Name: In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Impara a caratterizzare le terminazioni afferenti extrinseche nel colonretto del topo in vitro. Questo metodo elettrofisiologico permette di registrare fibre singole e classificare le risposte meccanochemiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Supportato dal premio NIH R01 DK093525 (GFG). Apprezziamo molto la revisione scientifica e l'editing grammaticale del manoscritto da parte della dottoressa Amber Shaffer (Università di Pittsburgh) e ringraziamo Michael Burcham per l'assistenza nella preparazione delle figure.

NOTA: Questo protocollo è stato esaminato e approvato dalla University of Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee. 1. Preparazione della soluzione di Krebs Modified e Drug Test Aliquote <ol><li> Rendere 6 L di soluzione di Krebs modificato contenente (in mM): NaCl 117,9, 4.7 KCl, 25 NaHCO 3, 1.3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, CaCl 2 2,5, 11,1 D-glucosio, 2 butirrato di sodio, acetato di sodio 20 , 0.004 nifedipina (per bloccare le contrazioni muscolari spontanee), e 0,003 indometacina (per bloccare la sintesi di prostaglandine endogene). Utilizzare soluzioni Krebs ghiaccio freddi e caldi per la dissezione dei tessuti e la registrazione singola fibra, rispettivamente. </li><li> Preparare eventuali soluzioni chimiche (ad esempio, IS, la capsaicina, ATP) in aliquote a concentrazioni desiderate. </li></ol> 2. Dissezione del Tissue colon-retto-nervo <ol><li> Anestetizzare e eutanasia topi maschi (6 - 8 settimane di vita, 20 - 30 g) inuna camera di CO 2 ad una velocità di flusso che sposta 10 - 30% del volume della camera per minuto fino topi smettere di respirare completamente come indicato dall&#39;assenza di movimento del torace. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;eutanasia, Exsanguinate tagliando aperta camera toracica, perforando l&#39;atrio destro, e immergendo la carcassa del mouse in un ampio volume di (~ 500 ml) di ghiacciata soluzione Krebs (4 ° C) gorgogliare con CarboGen (95% O 2 , 5% di CO 2). </li><li> Rimuovere accuratamente tutti i visceri, ma gli organi del colon e pelvica. Transetto il mouse nella metà attraverso il segmento vertebrale T12 leggermente sopra il diaframma toracico e trasferire il mezzo caudale di una camera di dissezione contenente ghiacciata, bolle soluzione Krebs. </li><li> Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere la vescica e gli organi riproduttivi per sezionare i loro incroci per l&#39;uretra, e rimuovere la discesa / aorta addominale fino a quando non si biforca nelle arterie iliache comuni. Liberare il PN o il LSN dal loro surrounding tessuti per via smussa e seguire il nervo da fuori cresta iliaca fino al suo punto di ingresso ventrale nel L6 e S1 la colonna vertebrale (per PN) o T13 e L1 la colonna vertebrale (per LSN). </li><li> Tagliare la sinfisi pubica e destra e giunti acetabolari sinistra, e togliere l&#39;osso iliaco. Gratuito con attenzione sia la PN o LSN dal muscolo attaccato e del tessuto connettivo dal vicino al colon-retto fino dove il nervo entra la colonna vertebrale. </li><li> Resecare attentamente l&#39;osso iliaco per esporre il colon-retto distale. Sezionare il colon-retto distale con il PN collegato o LSN in continuum. </li><li> Trasferire il colon retto con il nervo allegata al vano bagno di camera di tessuti. Rimuovere eccessivo tessuto connettivo da ulteriori dissezione, e aprire il colon-retto longitudinalmente lungo il confine anti-mesenterica. </li><li> Con lato mucosa rivolto verso l&#39;alto, pin bordo mesenterica del colon-retto adiacente al vano di registrazione nella base di silicone della chamber e fissare la lunghezza del colon-retto antimesenterico ad un rastrello di ganci collegati ad un attuatore forza (illustrata nella figura 1 e fotografato in Figura 2A). </li><li> Estrarre il PN o LSN nel vano registrazione, che è collegato al vano vasca da un foro mouse e cancello. Adagiare il tronco nervoso su un piccolo specchio di vetro nel vano registrazione, che fornisce una superficie idrofila per il nervo di aderire. Superfuse vano bagno con calda (30 - 32 ° C), soluzione di Krebs ossigenata e riempire il vano di registrazione con olio minerale. </li></ol> 3. Single-fibra Registrazione e localizzazione del campo recettivo <ol><li> Rimuovere con cautela indietro il epinevrio (guaina del nervo) dal PN o LSN allo stereomicroscopio ad alto ingrandimento (50 - 60X). Utilizzando una pinza sottile, prendere in giro il tronco nervoso in 5-8 fasci nervosi di ~ 100 micron di spessore. </li><li> Collocare il platino-iridioelettrodi a contatto con la soluzione Krebs nella camera tessuti. Posizionare in sequenza i singoli fasci nervosi sull&#39;elettrodo registrazione fatta dello stesso materiale. </li><li> Usare un pennello morbido per evocare gli AP delle afferenze colorettali delicatamente accarezzando su e giù per la superficie del colon-retto. Individuare il fascio nervoso (s) che innervano il colon attraverso rilevabile AP (potenziale d&#39;azione) registrazioni. NOTA: Il PN e LSN anche innervano la vescica urinaria e di altri organi pelvici. </li><li> Utilizzare un paio di 30 punte degli aghi G di dividere ulteriormente il fascio nervoso in sottili filamenti fascicolo di ~ 10 micron di spessore e posizionare un individuo filamento sul elettrodo di registrazione. