In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di caratterizzare funzionalmente le terminazioni nervose afferenti estrinseche nel coretto del topo in vitro. Ciò si ottiene raccogliendo il nervo colorettale e il nervo del collo Splunk pelvico o lombare collegato in continuum e posizionando il tessuto in una camera di registrazione in vitro Come secondo passaggio, il tronco del nervo del collo Splunk pelvico o lombare viene diviso in filamenti sottili in modo che le registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola possano essere effettuate di singoli assoni nervosi. Successivamente, le singole terminazioni nervose del colon-retto sono identificate mediante stimolazione elettrica imparziale dei campi recettivi e classificate funzionalmente in base ai profili di risposta a tre distinti stimoli meccanici.

Inoltre, le risposte alle sostanze chimiche applicate alle terminazioni nervose possono essere testate isolando il campo ricettivo con un pezzo di tubo di ottone e sostituendo la soluzione con la soluzione contenente la sostanza chimica o la miscela di sostanze chimiche. I risultati mostrano che il colon-retto del topo è innervato da cinque diverse classi di ens meccanosensibili. Inoltre, circa il 25% degli ens colorettali sono nocicettori meccanicamente insensibili o silenziosi.

Questo metodo viene utilizzato da noi e da altri per studiare l'innervazione sensoriale del colon-retto. Siamo interessati a utilizzare questo approccio di ricerca perché molti disturbi gastrointestinali sono associati alla sensibilizzazione o a un cambiamento nell'eccitabilità dell'innervazione sensoriale. Il nostro interesse per la comprensione dei meccanismi della sensibilizzazione è legato al nostro desiderio di aiutare a sviluppare strategie terapeutiche che poi potrebbero essere utili per modulare il dolore e il disagio tipicamente associati a questi disturbi gastrointestinali, come la sindrome dell'intestino irritabile.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la dissezione dei tessuti e le fasi di scissione dei nervi sono molto difficili da padroneggiare. I nervi che innovano. Il colon-retto distale può essere facilmente danneggiato durante la dissezione.

Pertanto, un'attenta dissezione e le fasi di sdoppiamento sono davvero fondamentali per coloro che vogliono replicare questo esperimento. Immediatamente dopo l'eutanasia un topo lo dissangua, taglia la camera toracica, perfora l'atrio destro e immergi la carcassa del topo e circa mezzo litro di soluzione ghiacciata di Creb. Quindi, rimuovere con cura tutti i visceri tranne il colon e gli organi pelvici.

Quindi sezionare il corpo del topo a circa T 12 leggermente sopra il diaframma toracico e trasferire la metà del corpo in una camera di dissezione contenente una soluzione di bolle ghiacciate. Sotto uno stereoscopio, rimuovere la vescica e gli organi riproduttivi sezionando le loro giunzioni all'uretra. Inoltre, rimuovere l'aorta discendente fino a quando non si biforca nelle arterie iliache comuni.

Ora, libera i nervi del collo pelvico o lombare dai tessuti circostanti. Segui i nervi dall'esterno della cresta iliaca fino al loro punto di ingresso nella colonna vertebrale. I nervi pelvici entrano nella colonna vertebrale L sei e S uno e i nervi lombari entrano in T 13 e L uno dimostrato.

Ecco la dissezione dei nervi pelvici sinistro e destro. Successivamente, tagliare la sintesi pubica e tagliare le articolazioni acetabolari destra e sinistra. Quindi rimuovere l'osso iliaco Dopo aver rimosso l'iliaco, sezionare il colon-retto distale con il nervo attaccato libero.

Il nervo attaccato dal muscolo circostante e dal tessuto connettivo. Il nervo è suscettibile ai danni meccanici. Veniamo liberati dal tessuto circostante, quindi è necessario prestare particolare attenzione per evitare di tirare o pizzicare il nervo.

Quindi trasferire il colon-retto con il nervo attaccato nella camera tissutale. Aprire il colon-retto longitudinalmente lungo il bordo anti-mesenterico e posizionare la mucosa colorettale con il lato rivolto verso l'alto. Quindi estendere il nervo nel vano di registrazione, che è collegato al vano del bagno tramite un foro per il mouse e un cancello.

Posizionare il tronco nervoso su un piccolo specchio di vetro. Lo specchio è idrofilo e il nervo vi aderirà. Ora accanto al vano di registrazione, appuntate il bordo mesenterico del colon-retto.

Ora super fondere un vano del bagno con una soluzione calda ossigenata di Creb e riempire il vano di registrazione con olio minerale per completare la configurazione. Attaccare la lunghezza anti mesenterica del colon-retto a un rastrello di uncini collegati a un attuatore di forza sotto lo stereomicroscopio ad alto ingrandimento. Staccare con cura la guaina nervosa dal nervo del collo pelvico o lombare isolato utilizzando una pinza fine.

Stuzzicare il tronco nervoso in cinque o otto fasci nervosi spessi ciascuno di circa 100 micron. A questo punto, mettere l'elettrodo di riferimento a contatto con la soluzione di Krebs nella camera tissutale. Quindi posizionare in sequenza i singoli fasci nervosi sull'elettrodo di registrazione per evocare i potenziali d'azione dall'ense colorettale.

Accarezzare delicatamente la superficie colorettale con un pennello morbido. Identifica quindi il fascio o i fasci nervosi che innervano il colon. Ora, utilizzando un paio di punte di aghi calibro 30, dividere ulteriormente il fascio nervoso in filamenti spessi 10 micron e posizionare uno dei filamenti sull'elettrodo di registrazione.

