Elettroporazione di effettori batterici funzionali in cellule di mammifero

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di introdurre proteine esogene, potenzialmente citotossiche, come gli effettori batterici, nelle cellule dei mammiferi per studiarne gli effetti e la funzione. Ciò si ottiene coltivando prima le cellule di mammifero attraverso la condizione di coltura standard per ottenere cellule simili all'ospite adatte in cui introdurre la proteina purificata di interesse. In una seconda fase, viene condotta l'elettroporazione delle cellule ospiti in coltura in presenza di un effettore batterico purificato, che consente alla proteina di entrare e interagire con le cellule ospiti.

Successivamente, viene eseguita la visualizzazione o qualche altro test funzionale per valutare la localizzazione subcellulare e la funzionalità della proteina effettrice. I risultati basati sulla microscopia confocale, sui metodi immunochimici o su altre tecniche di analisi mostrano la localizzazione degli effettori batterici funzionali nelle loro posizioni subcellulari attese e il legame con i loro partner di interazione noti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la transezione o la trasduzione, è che questo protocollo è un approccio rapido, semplice ed economico per superare la potenziale citotossicità.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei patogeni, come la scoperta o la convalida delle funzioni delle proteine effettrici batteriche. Sebbene questo metodo sia stato utilizzato per fornire informazioni sulle proteine effettrici batteriche, può essere applicato anche ad altre proteine o piccole molecole. La visualizzazione dei risultati è fondamentale.

Poiché la colocalizzazione con caratteristiche cellulari note, verificare l'associazione subcellulare prevista della proteina elettroporata Per iniziare questa procedura. Trasferire 400 microlitri di sospensione cellulare in un vete pre-raffreddato. Quindi aggiungere 20 microgrammi di proteine selezionate per raggiungere una concentrazione finale di 50 microgrammi per millilitro.

Agitare delicatamente il veterinario circa 10 volte per mescolarlo e per evitare di danneggiare le cellule. Successivamente, asciugare l'esterno del Q Vet con un tovagliolo di carta per evitare la formazione di archi elettrici nell'elettro. Posizionare il campione nell'elettro e impostarlo a 0,3 kilovolt per 1,5-1,7 millisecondi subito dopo l'elettroporazione.

Scorrere delicatamente il qve circa 10 volte per mescolare accuratamente il campione prima di procedere alla fissazione e alla colorazione con immunofluorescenza o alla purificazione per affinità. Dopo quattro ore di recupero dall'elettroporazione, lavare le cellule con PBS sterile. Quindi fissare le celle in metanolo al 100% per due minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, lavare più volte le cellule con PB S3 sterile. Permeare le cellule con tritton X 100 allo 0,4% in PBS per 15 minuti. Regolare la lunghezza del permeabile e la forza di Triton X 100 in base all'epitopo e alla posizione della proteina bersaglio.

Quindi bloccare le cellule con il 5% di BSA in PBS per un'ora a temperatura ambiente. Dopo. Lavali tre volte con PBS. Successivamente, incubarli con l'anticorpo primario nella soluzione legante l'anticorpo durante la notte a quattro gradi Celsius con un leggero dondolio il giorno successivo.

Lavare le celle altre quattro volte con PBS. Quindi incubarli con l'appropriato anticorpo secondario coniugato fluorescente nella soluzione legante l'anticorpo. Aggiungi altre macchie secondo necessità, come cinque agglutinine micromolari di germe di grano o WGA coniugate ad Alexa 6 47 o DPI per un'ora a temperatura ambiente e al riparo dalla luce.

Quindi lavare le celle con PBS cinque volte e conservarle a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce fino a quando non sono pronte per essere visualizzate in questa fase. Lavare le celle elettroporate due volte con quattro gradi Celsius PBS. Dopo quattro ore di recupero, pidocchiare le cellule con un millilitro di tampone di lisi su ghiaccio.

Raschiare prontamente le celle con un poliziotto di gomma e raccoglierle nei tubi conici. Quindi pidocchiare le cellule mediante sonicazione e vortice vigoroso. Quindi, centrifugare il campione 10.000 volte.

Gravità per 10 minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere i detriti cellulari e gli aggregati insolubili e salvare il surnatante. Combinare un millilitro di lisato di cellule elettroporate chiarificato con 50 microlitri di strept in sospensione di resina aros. Incubare la miscela a quattro gradi Celsius durante la notte con rotazione end over end per catturare la proteina elettroporata e i complessi associati tramite il tag di affinità del peptide legante strp havein.

Successivamente, centrifugare il campione a 2.500 volte la gravità per due minuti e scartare il surnatante. Quindi lavare il campione due volte con un millilitro di PBS. Quindi, aggiungere al campione 30 microlitri di quattro tamponi di caricamento XLDS, 20 microlitri di H2O distillato e un microlitro di TCEP 0,5 molari e lasciare un po' di surnatante.

Riscaldare il campione a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi raffreddarlo con ghiaccio per circa un minuto. Successivamente, centrifugare il campione a 10.000 volte la gravità a quattro gradi Celsius per cinque minuti.

Al termine, raccogliere il surnatante per il western blot con gli anticorpi appropriati. Le cellule Hela sono state incubate o sono state elettroporate con 50 microgrammi per millilitro di un effettore di salmonella marcato per affinità, GTGE e colorate con un anticorpo anti-effettore dpi, una maschera nucleare e WGA Per delineare il confine citosolico, le cellule Hela incubate mostrano un'assenza di fluorescenza verde che indica una mancanza di internalizzazione di GTGE. Questa è una micrografia fotografica rappresentativa del GTG elettroporato, che mostra la proteina effettrice elettroporata intracellulare mostrata.

Ecco il western blot per rilevare il partner eucariotico che interagisce sine la proteina chinasi N uno. Si noti che la corsia all'estrema destra include due cuvette raggruppate. Il segnale proveniente da un qve si fondeva con lo sfondo, ma pkn one era ancora arricchito al di sopra della mancanza di legame osservata nel controllo senza esca mediante microscopia confocale dopo elettroporazione con 50 microgrammi per millilitro.

Le cellule hela S sph one mostrano la colocalizzazione tra pkn one e S SPH one. Questa sovrapposizione ottica indica che l'effettore e la proteina ospite sono abbastanza vicini da interagire fisicamente. Il fatto che l'interazione sia stata mostrata nel nucleo per la prima volta offre un ulteriore supporto al fatto che la proteina sia stata trasportata correttamente dall'ospite.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in modo ad alta produttività. Per studiare più proteine individuali Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di determinare empiricamente le migliori condizioni di elettroporazione per ogni tipo di cellula e bersaglio proteico. Questa procedura può consentire di multiplexare con diverse proteine, piccole molecole o una combinazione di entrambe per comprendere meglio i processi cellulari in una varietà di sistemi modello.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come l'elettroporazione può essere utilizzata per introdurre macromolecole come le proteine nelle cellule dei mammiferi.