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo concentrico con punta arrotondata perpendicolare alla superficie della mucosa per eccitare elettricamente terminazioni afferenti a intensità suprathreshold stimolo (10 mA magnitudo 0,5 durata msec @ 0,3 Hz), che produce un mm di raggio di diffusione attuale ~ 2. Spostare l&#39;elettrodo sistematicamente (~ 1,5 mm passi) Lungo la lunghezza e la larghezza del colon-retto appiattita localizzare terminazioni ricettive. </li><li> Quando un desinenza afferente è eccitato, regolare la posizione degli elettrodi di individuare il sito di attivazione (campo recettivo, RF) che richiede intensità dello stimolo minimo (soglia di stimolo). Scartare terminazioni con una soglia di stimolo&gt; 3 mA 19. </li><li> Calcolare la velocità di conduzione (CV) da 1) la distanza tra l&#39;elettrodo di stimolazione al campo recettivo (RF) e il sito registrazione e 2) il ritardo di conduzione (ad esempio, la Figura 2B) tra il manufatto stimolo e l&#39;inizio del potenziale d&#39;azione . CV (m / sec) = distanza (mm) / ritardo di conduzione (msec). </li></ol> 4. Classificazione funzionale di meccanosensibili colorettale afferenze <ol><li> Dopo aver individuato un RF da stimolazione elettrica, si applicano le seguenti tre stimoli meccanici alla RF: <ol><li> Effettuare lo stimolo tastatura premendo la punta di un calibramonofilamento ted von Frey-come il nylon (0,4 e 1 g di forza) perpendicolarmente verso la RF sul colon-retto appiattita. </li><li> Effettuare lo stimolo accarezzando accarezzando delicatamente la mucosa del colon-retto con un bel filo di nylon filamento (10 mg forza) per generare un piccolo sforzo di taglio superficiale alla RF. </li><li> Condurre il tratto circonferenziale con una forza attuatore controllato dal computer, che offre una forza tratto rampa (0-170 milioni di euro a 5 mN / sec) in direzione circonferenziale lungo il bordo anti-mesenterica del colon-retto attraverso la rake di ganci descritti al punto 2.8 . </li></ol></li><li> Classificare afferenze come sierose (solo rispondere a smussare sondare), della mucosa (rispondere alle mucose accarezzare e smussare sondare), muscolare (rispondere tratto circonferenziale e smussare sondare) muscolare / mucose (rispondere tratto circonferenziale, mucosa carezze e smussare sondare), o MIA (non reattivo a qualsiasi dei tre stimoli meccanici). </li><li> Per afferenze mesenterici (solo inl&#39;innervazione LSN), che sono difficili da attivare selettivamente dalla stimolazione elettrica, individuare le loro terminazioni ricettive da accarezzare meccanica / sondare del mesentere. </li><li> Per afferenze tratto sensibili (muscolare e muscolo-mucose), determinare la soglia di risposta, che è definita come la forza che evoca il primo AP durante tratto rampa. </li><li> Per afferenze sierose, registrare le loro risposte alla crescente livelli di puntata sondare il campo recettivo guidato dalla forza attuatore controllato dal computer. </li></ol> 5. Chemical Applicazione / Modulazione di Endings ricettive <ol><li> Registrare una risposta di base ad uno stimolo meccanico (cioè, la risposta al tratto rampa, puntata di sondaggio, o mucose carezze). </li><li> Coat il bordo inferiore di un pezzo di tubo (ottone o acciaio inossidabile, altezza 10 mm e 4 x 4 mm 2 quadrata o 4 - diametro di 5 mm) con vaselina e posizionarlo sopra il campo recettivo sul colon-retto. </li><li> Rimuoverela soluzione Krebs all&#39;interno del tubo, ed esporre il finale ricettivo da 3 - 5 minuti a 170 microlitri della soluzione contenente la sostanza chimica (s) da testare. </li><li> Monitorare la risposta del afferente durante l&#39;applicazione chimica (alcune afferenze sono chemiosensibile). </li><li> Rimuovere la soluzione chimica e il tubo di interrompere l&#39;azione della sostanza chimica. Da 4 - 6 min, testare la risposta afferenti allo stesso stimolo meccanico nella risposta basale. </li><li> Riapplicare di nuovo lo stimolo meccanico dopo periodo sufficiente di wash-out (&gt; 15 min). </li></ol> 6. picchi Registrazione e discriminante AP <ol><li> Digitalizzare i segnali elettrici registrati da assoni a 20 kHz e salvare i dati su un computer. Monitorare il segnale in linea da un monitor audio. </li><li> Analizzare le punte AP off-line e discriminare singole unità basate su analisi delle componenti principali delle singole forme d&#39;onda picco 25. NOTA: Un record deve contenere non più thun due unità attive facilmente discriminabili. </li></ol>

