Name: Indagare le proteine prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Scopri la propagazione prionica delle proteine e la tossicità associata utilizzando il nematode C. elegans come organismo modello. Questo metodo combina microscopia a fluorescenza time-lapse e screening RNAi genome-wide per identificare nuovi modificatori della tossicità indotta da proteine PreOn-like, offrendo approcci terapeutici potenziali per le malattie neurodegenerative.

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Ringraziamo Cindy Voisine e Yoko Shibata per l'utile discussione e i commenti critici sul manoscritto. Ringraziamo l'High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) e il Biological Imaging Facility (BIF) della Northwestern University per la loro assistenza. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni del National Institutes of Health (NIGMS, NIA, NINDS), della Ellison Medical Foundation e della Daniel F. e Ada L. Rice Foundation (a R.I.M.). C.I.N.-K. era sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR 3726/1-1).

1. Monitoraggio transcellulare Diffusione delle proteine ​​prioniche come in vivo Time-lapse imaging NOTA: Grow C. elegans wild-type (WT) (N2) e linee transgeniche secondo metodi standard e controllare attentamente la temperatura di coltivazione 47. <ol><li> Generare linee transgeniche di C. elegans esprimere la proteina prionica simile, taggati con proteina monomerica fluorescente rossa (MRFP). Guarda questo video che illustra come utilizzare microiniezione 48. Per ulteriori dettagli e metodi che descrivono come integrare queste linee extracromosomici, vedi 49. </li><li> Preparare popolazioni sincronizzati da deposizione delle uova o imbianchimento secondo metodi standard 50. <ol><li> La sincronizzazione per la deposizione delle uova <ol><li> Transfer 10-20 adulti gravide su un piatto e lasciarli depongono le uova per 1 - 2 ore. Rimuovere gli adulti dalla piastra e lasciare che la progenie crescere fino all&#39;età desiderato. </li></ol></li> &lt;li&gt; Sincronizzazione per sbiancamento <ol><li> Raccogliere una popolazione non sincronizzato di adulti gravide e candeggiare con soluzione alcalina ipoclorito (NaOH 250 mM e 1: 4 (v / v) diluizione del candeggiante commerciale in H 2 O). Lavare le uova due volte (218 g per 1 min) con tampone M9 47 (21 MMNA 2 HPO 4 · 7H 2 O, 22 mMKH 2 PO 4, 86 mMNaCl, 1 mMMgSO 4 · 7H 2 O, aggiungere dH 2 O fino a 1 L). </li><li> Consentire loro di schiudono in tampone M9 con agitazione O / N a 20 ° C. Sviluppo Worm arresterà nella fase L1 in assenza di una fonte di cibo, lasciando una popolazione sincronizzato. Trasferire L1S sul fresco nematodi crescita media (NGM) piastre seminati con OP50 E. coli, batteri e lasciare che la progenie di sviluppare fino a quando il 47 di età desiderata. </li></ol></li></ol></li><li> Preparare 2% agarosio (pastiglie in H 2 O) su un vetrino 50 come descritto. <ol><li> Preparare due kmvetrini croscope con nastro etichettatura posto sopra tutta la loro lunghezza da utilizzare come distanziatori. Inserire un terzo vetrino da microscopio tra loro. </li><li> Sciogliere 2% agarosio in H 2 O e pipetta una goccia sul vetrino pulito. </li><li> Inserire una quarta diapositiva perpendicolare agli altri tre slitte sulla cima della goccia agar. Premere delicatamente il basso per appiattire il pad allo stesso spessore del nastro di etichettatura. </li><li> Lasciare asciugare per 1 minuto prima di rimuovere i distanziali e tirando delicatamente le diapositive a parte. Il pad agar si attacca a uno di loro. </li></ol></li><li> Deporre circa 10 ml di anestetico (levamisolo 2 mM in tampone M9) per il pad e trasferimento ~ 10 animali con un pick filo di platino. Coprire con un vetrino (~ 22 x 22 mm) e prendere le immagini entro 1 ora. </li><li> In alternativa, per acquisire i filmati su un periodo di tempo più lungo o di ridurre ulteriormente la possibilità di qualsiasi movimento degli animali, utilizzare una combinazione di anestetico e tallone di immobilizzazione 51. <ol><li> Preparare 10% agapastiglie