. Una volta estratto, i ribosomi sono separati in monosomes e poliribosomi per frazionamento gradiente di saccarosio per consentire diverse popolazioni ribosomiale da analizzare. Come tale, questo metodo è il gold standard per l'esame della regolamentazione della traduzione.

Eucarioti Analisi Profilo Polyribosome

Qui, descriviamo un metodo per analizzare le modifiche l'apertura di traduzione dell'mRNA di cellule eucariotiche in risposta alle condizioni di stress. Questo metodo si basa sulla separazione velocità su gradienti di saccarosio di traduzione ribosomi da ribosomi non traslanti.

Analisi della traduzione innesco durante condizioni di stress da polisoma Profiling

Ribosomi svolgono un ruolo centrale nella sintesi proteica. Polyribosome (polisoma) frazionamento da saccarosio centrifugazione in gradiente di densità permette la determinazione diretta delle efficienze traduzione di mRNA individuali su una scala genome-wide. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per l'analisi biochimica dei ribosomi e fattori polisoma associati come accompagnatori e molecole di segnalazione.

Polisoma Frazionamento e analisi dei mammiferi Translatomes su scala Genome-wide

La purificazione dell'affinità ribosomiale traducente (TRAP) è in grado di catturare la traduzione specifica del tipo di cellula dell'mRNA. Qui riportiamo il primo protocollo TRAP dedicato all'isolamento dell'mRNA in rare popolazioni cellulari di embrioni di Drosophila.

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification da popolazioni di cellule rare<em&gt; Drosophila</em&gt; Embrioni

Questo protocollo descrive un metodo semplice per estrarre e frazionare i trascritti dai tessuti vegetali sulla base del numero di ribosomi legati. Permette una stima globale dell'attività traduttiva e la determinazione dello stato traduzionale di specifici mRNA.

Un metodo facile per piante polysome Profiling

Questo manoscritto descrive un metodo per visualizzare e quantificare gli eventi di conversione localizzata in compartimenti subcellulari. L'approccio proposto in questo manoscritto richiede un sistema di imaging confocale base e reagenti ed è rapido ed economico.

Quantitativa immunofluorescenza su misura globale localizzato traduzione

L'obiettivo generale di tecnica di profilatura polisoma è analisi di attività traduzionale di singoli mRNA o del trascrittoma mRNA durante la sintesi proteica. Il metodo è importante per gli studi di regolamento di sintesi della proteina, l'attivazione di traduzione e repressione in salute e più malattie umane.

Polisoma Profiling nel testicolo di topo, cellule umane e di Leishmania

Qui presentiamo un protocollo per eseguire polisoma profilatura sul cuore isolato e perfuso del mouse. Descriviamo i metodi per aspersione di cuore, polisoma profiling e l'analisi delle frazioni polisoma rispetto al mRNA, Mirna e il proteoma polisoma.

Dinamica proteomica e miRNA analisi di polisomi da Mouse cuore dopo Langendorff aspersione isolata

Qui, descriviamo l'immunoprecipitazioni dei ribosomi e dell'RNA associato da popolazioni selezionate di cellule germinali maschili adulte utilizzando il sistema RiboTag. L'allevamento strategico e un'attenta immunoprecipitazioni si traducono in risultati puliti e riproducibili che informano sul translatoma delle cellule germinali e forniscono informazioni sui meccanismi dei fenotipi mutanti.

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

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Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

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Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Scopri il profilo dei polisomi per analizzare la traduzione selettiva dell'mRNA nelle cellule di mammifero sotto stress. Questo metodo consente di identificare i trascritti altamente tradotti e di studiare i meccanismi di adattamento cellulare.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

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