Questo passaggio richiede un alto livello di coordinazione occhio-mano e destrezza. Quindi, per eccitare elettricamente le terminazioni nervose afferenti, posizionare l'elettrodo concentrico a punta tonda perpendicolare alla superficie della mucosa e stimolare a un'intensità superiore alla soglia. Questo produce una diffusione di corrente su un raggio di due millimetri.

Per trovare le terminazioni ricettive, spostare sistematicamente l'elettrodo con incrementi di 1,5 millimetri lungo la lunghezza e la larghezza del coretto appiattito. Quando un finale afferente è eccitato, regolare la posizione dell'elettrodo e l'intensità dello stimolo per individuare il campo recettivo che richiede la minima intensità dello stimolo per rispondere. Se la soglia di stimolo è maggiore di tre milliampere, scartare quella terminazione nervosa e passare allo studio di un altro filamento nervoso.

Ora calcola la velocità di conduzione dalla distanza tra l'elettrodo stimolante nel campo recettivo e il sito di registrazione, e dal ritardo di conduzione tra l'artefatto stimolo e l'insorgenza del potenziale d'azione. Dopo aver localizzato un campo ricettivo mediante stimolo elettrico, applicare tre stimoli meccanici. In primo luogo, applicare uno stimolo di sondaggio premendo la punta di una sfilacciatura di von calibrata, come un monofilamento di nylon, perpendicolarmente verso il campo recettivo sul colon-retto appiattito.

Utilizzare monofilamenti che producono una forza di 0,4 grammi e un grammo. In secondo luogo, produrre uno stimolo di carezza accarezzando delicatamente la mucosa colorettale con un sottile filamento di nylon che produce una forza di 10 milligrammi per generare un piccolo sforzo di taglio superficiale nel campo recettivo. In terzo luogo, eseguire l'allungamento circonferenziale utilizzando un attuatore di forza controllato da computer.

Fategli erogare una forza allungata a rampa in direzione circonferenziale lungo il bordo anti-mesenterico del colon-retto. Ora classificare l'ENS come sieroso, mucoso, muscolare, muscolare, o MIAA, meccanicamente insensibile, afferente. Sulla base dei risultati dei tre test.

Iniziare registrando una risposta di base a uno stimolo meccanico come nella sezione precedente mediante un sondaggio meccanico circonferenziale a rampa, allungamento o perpendicolare per testare la sensibilità chimica. Per prima cosa rivestire il bordo inferiore di un pezzo di tubo di ottone o acciaio inossidabile con petrolio e posizionarlo sul campo ricettivo sul colon-retto. Ora aspirare la soluzione di Krebs dall'interno del tubo e sostituire la soluzione con 170 microlitri di soluzione di prova.

Lasciare il tubo in posizione per tre-cinque minuti mentre si monitorano le risposte nell'afferenza. Immediatamente dopo aver rimosso il tubo entro quattro-sei minuti, testare la risposta afferente allo stesso stimolo meccanico della risposta basale. Dopo 15 o più minuti, i reagenti possono essere considerati lavati via.

Quindi lo stimolo meccanico viene applicato di nuovo. Per confrontare con le formiche di base, un nervo sezionato è stato stimolato per trovare un campo ricettivo. Il campo recettivo è stato identificato da una risposta al potenziale d'azione utilizzando il ritardo di conduzione del potenziale d'azione.

La velocità di conduzione calcolata era di 43 metri al secondo, che è ben nell'intervallo di una fibra C non mielinizzata. Dopo aver identificato il campo recettivo, è stato sondato perpendicolarmente da monofilamenti di von fray portatili e anche delicatamente accarezzato da un filamento di nylon sottile portatile. Le risposte AFR al sondaggio sono state valutate anche da un attuatore di forza controllato da computer che eroga allo stesso sito sul colon-retto, una serie di forze meccaniche temporizzate e riproducibili con precisione.

Allo stesso modo, il tratto circonferenziale del colon-retto è stato erogato dallo stesso sforzo dell'attuatore. Le risposte possono essere distinte in base alle risposte al sondaggio, all'accarezzamento e alle risposte di stiramento da un'afferenza sensibile all'allungamento evocate da tre tratti circonferenziali consecutivi separati da cinque minuti. I numeri dei picchi sono stati fissati in modo uniforme e visualizzati come funzioni di risposta allo stimolo, rivelando un'elevata riproducibilità e sia l'entità della risposta che la soglia di risposta.

Successivamente sono state applicate le sostanze chimiche. L'attivazione diretta di ens si è verificata dopo l'applicazione di una soluzione ipertonica acida dopo l'applicazione di una zuppa infiammatoria a un afferente meccanicamente insensibile. Non si è verificata alcuna attivazione del finale, ma è stata evidente l'acquisizione della meno sensibilità.

Un'afferenza sensibile allo stiramento e meno sensibile è stata anche sensibilizzata allo stiramento meccanico del campo recettivo dopo l'applicazione di una zuppa infiammatoria Una volta padroneggiata, di solito ci vogliono dalle tre alle quattro ore per completare la dissezione tissutale e ottenere la registrazione di una singola fibra. Un tipico esperimento richiede un'intera giornata dall'inizio alla fine. Dopo aver visto questo video, dovresti capire come rimuovere chirurgicamente e raccogliere il colon-retto con i nervi attaccati.

Quindi essere in grado di registrare da singole fibre di Ahern nel nervo pelvico o nel nervo lombare, innervando il colon utilizzando una strategia di ricerca elettrica imparziale. Dovresti quindi essere in grado di identificare le terminazioni ricettive nel coretto e testarle per la sensibilità meccanica e la sensibilità alla chemio applicando sostanze chimiche direttamente alle terminazioni ricettive. Questo preparato è un potente preparato che consente di studiare i meccanismi fisiopatologici e le questioni fisiologiche di base nel colon-retto.