<ol><li>Naliboff, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+two+distinct+perceptual+alterations+in+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome.</a> Gut. 41, 505-512 (1997).</li>
<li>Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+visceral+and+cutaneous+hyperalgesia+by+local+rectal+anesthesia+in+irritable+bowel+syndrome+%28IBS%29+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients.</a> Pain. 105, 223-230 (2003).</li>
<li>Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrarectal+lidocaine+is+an+effective+treatment+for+abdominal+pain+associated+with+diarrhea-predominant+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome.</a> Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).</li>
<li>Chey, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linaclotide+for+irritable+bowel+syndrome+with+constipation%3A+a+26-week%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial+to+evaluate+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).</li>
<li>Rao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+12-week%2C+randomized%2C+controlled+trial+with+a+4-week+randomized+withdrawal+period+to+evaluate+the+efficacy+and+safety+of+linaclotide+in+irritable+bowel+syndrome+with+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation.</a> Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).</li>
<li>Busby, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacologic+properties%2C+metabolism%2C+and+disposition+of+linaclotide%2C+a+novel+therapeutic+peptide+approved+for+the+treatment+of+irritable+bowel+syndrome+with+constipation+and+chronic+idiopathic+constipation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Exp+Ther%22%5BJournal%5D)">Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation.</a> J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).</li>
<li>Mei, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+chemosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Intestinal chemosensitivity.</a> Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).</li>
<li>Mei, N., Lucchini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+data+and+ideas+on+digestive+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Auton+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Current data and ideas on digestive sensitivity.</a> J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).</li>
<li>Su, X., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat+are+polymodal+in+character%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character.</a> J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).</li>
<li>McMahon, S. B., Morrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+neurones+with+long+projections+activated+from+the+abdominal+viscera+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat.</a> J Physiol. 322, 1-20 (1982).</li>
<li>Cervero, F., Sann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+evoked+responses+of+afferent+fibres+innervating+the+guinea-pig%27s+ureter%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig's ureter: an in vitro study.</a> J Physiol. 412, 245-266 (1989).</li>
<li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+properties+of+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+urinary+bladder+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat.</a> J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).</li>
<li>Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mechanosensitive+pelvic+nerve+afferent+fibers+innervating+the+colon+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat.</a> J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).</li>
<li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+unmyelinated+afferent+fibres+by+mechanical+stimuli+and+inflammation+of+the+urinary+bladder+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat.</a> J Physiol. 425, 545-562 (1990).</li>
<li>Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+type+of+unmyelinated+chemosensitive+nociceptor+in+the+acutely+inflamed+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder.</a> Agents Actions. 25, 219-221 (1988).</li>
<li>Brierley, S. M., Jones, R. C. 3rd, Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splanchnic+and+pelvic+mechanosensory+afferents+signal+different+qualities+of+colonic+stimuli+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice.</a> Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).</li>
<li>Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanically+insensitive+afferents+%28MIAs%29+in+cutaneous+nerves+of+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey.</a> Brain Res. 561, 252-261 (1991).</li>
<li>Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unresponsive+afferent+nerve+fibres+in+the+sural+nerve+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat.</a> J Physiol. 435, 229-242 (1991).</li>
<li>Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+silent+afferents+in+the+pelvic+and+splanchnic+innervations+of+the+mouse+colorectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).</li>
<li>Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irritable+bowel+syndrome%3A+methods%2C+mechanisms%2C+and+pathophysiology.+Neural+and+neuro-immune+mechanisms+of+visceral+hypersensitivity+in+irritable+bowel+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+sensitization+of+mechanosensitive+and+-insensitive+afferents+in+mice+with+persistent+colorectal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+colorectal+afferent+function+associated+with+TNBS-induced+visceral+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).</li>
<li>Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+stretch-sensitive+pelvic+nerve+afferents+innervating+mouse+distal+colon+and+rectum%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).</li>
<li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+guanylate+cyclase-C+attenuates+stretch+responses+and+sensitization+of+mouse+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents.</a> J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).</li>
<li>Jolliffe, I. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJolliffe%2C+IT+%22Principal+component+analysis%22">Principal component analysis</a>. , 2nd, Springer. New York, NY. (2002).</li>
<li>La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+hypertonicity+and+acidity+modulate+colorectal+afferents+and+induce+persistent+visceral+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).</li>
<li>Christianson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plasticity+and+modulation+of+visceral+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">plasticity and modulation of visceral afferents.</a> Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).</li>
<li>Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+genetic+and+pharmacological+inhibition+of+TRPV1+and+P2X3+attenuates+colorectal+hypersensitivity+and+afferent+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).</li>
<li>Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystitis+increases+colorectal+afferent+sensitivity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).</li>
<li>Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+and+central+P2X+receptor+contributions+to+colon+mechanosensitivity+and+hypersensitivity+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse.</a> Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).</li>
<li>Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+visceral+hypersensitivity+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+family+receptor+%CE%B1-3+in+colorectal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La vitro preparazione colon-retto-nervo qui descritta ha dimostrato di essere un approccio efficace per studiare le funzioni di codifica neurale delle singole afferenze del colon-retto, che integra ben altri approcci non funzionali (ad esempio, studi cellulari, molecolari e istologiche) sui neuroni sensoriali viscerali ( vedi recensione 27 per i dettagli). Meccanismi neuronali che contribuiscono alla nocicezione e ipersensibilità colorettale a lungo termine sono stati rivelati e man...