rosa (in tampone M9) come descritto 51 e aggiungere vermi a 3 ml soluzione standard di dimensioni nanosfere (perle di polistirene, 100 nm) più 3 ml di anestetico (levamisolo 4 mM in tampone M9). Coprire delicatamente con un vetrino. Per evitare la disidratazione, sigillare il vetrino con VALAP (miscela di uguali quantità di vaselina, lanolina e cera di paraffina). </li></ol></li><li> Immagine immobilizzato vermi utilizzando un microscopio confocale. NOTA: I risultati sono ottenuti utilizzando un Spinning disco AF confocale microscopio equipaggiato con una fotocamera EM-CCD e di un software di Microscopia Automation &amp; Image Analysis come MetaMorph e delineano le specifiche di seguito, ma altri sistemi comparabili di imaging confocale possono anche essere utilizzati. <ol><li> Utilizzare l&#39;obiettivo olio 63X o 100X / 1.4NA e posizionare il vetrino contenente vermi nel supporto microscopio. </li><li> Aprire il software. Regolare potenza del laser e filtri per l&#39;imaging MRFP. Utilizzare il laser 561 nm al 10% di potenza e delle emissioni filtro&gt; 600 nm. </li><li&gt; Apri &quot;MultiDimensional Acquisition&quot;. Nella scheda &quot;Principale&quot;, selezionare le caselle per &quot;Timelapse&quot; e &quot;Run Journals&quot; (Hardware Auto Focus: off). </li><li> Nella scheda &quot;Salvataggio&quot; selezionare o creare la cartella directory in cui devono essere salvati i file. Assegnare un nome al file. </li><li> Nella scheda &quot;Lunghezza d&#39;onda&quot;, selezionare l&#39;illuminazione adeguata e regolare l&#39;esposizione e il guadagno. Utilizzare &quot;YokoQuad Red&quot; (o un&#39;impostazione illuminazione equivalente per l&#39;imaging MRFP) con una esposizione tra 100 e 300 msec e un guadagno telecamera tra 100 e 300, a seconda del singolo campione (valutata utilizzando l&#39;immagine dal vivo). </li><li> Nella scheda &quot;Timelapse&quot; selezionare &quot;Numero di punti di tempo&quot; = 301, &quot;Durata&quot; = 5 min e &quot;Time / Intervallo&quot; = 1 sec. </li><li> Sotto la &quot;Journals&quot; tab selezionare Journal: &quot;AFC SET Z HOLD&quot; e &quot;AFC Return to Z HOLD&quot;, Type: &amp;# 8220; Speciale &quot;(due volte), punto di partenza:&quot; Inizio ora point &quot;e&quot; End of time point &quot;. Questa opzione autofocus è importante per l&#39;immagine della stessa sezione su un periodo di tempo più lungo. </li><li> Quando il setup è stato fatto, premere il tasto &quot;Acquisisci&quot;. Il video timelapse è Safed come file TIFF separati. </li><li> Aprire tutti i file TIFF di una data serie storica in ImageJ. Andare su &quot;Immagine&quot; → &quot;Stacks&quot; → &quot;Immagini Stacks&quot;. Facoltativamente, regolare la luminosità e il contrasto, aggiungere bar dimensioni, ecc esportare il filmato in &quot;File&quot; → &quot;Salvo&quot; → &quot;AVI ...&quot; (per un esempio, vedere Video 1 e 2 corrispondente alla figura 1). </li></ol></li></ol> 2. Utilizzando pieghevoli Sensori e Reporters stress per Indagare cellulare autonoma e non cellule autonoma influisce sulla Proteostasis e tossicità <ol><li> Generare linee transgeniche che coesprimere un sensore di piegatura o stress reporter insieme con la proteina prionica simile. Per i metodi su come stabilire croci o generare linee transgeniche, vedi 48,49,52. Vedere la Tabella 1 per un elenco di C. ceppi elegans che possono essere utilizzati. </li><li> Preparare popolazioni sincronizzate di animali transgenici e di farle crescere fino all&#39;età desiderata come descritto in precedenza (punto 1.2) 50. </li><li> Utilizzando uno stereomicroscopio, esaminare il relativo fenotipo del sensore di piegatura o stress giornalista. <ol><li> Per il sensore di piegatura, determinare il numero di animali ospitano aggregati di ciascun giorno dopo la sincronizzazione (per esempio, vedere la Figura 2E e F). </li><li> Per il giornalista stress, prova se la coespressione dei risultati proteina prionica simile a un aumento di fluorescenza del reporter (per esempio, vedere la Figura 3). </li></ol></li></ol> 3. Schermo Genome-wide