Il dolore e ipersensibilità sono le lamentele predominanti dei pazienti affetti da disturbi gastrointestinali funzionali, tra cui la sindrome dell&#39;intestino irritabile (IBS), che esistono in assenza di apparenti cause patobiologico o danni ai tessuti. Ad esempio, i pazienti IBS presentano ipersensibilità, comprese reazioni accresciute a rettale distensione palloncino e una maggiore sensibilità durante la normale funzione intestinale, così come ipersensibilità di rinvio somatiche (ossia, la tenerezza alla palpazione della zona addominale) 1. Perché il targeting afferenze colorettali ha dimostrato di essere efficace per alleviare il dolore e ipersensibilità in pazienti con IBS (ad esempio, l&#39;instillazione intra-rettale di anestetici locali 2,3; ingestione orale della guanilato ciclasi C-agonisti linaclotide 4-6), una migliore comprensione della innervazione afferente del colon-retto è importante. Afferenze viscerali, tra cui afferenze del colon-retto, Sono in grado di rispondere alle modalità chimici / di nutrienti e termiche (ad esempio, 7-9). Tuttavia, afferenze viscerali che rispondono a stimoli meccanici (cioè, afferenze meccanosensibili) sono stati i più studiato a fondo, perché gli stimoli meccanici (ad esempio, distensione luminale, tratto) sono quelle che generalmente danno luogo a sensazioni coscienti, tra cui il disagio e il dolore 10-16. Inoltre, i visceri sono innervate da afferenze meccanicamente insensibili (MIAS), comunemente definiti silenziosi o dormire nocicettori 17. In condizioni fisiologiche normali, MIAS non rispondere alla stimolazione meccanica o abbia una grande risposta soglie 18, ma possono diventare attivi e acquisire mechanosensitivity in condizioni fisiopatologiche e contribuire alla ipersensibilità. Utilizzando la preparazione in vitro e il protocollo descritto qui, abbiamo sviluppato ed impiegato una strategia di stimolo elettrico al mare<html> RCH per terminazioni ricettive, atti a identificare imparziale di entrambe le terminazioni meccanosensibili e MIA nel colon-retto 19. L&#39;innervazione del colon-retto è derivato da splanchnic lombare (LSN) e del nervo pelvico (PN) percorsi, e include afferenze del colon che possono essere classificati in cinque classi meccanosensibili (sierose, mucose, muscoloso, muscoloso-mucosa, mesenterici) e una classe MIA 20. Utilizzando questa preparazione in vitro, abbiamo scoperto che MIAS colorettali mechanosensitivity acquisita (sensibilizzazione) a seguito di una breve esposizione dei loro campi recettivi ad una zuppa infiammatoria (IS), che ha sensibilizzato il 71% del MIAS nella via PN e il 23% del MIAS nella via LSN 19. Abbiamo anche documentato sensibilizzazione a lungo termine (fino a 28 giorni) del MIAS nel contesto di lunga durata ipersensibilità viscerale comportamentale (cioè, nei topi che ricevono trattamenti intracolonic con zymosan 21 o acido 2,4,6-trinitrobenzensulfonico (TNBS) 22) . jove_content &quot;&gt; Tra afferenze meccanosensibili, afferenze muscolari e muscolo-mucose sono le uniche classi che tonicamente codificano tratto circonferenziale del colon-retto (cioè, sono stiro-sensitive) e Subserve la codifica dei nocivi distensione colorettale 23,24. Utilizzando un controllato dal computer Attuatore di forza, abbiamo applicato uno standard, omogenea, e riproducibile tratto rampa in direzione circonferenziale del tessuto colorettale appiattita e ulteriormente classificati afferenti tratto-sensibili, bassa soglia e ad alta soglia 23. Inoltre, l&#39;andamento temporale della sensibilizzazione di stiramento afferenze -sensitive dopo zymosan intracolonic 21 o 22 TNBS trattamento corrisponde alla insorgenza, la persistenza, e / o il recupero dei comportamentale ipersensibilità viscerale, suggerendo un ruolo di afferenze colorettali tratto sensibile nel dolore viscerale e ipersensibilità.

<table><tbody><tr><td>Stereomicroscopio Leica MZ16</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera Leica IC D</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore</td><td>Mondo Strumenti di precisione, Inc.</td><td>SYS-DAM80</td><td>Amplificatore differenziale a basso rumore</td></tr><tr><td>Camera tissutale a due compartimenti</td><td>Su</td><td></td><td></td>misura</tr><tr><td>Power1401</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td>Power1401</td><td>Acquisizione dati, ingresso/uscita segnale analogico</td></tr><tr><td>Spike2 v5.02</td><td>Cambridge Electronic Design Limited</td><td></td><td>Pacchetto software che funziona con il monitor audio Power1401</td></tr><tr><td></td><td>Natus</td><td>Am </td><td></td>8</tr><tr><td>Stimolatore a impulsi quadrati</td><td>Natus</td><td>S48</td><td>Per erogare stimoli elettrici</td></tr><tr><td>Unità di isolamento fotoelettrico</td><td>Natus</td><td>PSIU6</td><td>Isolamento dello stimolo per ridurre il rumore</td></tr><tr><td>Microelettrodo bipolare concentrico</td><td>FHC Inc.</td><td>CBFFG75</td><td>Per erogare stimoli elettrici</td></tr><tr><td>Sistema a leva a doppia modalità</td><td>Aurora Scientific Inc.</td><td>Serie 300C</td><td>Per erogare stimoli meccanici</td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11252-00</td><td>Pinze con punte fini</td></tr></tbody></table>

in vitro caratterizzazione funzionale del topo colorettale afferent endings

In vitro Functional Characterization of Mouse Colorectal Afferent Endings

Questo video dimostra in dettaglio una singola fibra protocollo registrazione elettrofisiologica in vitro utilizzando un preparato del mouse colon-retto-nervo. L&#39;approccio permette l&#39;identificazione imparziale e caratterizzazione funzionale delle singole afferenze del colon-retto. Registrazioni extracellulari di potenziali d&#39;azione propagate (AP) che provengono da uno o pochi afferente (cioè, singolo-fibra) campi recettivi (RFS) del colon-retto sono costituiti da fasci di fibre nervose presi in giro. Il colon-retto viene rimosso sia con il bacino (PN) o splanchnic lombare (LSN) nervo collegato e aperta longitudinalmente. Il tessuto viene posto in una camera di registrazione, bloccato piatta e perfuso con soluzione di Krebs ossigenata. Stimolazione elettrica focale viene utilizzato per individuare le terminazioni afferenti colorettali, che vengono ulteriormente testati da tre stimoli meccanici distinti (smussare sondaggio, mucosa carezze e tratto circonferenziale) di categorizzare funzionalmente le afferenze in cinque mechanosensiclassi tive. Endings rispondono a nessuno di questi stimoli meccanici sono classificati come afferenze meccanico-insensitive (MIAS). Sia meccanosensibili e MIAS possono essere valutati per la sensibilizzazione (ad esempio, la risposta maggiore, soglia ridotta, e / o acquisizione di mechanosensitivity) per esposizioni localizzate del RFs ai prodotti chimici (per esempio, la zuppa infiammatoria (IS), la capsaicina, l&#39;adenosina trifosfato (ATP)). Descriviamo l&#39;apparecchio e la preparazione registrazione colorectum-nervo, raccolta di colon-retto con annesso PN o LSN, identificazione del RFs nel colon-retto, registrazione singola fibra da fasci nervosi, e l&#39;applicazione localizzata di prodotti chimici per l&#39;RF. Inoltre, le sfide della preparazione e l&#39;applicazione di stimolazione meccanica standardizzati vengono anche discussi.

La configurazione è illustrata nella figura 1. Esso comprende una camera di tessuto su misura che ospita il colon retto in un vano vasca silicone rivestito e il nervo attaccato in un vano d&#39;olio minerale contigui. La camera a due compartimenti stato lavorato da un blocco solido di plastica acrilica da una macchina CNC; il fondo di entrambi gli scomparti è stato successivamente rivestito con silicone ferma per consentire una facile pin giù del tessuto colorettale. AP extracellulari da fasci nervosi p...

Questo video dimostra un protocollo per condurre registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola su un preparato di nervo colorettato di topo in vitro.