per soppressione di tossicità Prion-indotta in C. elegans<img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52321/52321fig4highres.jpg" /> Figura 4. Rappresentazione schematica del protocollo di screening RNAi. Vedere sezione Protocollo 3 per una descrizione dettagliata delle singole fasi. <ol><li> Sincronizzazione di C. worm elegans e duplicazione di biblioteca RNAi <ol><li> Per lo schermo RNAi, utilizzare la libreria Ahringer RNAi (o la libreria Vidal RNAi) 53,54. Rearray biblioteca RNAi dall&#39;originale 384 format e in 96 pozzetti riempiendo le piastre con 100 microlitri LB-amp media (50 mg / ml ampicillina in LB) integrati con il 10% di glicerolo e inoculare con un replicatore 96-pin. Coltivare a 37 ° CO / N con agitazione e conservare a -80 ° C. </li><li> Mantenere C. elegans WT e linee transgeniche a 20 ° C su NGM piastre seminate con OP50 E. coli secondo metodi standard 47. </li><li>Sincronizzare transgenici dominio prione e WT (controllo) nematodi sbiancamento (vedi sezione 1.2). </li><li> Lo stesso giorno che i vermi sono sbiancati, preparare mezzi LB integrato con 50 mg / ml di ampicillina. Utilizzare un distributore automatico di reagente per erogare (o pipetta manuale) 65 l di media LB-amp in tutti i pozzetti di una piastra ben 96. </li><li> Rimuovere 96 e piastre di libreria Ahringer RNAi da -80 ° C e portarli ad una cappa sterile, foderato con carta da cucina. Rimuovere immediatamente la guarnizione nastro tenendo la piastra capovolta mentre piastre sono ancora congelati, avendo cura di evitare la contaminazione da ghiaccio sulla parte esterna delle piastre. Reinvert i piatti e lasciarli scongelare per circa 30 min. </li><li> Immergere una sterile 96 pin replicatore in un RNAi piatto biblioteca, e poi in una nuova piastra LB-amp. Utilizzare un replicatore fresca sterile per ogni piatto. Sigillare tutti i piatti con adesivo nastro di alluminio e restituire le piastre di libreria a -80 ° C. I replicatori possono essere immersi in candeggina, risciacquati,e sterilizzati in autoclave per essere usato di nuovo. </li><li> Lasciare piastre RNAi duplicati di crescere O / N in un incubatore a 37 ° C e 300 rpm. Per utilizzare HT115 E. coli batteri ospitanti il vettore vuoto (L4440) come controllo, crescono separatamente in una provetta di coltura e quindi pipettare 65 ml di coltura con una pipetta multicanale in un quarto dei due piastre da 96 pozzetti. </li></ol></li><li> Induzione della produzione dsRNA batterica e l&#39;aggiunta di vermi <ol><li> Diluire isopropil-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) ad una concentrazione di 5 mM in DDH 2 O. Utilizzare una workstation automatizzata con una testa multicanale per erogare (o pipetta manuale) 10 ml di IPTG diluito in tutti i pozzetti dei batteri RNAi e le piastre di controllo. Richiudere e posizionare le piastre di nuovo nel incubatore. Lasciate che agitare per 3 ore a 37 ° C. </li><li> Mentre i batteri sono agitazione, preparare i vermi. Mescolare la / sospensioni verme M9 bene, e pipetta un piccolo campione (~ 5-10 microlitri) di un vetrino da microscopio in vetro. Contareil numero di vermi allo stereomicroscopio e calcolare il numero di worm per ml. </li><li> Usando una tecnica sterile, preparare una soluzione integrata M9 (M9 +) con le seguenti concentrazioni finali: 0.20 mg / ml IPTG, 8,0 mg / Colesterolo ml, 50 ug / ml ampicillina, 9,6 ug / ml tetraciclina, 0,0835 mg / ml Fungizone, e 15 vermi per 50 ml. <ol><li> Fai soluzioni separate per transgenici dominio prioni e vermi WT. Il volume finale della soluzione verme M9 + necessario dipenderà dal numero di piastre RNAi copiati (vedi sotto), oltre a ~ 30 ml di volume morto che rimarrà nel serbatoio, se viene utilizzato un distributore automatico. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;induzione 3 ore di produzione dsRNA batterica, prendere i piatti fuori dell&#39;incubatore e lasciarli raffreddare a RT (~ 30 min) per evitare il calore stress agli animali. </li><li> Pipettare 50 microlitri dominio prionica soluzione verme transgenico M9 + a ciascun pozzetto di piastre RNAi e una delle piastre di controllo vettoriale vuoti. FareAssicurarsi di miscelare la soluzione verme prima ogni passo come gli animali tendono a sedimentare sul fondo del serbatoio. </li><li> Dispensare vermi WT nella seconda piastra di controllo. Lasciare le piastre non sigillati per consentire l&#39;aerazione. Per mantenere la coltura liquida di evaporare, impilare 4 - 5 piatti insieme e avvolgere con un tovagliolo di carta umido e un foglio di alluminio. Incubare a 200 rpm a 20 ° C per 4 giorni. </li></ol></li><li> Punteggio NOTA: Dopo 4 giorni in incubatrice, i vermi saranno al secondo giorno di età adulta e sono pronti a schermo. Lasciate che gli animali si abituano a condizioni non si stringono per 30 minuti prima di screening per assicurare botte indisturbati. <ol><li> Usando una telecamera Falcon 4M60 collegata a un computer con un monitor, schermo visivo per una maggiore botte rispetto di controllo trattati dominio prioni animali transgenici. </li><li> Compilare un elenco di visite preliminari per confermare con wrMTrck (vedere la sezione successiva). </li></ol></li></ol> 4. Conferma di preliminareHits schermo <ol><li> Motilità test su lastre solide <ol><li> Preparare piatti con NGM integrati con 100 mg / ml di ampicillina, 12,5 mcg / ml tetraciclina e 1 mM IPTG, secondo metodi standard 47. Se possibile, utilizzare una macchina-piatto versando per assicurare tutte le lastre hanno la stessa altezza dei media, che consentirà un processo di acquisizione di video più snello. </li><li> Grow diversi cloni RNAi in ~ 1 ml LB + 50 ug / ml ampicillina, O / N a 37 ° C e 250 rpm. </li><li> Il giorno successivo, indurre l&#39;espressione del dsRNA con 1 mM IPTG per 3 ore. Seed le piastre con 150 ml di ogni clone batterico RNAi, si sviluppa in uno strato sottile. Lasciate che i batteri a secco per 2 giorni a temperatura ambiente al buio. Preparare 3 piastre per RNAi clone. </li><li> Sincronizzare la popolazione verme sbiancando secondo metodi standard 50 (vedere paragrafo 1.2), e lasciare che le uova si schiudono O / N in M9 media. </li><li> Prelevare un campione della sospensione senza fine e determinare la quantità di nematodes per microlitri al stereomicroscopio. Poi, pipetta la quantità corretta di M9 più vermi in ogni piatto sperimentale in modo che contenga 25-30 vermi L1. Crescere i nematodi a 20 ° C per 4 giorni, fino a raggiungere i vermi giorno 2 di età adulta. </li></ol></li><li> L&#39;analisi quantitativa del verme motilità con il plugin wrMTrck per ImageJ NOTA: I video sono stati registrati usando uno stereomicroscopio a 10X di ingrandimento con un Hamamatsu Orca-R2 fotocamera digitale C10600-10B e il software di imaging PCI Simple Hamamatsu. <ol><li> Accendere la fotocamera e il software semplice di imaging PCI. Clicca su &quot;Live&quot; per consentire la regolazione delle condizioni di imaging. </li><li> Impostare le condizioni video come segue: Guadagno = 0; Light Mode = Alta; Velocità Index = 1; Binning = 2. Fare clic su &quot;Auto Exposé&quot; e quindi regolare le condizioni di luce, spostando gli specchi microscopio e di luminosità e contrasto quadranti. NOTA: Il video deve avere un alto contrasto senza essere Sovraesposed, in modo che gli animali appaiono come figure nere su sfondo luminoso. </li><li> Clicca su &quot;Time Scan&quot; e scegliere una cartella e un nome di file. Impostare &quot;Campo Delay&quot; a 20 msec e &quot;Stop a Time&quot; per 30 sec. Premere &quot;Live Review&quot; per scegliere la zona della piastra di registrazione (dove la maggior parte vermi). Toccare la piastra 3 o 4 volte sul palco, subito confermare la sua posizione nel campo della visualizzazione e premere &quot;Start&quot;. </li><li> Dopo il film termina la registrazione, fate clic destro sull&#39;immagine e scegliere &quot;Esporta Montage Sequence&quot; per esportare il filmato da un formato ad un .cxd .avi. </li></ol></li><li> Analizzando i video motilità <ol><li> Aprire il software ImageJ, vai alla scheda &quot;Plugins&quot;, poi &quot;wrmtrck&quot; e selezionare &quot;Batch wrMTrck&quot;. Selezionare la directory contenente tutti i file da analizzare. </li><li> Nella finestra di immissione principale wrMTrck_Batch, caricare i valori di input, come specificato nel Figure 5C. Spiegazione per ciascuno dei parametri si trovano nelle istruzioni che accompagnano il plugin. Fare clic su &quot;OK&quot; e consentire l&#39;esecuzione di analisi del movimento. </li><li> Per curare i risultati e confermare che tutte le tracce rilevate sono da vera C. elegans ed eliminare artefatti, aprire tutti i file .txt creati per ogni film e copiare le informazioni in un file di software di analisi dei dati. Aprire le &quot;* _labels.zip&quot; i file creati ed eseguire il conseguente &quot;* _labels.tif&quot; per controllare manualmente ed eliminare le tracce di vermi falsi. </li></ol></li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I metodi descritti qui aiutano a illustrare la diffusione e la cella di tossicità autonoma cella complesso autonomo e non di proteine ​​prioniche-like. Abbiamo recentemente scoperto che un dominio citosolico prioni aggregazione incline è ripreso in vescicole di membrana in un processo di autofagia correlato. Un sottoinsieme specifico di queste vescicole trasporta il dominio prione all&#39;interno e tra cellule e tessuti 40. La chiave per monitorare il loro movimento nel animale vivente è che la proteina deve ...

Molte malattie neurodegenerative, tra cui la malattia di Alzheimer (AD), malattia di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), e le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE), sono associati con le proteine ​​di aggregazione a rischio e sono, quindi, noti collettivamente come misfolding disturbi (PMD ). EST o malattie da prioni costituiscono una classe unica di PMD in che possono essere infettivi in entrambi gli esseri umani e gli animali 1. A livello molecolare, i prioni replicano reclutando e convertendo monomerico α-elica-ricchi PrP cellulari host-codificato (PrP C) nel patologico β-sheet-ricchi PrP Sc conformazione 2,3. Aggregati auto-propagazione della proteina sono stati individuati nei funghi, che condividono caratteristiche importanti con prioni mammiferi 4,5. Inoltre, prioni mammiferi sono in grado di muoversi da cellula-cellula e infettare le cellule naïve 6,7. Mentre PMD OTHer di TSE non sono infettive, condividono un principio patogenetico comune con malattie da prioni 8,9. Sebbene le proteine ​​legate a ciascuna delle PMD non sono collegati in struttura o funzione, che tutti gli aggregati di forma tramite un processo di cristallizzazione simile chiamati nucleate o seminate polimerizzazione; inoltre semi proteici crescere reclutando i loro isoforme solubili 2,10,11. L&#39;efficienza di auto-propagano varia in vivo, a seconda delle proprietà intrinseche della proteina, che insieme con fattori cellulari aggiuntive come chaperon molecolari fine determinano tassi di nucleazione aggregata, semina, frammentazione e diffusione 12-15. Quindi, deve esistere un equilibrio tra questi fattori, che permette la propagazione efficiente di aggregazione proteica. Questo potrebbe anche spiegare il motivo per cui solo alcuni aggregati amiloidogenici ospitano le caratteristiche di un prione, e, quindi, non tutti i PMD sono infettive. I prioni sembrano rappresentare o &#39;top-performer&#39;fa ampio spettro di aggregati proteici auto-replicanti, che li rende un potente strumento per studiare PMD 8,13. Curiosamente, la tossicità associata con aggregati correlati alla malattia ha spesso una componente autonoma non cellulare 16,17. Ciò significa che influenzano cellule vicine che non esprimono il gene corrispondente, in contrasto con un effetto strettamente cella autonoma, il che implica che solo le cellule che esprimono il gene mostra il fenotipo specifica. Ciò è stato dimostrato dal convincente espressione tessuto-specifica o abbattere delle rispettive proteine ​​in numerosi modelli di malattie neurodegenerative 18-26. Diversi meccanismi sono stati proposti come base per questo non-tossicità delle cellule