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

This video demonstrates in detail an in vitro single-fiber electrophysiological recording protocol using a mouse colorectum-nerve preparation. The ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è caratterizzare funzionalmente le terminazioni nervose afferenti estrinseche nel retto del topo in vitro. Questo viene ottenuto isolando il colon-retto e il nervo pelvico o lombare di Splunk associato in continuità e posizionando il tessuto in una camera di registrazione in vitro. Come secondo passaggio, il tronco nervoso pelvico o lombare di Splunk viene suddiviso in fini filamenti in modo da poter effettuare registrazioni elettrofisiologiche da singole fibre nervose. Successivamente, le singole terminazioni nervose del colon-retto vengono identificate mediante stimolazione elettrica senza bias dei campi recettivi e classificate funzionalmente in base ai profili di risposta a tre distinti stimoli meccanici.Inoltre, le risposte ai composti chimici applicati alle terminazioni nervose possono essere testate isolando il campo recettivo con un pezzo di tubo in ottone e sostituendo la soluzione con quella contenente il composto chimico o una miscela di composti chimici. I risultati mostrano che il colon-retto del mouse è innervato da cinque diverse classi di EN meccanosensibili. Inoltre, circa il 25% degli EN del colon-retto è costituito da nocicettori meccanicamente insensibili o silenti.Questo metodo viene utilizzato da noi e da altri ricercatori per studiare l'innervazione sensoriale del colon-retto. Siamo interessati a utilizzare questo approccio di ricerca perché molte patologie gastrointestinali sono associate a una sensibilizzazione o a un cambiamento nell'eccitabilità dell'innervazione sensoriale. Il nostro interesse verso la comprensione dei meccanismi alla base della sensibilizzazione è legato al desiderio di contribuire allo sviluppo di strategie terapeutiche che potrebbero risultare utili nel modulare il dolore e il disagio tipicamente associati a queste patologie gastrointestinali, come la sindrome dell'intestino irritabile.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché le fasi di dissezione del tessuto e di suddivisione del nervo sono molto difficili da padroneggiare. I nervi che innervano il colon-retto distale possono essere facilmente danneggiati durante la dissezione.Pertanto, una dissezione accurata e le fasi di suddivisione sono davvero fondamentali per chi desidera replicare questo esperimento. Immediatamente dopo l'eutanasia di un topo, esanguelo, apri la cavità toracica, perfora l'atrio destro e immergi la carcassa del topo in circa mezzo litro di soluzione Creb fredda. Successivamente, rimuovi con attenzione tutte le viscere, tranne il colon e gli organi pelvici.Quindi sezionare trasversalmente il corpo del topo all'incirca a livello di T12, leggermente al di sopra del diaframma toracico, e trasferire la metà caudale del corpo in una camera per dissezione contenente soluzione Krebs gassata e fredda di ghiaccio. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere la vescica e gli organi riproduttivi sezionando le loro giunzioni con l'uretra. Rimuovere inoltre l'aorta discendente fino al punto in cui si biforca nelle arterie iliache comuni.Ora, liberare i nervi splancnici pelvici o lombari dai tessuti circostanti. Seguire i nervi a partire dall'esterno della cresta iliaca fino al punto di entrata nella colonna vertebrale. I nervi pelvici entrano nella colonna vertebrale a livello di L6 e S1, mentre i nervi splancnici lombari entrano a livello di T13 e L1, come dimostrato.Ecco la dissezione dei nervi pelvici sinistro e destro. Successivamente, recidere la sinfisi pubica e i giunti acetabolari destro e sinistro. Quindi rimuovere l'osso iliaco. Dopo aver rimosso l'iliaco, dissezionare il retto-colon distale con il nervo annesso libero.Il nervo è attaccato al muscolo circostante e al tessuto connettivo. Il nervo è suscettibile a danni meccanici. Deve essere liberato dal tessuto circostante, quindi è necessaria particolare attenzione per evitare di tirare o schiacciare il nervo.Quindi trasferire il colon-retto con il nervo attaccato alla camera del tessuto. Aprire longitudinalmente il colon-retto lungo il margine anti-mesenterico e posizionare il lato mucoso del colon-retto rivolto verso l'alto. Successivamente, estendere il nervo nel compartimento di registrazione, che è collegato al compartimento del bagno tramite un foro e una saracinesca.Posizionare il tronco nervoso su un piccolo specchio di vetro. Lo specchio è idrofilo e il nervo aderirà ad esso. Ora, vicino al comparto di registrazione, fissare con dei perni il margine mesenterico del colon-retto.Ora, sovrafondere un comparto bagno con soluzione Creb calda e ossigenata e riempire il comparto di registrazione con olio minerale per completare l'allestimento. Fissare la lunghezza antimesenterica del colon-retto a un pettine di ganci collegato a un attuatore di forza sotto il microscopio stereoscopico ad alta ingrandimento. Rimuovere con cura la guaina nervosa dal nervo pelvico o splancnico lombare isolato utilizzando pinzette fini.Separa il tronco nervoso in cinque o otto fasci nervosi, ciascuno spesso circa 100 micron. Posiziona ora l'elettrodo di riferimento a contatto con la soluzione di Krebs nella camera per tessuti. Quindi posiziona in sequenza i singoli fasci nervosi sull'elettrodo di registrazione per evocare potenziali d'azione dal plesso intrinseco rettocolico.Strofinare delicatamente la superficie colorettale utilizzando un pennello morbido. In questo modo, identificare il fascio o i fasci nervosi che innervano il colon. Ora, utilizzando una coppia di punte di ago da 30 gauge, suddividere ulteriormente il fascio nervoso in filamenti spessi 10 micron e posizionare uno dei filamenti sull'elettrodo di registrazione.Questo passaggio richiede un elevato livello di coordinamento occhio-mano e destrezza. Successivamente, per eccitare elettricamente le terminazioni nervose afferenti, posizionare l'elettrodo concentrico con estremità arrotondata perpendicolarmente alla superficie mucosa e stimolare con un'intensità superiore alla soglia. Ciò produce una diffusione della corrente su un raggio di due millimetri.Per individuare le terminazioni recettive, spostare l'elettrodo sistematicamente a passi di 1,5 millimetri lungo la lunghezza e la larghezza del co retto appiattito. Quando una terminazione afferente viene eccitata, regolare la posizione dell'elettrodo e l'intensità dello stimolo per localizzare con precisione il campo recettivo che richiede la minore intensità di stimolo per rispondere. Se la soglia di stimolo è superiore a tre milliampere, scartare quella terminazione nervosa e passare allo studio di un altro filamento nervoso.Ora calcolare la velocità di conduzione a partire dalla distanza tra l'elettrodo stimolante situato nel campo recettivo e il sito di registrazione, e dal ritardo di conduzione tra l'artefatto dello stimolo e l'inizio del potenziale d'azione. Dopo aver localizzato un campo recettivo mediante stimolo elettrico, applicare tre stimoli meccanici. In primo luogo, applicare uno stimolo esplorativo premendo perpendicolarmente la punta di un von Frey calibrato, come un monofilamento di nylon, verso il campo recettivo sul colon-retto appiattito.Utilizzare monofilamenti che producono una forza di 0,4 grammi e di un grammo. In secondo luogo, produrre uno stimolo di accarezzamento passando delicatamente un filamento sottile di nylon sulla mucosa colorettale, generando una forza di 10 milligrammi per indurre un lieve stress di taglio superficiale nel campo recettivo. In terzo luogo, effettuare lo stiramento circonferenziale mediante un attuatore di forza controllato da computer.Fare applicare una forza rampa allungata in direzione circonferenziale lungo il margine antimesenterico del colon-retto. Classificare ora il sistema nervoso enterico (ENS) come sieroso, mucosale, muscolare, mucosale o come afferente meccanicamente insensibile (MIAA), in base ai risultati dei tre test.Iniziare registrando una risposta di base a uno stimolo meccanico come nella sezione precedente, mediante una stimolazione meccanica ramped circonferenziale, di stiramento o perpendicolare per verificare la sensibilità chimica. Innanzitutto, ricoprire il bordo inferiore di un pezzo di tubo in ottone o acciaio inox con vaselina e posizionarlo sopra il campo recettivo sul retto-colon. Aspirare ora la soluzione di Krebs dall'interno del tubo e sostituire la soluzione con 170 microlitri di soluzione sperimentale.Lasciare il tubo in posizione per tre-cinque minuti, monitorando le risposte nell'afferente. Immediatamente dopo la rimozione del tubo, entro quattro-sei minuti, verificare la risposta afferente allo stesso stimolo meccanico utilizzato nella risposta basale. Dopo 15 minuti o più, si può considerare che i reagenti siano stati eliminati.Quindi lo stimolo meccanico viene applicato nuovamente. Per confrontarlo con le formiche di base, un nervo dissezionato è stato stimolato per individuare un campo recettivo. Il campo recettivo è stato identificato mediante una risposta potenziale d'azione, utilizzando il ritardo di conduzione del potenziale d'azione.La velocità di conduzione calcolata era di 0,43 metri al secondo, un valore ben all'interno del range di una fibra C non mielinizzata. Dopo aver identificato il campo recettivo, è stato esplorato perpendicolarmente mediante monofilamenti simili ai von Frey manovrati a mano, e inoltre delicatamente accarezzato con un filamento di nylon fine tenuto in mano. Le risposte del FRD alle stimolazioni sono state valutate anche mediante un attuatore di forza controllato da computer, che applica allo stesso punto del colon-retto una serie di forze meccaniche precisamente temporizzate e riproducibili.Allo stesso modo, lo stiramento circonferenziale del colon-retto è stato applicato con lo stesso sforzo dell'attuatore. Le risposte possono essere distinte in base alle risposte alla stimolazione tattile, alla stimolazione con sfregamento e allo stiramento; le risposte di un'afferente sensibile allo stiramento sono state evocate da tre stiramenti circonferenziali consecutivi separati da cinque minuti. Il numero di potenziali d'azione è stato accuratamente registrato e rappresentato come funzioni di risposta allo stimolo, rivelando un'elevata riproducibilità sia per l'ampiezza della risposta sia per la soglia di risposta.Sono stati applicati i seguenti prodotti chimici. L'attivazione diretta di ens si è verificata dopo l'applicazione di una soluzione ipertonica acida, a seguito dell'applicazione di un "brodo" infiammatorio a un'afferente meccanicamente insensibile. Non si è osservata alcuna attivazione della terminazione nervosa, ma era evidente l'acquisizione di una minore sensibilità.Un'afferenza sensibile alla trazione, meno sensibile, è stata inoltre sensibilizzata alla trazione meccanica del campo recettivo dopo l'applicazione di una soluzione infiammatoria. Una volta acquisita padronanza della tecnica, di solito occorrono da tre a quattro ore per completare la dissezione del tessuto e ottenere la registrazione da una singola fibra. Un esperimento tipico richiede un'intera giornata dalla preparazione al termine. Dopo aver visto questo video, dovreste aver compreso come rimuovere chirurgicamente e prelevare il colon-retto con i nervi ad esso collegati.Quindi sarà possibile effettuare la registrazione da singole fibre Ahern nel nervo pelvico o nel nervo splancnico lombare, che innervano il colon, utilizzando una strategia di ricerca elettrica non selettiva. Dovreste quindi essere in grado di identificare le terminazioni recettive nel retto e testarle per la sensibilità meccanica così come per la sensibilità chimica, applicando sostanze direttamente sulle terminazioni recettive. Questo preparato rappresenta un modello potente che consente di studiare meccanismi fisiopatologici così come domande fisiologiche di base a livello colorettale.