autonome in PMD, compresa la fornitura di nutrienti diminuita, squilibrio nella segnalazione neuronale, glutammato, e neuroinfiammazione 16,27,28. Inoltre, un movimento prione-come aggregati malattie legate tra cellule might contribuiscono a questo aspetto 29,30. Una crescente evidenza suggerisce che le inclusioni proteiche diverse da prioni possono trasmettere dalla cella-a-cella, il che può spiegare la caratteristica diffusione della patologia osservata in molti PMD 30-36. Tuttavia, è ancora da stabilire se vi sia un chiaro nesso causale tra movimento intercellulare di proteine ​​di malattia e l&#39;effetto tossico sulle cellule vicine. Pertanto, una migliore comprensione delle vie cellulari che sono alla base della trasmissione cellula-cellula e cellula tossicità non autonoma è necessaria ed essenziale per lo sviluppo di nuove terapie. Tuttavia, molti aspetti della prionica simile diffusione e cellulari fattori che influenzano la trasmissione da cellula a cellula proteine ​​mal ripiegate in metazoi non sono ben compresi, in particolare a livello degli organismi. Il nematode Caenorhabditis elegans ha diversi vantaggi che forniscono il potenziale per scoprire nuove sfaccettature di prioni come spreading in metazoi 17. È trasparente, consentendo in vivo inseguimento proteine ​​di fluorescenza contrassegnati nell&#39;organismo vivente. Inoltre, molti processi cellulari e fisiologici colpite dalla malattia sono conservati dai vermi per la salute umana, e C. elegans è anche suscettibile di una grande varietà di manipolazioni genetiche e le analisi molecolari e biochimiche 37-39. Esattamente 959 cellule somatiche formano il ermafrodita adulto con un piano di corpo semplice che ha ancora diversi tipi di tessuti diversi, tra cui muscolari, neuroni e intestino. Per stabilire un nuovo modello di prione in C. elegans, abbiamo scelto di esprimere esogenamente il ben caratterizzato glutammina / asparagina (Q / N) ricchi di prioni NM dominio del citosolico proteina prionica Sup35 lievito, poiché non ci sono noti proteine ​​prioniche endogene in vermi 4,40. Prioni di lievito sono stati inestimabili nel chiarire i meccanismi di base della replicazione prionica 41-44. Inoltre, NM è l&#39;abetest citosolica proteina prionica simile che ha dimostrato di ricapitolare l&#39;intero ciclo di vita di un prione in colture cellulari di mammifero 45,46. Analogamente, quando espresso in C. elegans, il dominio prione Sup35 adottata notevolmente bene alle diverse esigenze di propagazione in cellule metazoi rispetto alle cellule di lievito, caratteristiche principali esposti di prioni biologia aggregazione 40. NM era associato con una profonda fenotipo tossica, compresa la rottura dell&#39;integrità mitocondriale e dell&#39;aspetto vari vescicole autofagia relative a livello cellulare, così come arresto embrionale e larvale, ritardo dello sviluppo, e un disturbo diffusa dell&#39;ambiente ripiegamento proteico a livello organismal. Sorprendentemente, il dominio prione presenta cella cella tossicità autonome autonomo e non, che colpisce i tessuti adiacenti, in cui non è stato espresso il transgene. Inoltre, il trasporto vescicolare del dominio prione all&#39;interno e tra celle è monitorata in tempo reale &lt;em&gt; in vivo 40. Qui si descrive come esaminare prioni come la diffusione in C. elegans. Spiegheremo come monitorare il trasporto intra e intercellulare di vescicole che contengono il dominio prione con time-lapse microscopia a fluorescenza. Noi sottolineare l&#39;uso di sensori pieghevoli tessuto-specifici e ubiquitariamente espresso ai giornalisti di stress per valutare gli effetti delle cellule cellule autonome autonome e non sul fitness cellulare. Infine, descriveremo la procedura di uno schermo recentemente eseguito genoma ampio RNA interference (RNAi) per identificare nuovi modificatori di tossicità prioni indotta. In combinazione, questi metodi possono aiutare a prendere in giro a parte percorsi genetici coinvolti nel movimento intercellulare delle proteine ​​e la loro non tossicità delle cellule autonome.