in-vitro-functional-characterization-mouse-colorectal-afferent

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

In questo video, descriviamo una procedura chirurgica per generare un'ansa del colon prossimale di topo o un segmento pcLoop seguita da un'iniezione intraluminale di marcatori fluorescenti nel segmento per studiare la permeabilità epiteliale intestinale.

Generazione di un modello di ansa del colon prossimale di topo: una procedura chirurgica per generare un'ansa del colon prossimale e misurare la permeabilità intestinale rilevando marcatori fluorescenti nel siero dopo l'iniezione intraluminale

Questo video dimostra un metodo per registrare l'attività dei nervi afferenti del colon in un colon di ratto ex-vivo, incannulati ad entrambe le estremità e infusi con soluzione salina per aumentare la pressione intraluminale. All'aumentare della pressione, il segnale nervoso aumenta, indicando la sua stimolazione.

Registrazione elettrofisiologica dai nervi afferenti del colon in un colon di ratto ex vivo

Questo video mostra il processo di registrazione dei segnali elettrici dai nervi afferenti mesenterici in un segmento digiunale di topo sezionato per studiare gli effetti della pressione tissutale e dei cambiamenti di movimento sull'attività del nervo afferente.

Registrazione dell'attività del nervo afferente mesenterico in un segmento di digiuno di topo ex vivo

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imaging del sistema nervoso enterico. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Questo video dimostra il calcio imaging per visualizzare e analizzare l'attività dei neuroni enterici e della glia nelle preparazioni del plesso mienterico del colon di topo.

Imaging del calcio delle attività dei neuroni enterici e della glia in un plesso mienterico del colon di topo

Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia,...

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

Negli ultimi anni, endoscopi di nuova generazione sono emersi come importanti ausili di ricerca diagnostici per la valutazione colite murina e tumori colorettali. Presentiamo qui un protocollo dettagliato per la valutazione endoscopica di infiammazione e tumori colorettali nei topi, nonché un sistema di punteggio romanzo che utilizza gli identificatori decimali per documentare la gravità endoscopica di colite e tumori colorettali.

La colonscopia flessibile in topi per valutare la gravità della colite e colon-retto Tumori Utilizzo di un sistema Validated endoscopica Scoring

Descriviamo metodi per il monitoraggio longitudinale dell'efficacia delle terapie per il trattamento delle patologie del colon nei topi utilizzando un endoscopio rigido. Questo protocollo può essere facilmente utilizzato per la caratterizzazione della risposta terapeutica di un singolo tumore in topi vivi e anche per il monitoraggio di potenziali recidive di malattia.

Valutazione non invasiva della efficacia di nuove terapie per patologie intestinali Utilizzando Serial Imaging endoscopica Live Mice

Questo articolo descrive una tecnica di imaging video e una mappatura spazio-temporale ad alta risoluzione per identificare i cambiamenti nella regolazione neurale della motilità del colon nei topi adulti. Effetti sottili sulla funzione gastrointestinale (GI) possono essere rilevati utilizzando questo approccio in preparati tissutali isolati per migliorare la nostra comprensione della malattia gastrointestinale.

Video Imaging e mappe spazio-temporale per analizzare la motilità gastrointestinale nei topi

I nervi afferenti mesenterici trasmettono informazioni dal tratto gastrointestinale verso il cervello riguardanti la normale omeostasi e la fisiopatologia. L'attività del nervo afferente gastrointestinale può essere valutata montando segmenti intestinali isolati con nervi afferenti attaccati in un bagno d'organo, isolando il nervo e valutando l'attività basale e stimolata.

In Vitro registrazione di mesenterica afferenti attività del nervo nel topo digiunale e segmenti del colon

Anormale funzione sensoriale è alla base di dolore viscerale e altri sintomi delle malattie intestinali infiammatorie e funzionali. Un protocollo per la registrazione elettrofisiologica dei nervi afferenti colici in una preparazione di colorectum del ratto ex vivo è presentato qui.

In Vitro Caratterizzazione delle proprietà elettrofisiologiche di fibre afferenti coliche in ratti

Cellule enterocromaffini (EC) comprendono un piccolo sottoinsieme delle cellule epiteliali gastrointestinali. Dalle cellule EC sono elettricamente eccitabili e rilascio della serotonina, ancora difficoltà nella coltura e nell'identificazione di cellule EC hanno limitato gli studi fisiologici. Il metodo presentato qui stabilisce un modello di cultura primaria suscettibile di esame delle singole cellule EC di elettrofisiologia.

A cellula intera elettrofisiologia di cellule enterocromaffini murino coltura primaria

Impara a caratterizzare le terminazioni afferenti extrinseche nel colonretto del topo in vitro. Questo metodo elettrofisiologico permette di registrare fibre singole e classificare le risposte meccanochemiche.

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

Esplora altri video