<table><tbody><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosfere standard di dimensioni 100 nm</td><td>ThermoScientific</td><td>3100A</td><td></td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Sigma</td><td>L-9756</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma</td><td>15502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Ahringer Libreria RNAi</td><td>Fonte BioScience LifeSciences&nbsp;</td><td></td><td>http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/prodotti-cloni/non-mammiferi/c-elegans/c-elegans-rnai-library/</td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata Sorvall Legend XTR, 120VAC</td><td>ThermoScientific</td><td>75004521</td><td>http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60</td></tr><tr><td>Replicatore a 96 pin&nbsp;</td><td>Scionomix&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td>http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/</td></tr> <tr><td>Agitatore di incubazione ad alta capacità HiGro&nbsp;</td><td>Digilab</td><td></td><td>http://www.digilabglobal.com/higro</td></tr><tr><td>Dispenser di reagenti combinati multidrop&nbsp;</td><td>Titertrek</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm</td></tr><tr><td>Biomek FX AP96 Stazione di lavoro automatizzata&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm</td></tr><tr><td>Innova44 agitatore</td><td>New Brunswick</td><td></td><td>http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& azione=prodotti& contentid=1& catalognode=83389</td></tr><tr><td>M205 FA&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/</td></tr> <tr><td>ORCA-R2 C10600-10BDittatrice CCD gitale</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td>http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html</td></tr><tr><td>Spinning Disc AF Confocal Microscope&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td>http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/</td></tr> <tr><td>Fotocamera Falcon 4M60&nbsp;</td><td>Teledyne Dalsa</td><td></td><td>http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/</td></tr> <tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph Microscopy Automation & Software di analisi delle immagini</td> Dispositivi <td></td><td>molecolari</td><td>http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html</td></tr><tr><td>Hamamatsu SimplePCI Software di analisi delle immagini</td><td>Meyer Instruments</td><td></td><td>http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html il plug-in wrMTrck per ImageJ</td><td></td><td></td><td>http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html</td></tr><tr><td>C. elegans ceppi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 (WT)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570</td></tr><tr><td>AM815&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]</td><td>Laboratorio</td><td></td> Morimoto <td>disponibile presso il nostro laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Vedere la tabella 1 per una fonte di deformazioni</td><td></td><td></td><td></td> del sensore di piegatura e del segnalatore di stress</tr></tbody></table>

indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi organismo modello<em&gt; c. elegans</em

Investigating the Spreading and Toxicity of Prion-like Proteins Using the Metazoan Model Organism C. elegans

I prioni sono particelle proteiche autopropaganti non convenzionali, prive di qualsiasi acido nucleico codificante. Questi semi proteici fungono da modelli per la conversione e la replicazione della loro isoforma cellulare benigna. L'accumulo di prove suggerisce che molti aggregati proteici possono agire come modelli autopropaganti e corrompere il ripiegamento delle proteine affini. Sebbene gli aggregati possano essere funzionali in determinate circostanze, questo processo spesso porta all'interruzione dell'omeostasi delle proteine cellulari (proteostasi), portando infine a malattie devastanti come il morbo di Alzheimer (AD), il morbo di Parkinson (PD), la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) o le encefalopatie spongiformi trasmissibili (TSE). Gli esatti meccanismi di propagazione dei prioni e di diffusione da cellula a cellula degli aggregati proteici sono ancora oggetto di intense indagini. Per approfondire queste conoscenze, recentemente è stato stabilito un nuovo modello di metazoo in Caenorhabditis elegans, per l'espressione del dominio prionico della proteina prionica di lievito citosolico Sup35. Questo modello di prioni offre diversi vantaggi, in quanto consente il monitoraggio diretto del dominio dei prioni marcati in fluorescenza negli animali viventi e facilita gli approcci genetici. Qui descritti sono i metodi per studiare il comportamento simile ai prioni degli aggregati proteici e per identificare i modificatori della tossicità indotta dai prioni utilizzando C. elegans.

Monitoraggio intercellulare diffusione di proteine ​​prioniche come in vivo time-lapse imaging Transgenici C. Linee elegans esprimono il dominio prione sono particolarmente adatti per l&#39;analisi di alcuni aspetti di proteine ​​prioniche come, ad esempio, la trasmissione di cellule-cellula e cellula non tossicità autonomo. La trasparenza degli animali consente il monitoraggio di fluorescente contrassegnati proteine ​​dall&#39;interno del...

La propagazione di aggregati proteici simile ai prioni è recentemente emersa come implicata in molte malattie neurodegenerative. L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere come utilizzare il nematode C. elegans come sistema modello per monitorare la diffusione delle proteine e per studiare fenomeni simili ai prioni.

Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello<em&gt; C. elegans</em

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for ...

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è quello di esaminare la diffusione e la complessa tossicità di proteine simili a PreOn utilizzando l'organismo modello Metazoan C elegance. Ciò si ottiene monitorando il trasporto intra e intracellulare di vescicole contenenti la proteina simile a PreOn, utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse. Successivamente, sensori di ripiegamento specifici per i tessuti e stress espresso in modo ubiquitario.I reporter vengono utilizzati per valutare gli effetti autonomi e non autonomi delle cellule sulla fitness cellulare. Quindi viene eseguito uno screening RNAi dell'intero genoma al fine di identificare nuovi modificatori della tossicità indotta da PreOn. Lo screening viene eseguito in coltura liquida utilizzando la battitura come lettura della tossicità.Infine, worm tracker, un plugin per l'immagine J viene utilizzato per quantificare il movimento dell'eleganza C in combinazione. Questi metodi consentono di individuare i percorsi genetici coinvolti nel movimento intercellulare delle proteine simili a PreOn e la loro tossicità autonoma non cellulare. Dopo aver preparato il controllo sincronizzato dell'eleganza del mare e le linee transgeniche del dominio PreOn e i tamponi 10% agros, secondo il protocollo di testo allegato, pipettare tre microlitri di 100 nanogrammi di perle di polistirene e tre microlitri di limassol da quattro millimolari nel tampone agros.Utilizzando un filo di platino, prelevare i vermi di trasferimento all'età desiderata da una piastra nella soluzione e utilizzare un vetrino coprioggetti per coprire per visualizzare i vermi a livello subcellulare. Posizionare un vetrino nel supporto del vetrino del microscopio di un microscopio confocale e utilizzare un obiettivo a olio 63 x o 100 x 1,4 NA. Quindi, apri METAMORPH e seleziona l'acquisizione multidimensionale.E nella scheda principale, seleziona le caselle per time lapse ed esegui diari. Nella scheda di salvataggio, selezionare o creare la cartella di directory per il salvataggio dei file e assegnare un nome al file Nella scheda della lunghezza d'onda, utilizzare Yoko quad red o un'illuminazione equivalente dell'imaging MRFP e regolare l'esposizione tra 100 e 300 millisecondi e il guadagno della fotocamera tra 100 e 300. Successivamente, nella scheda Time Lapse, imposta l'intervallo di tempo su un secondo, la durata su cinque minuti e il numero di punti temporali su 301.Nella scheda Giornali di registrazione. Per il journal selezionare A FC set, Z hold e A FC tornare a Z hold per il tipo selezionare speciale due volte e per il punto iniziale, selezionare l'inizio del punto temporale e la fine del punto temporale. Al termine della configurazione, premere acquisisci Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi come le applicazioni di tracciamento delle particelle per misurare le proprietà dinamiche del discus.Dopo aver sincronizzato il dominio prionico transgenico e durante il tipo di nematodi e copiato le piastre della libreria inger RNAI secondo il protocollo di testo, incubare le piastre RNAi duplicate a 37 gradi Celsius e 300 RPM per utilizzare i batteri HT one 15 E coli che ospitano il vettore vuoto L 4 4 4 0 come controllo. Coltivalo separatamente in una provetta di coltura e poi usa una pipetta multicanale per trasferire 65 microlitri di coltura in un quarto dei pozzetti di 2 96. Piastre a pozzetti con stazione di lavoro automatizzata contenente una testa multicanale erogata.10 microlitri di cinque, millimolari di IPTG diluito in ciascun pozzetto dei batteri RNAi e delle piastre di controllo. Richiuderli prima di incubarli per tre ore mentre i batteri sono in incubazione. Mescolare il controllo sincronizzato di tipo selvatico e transgenico L 1 larve e M nove pozzetto tampone e pipettare da cinque a 10 microlitri su un microscopio di vetro.Conta i vermi e calcola il numero di vermi per microlitro. Dopo le tre ore di incubazione batterica, rimuovere le piastre dall'incubatrice e lasciarle a temperatura ambiente per evitare che il calore stressi i vermi. Successivamente, integrare il tampone M nine con colesterolo IPTG e antibiotici secondo il protocollo di testo.E aggiungere il volume appropriato di soluzione di verme transgenico del dominio PreOn a una concentrazione finale di 15 vermi per miscela di microlitri per distribuire uniformemente. Quindi erogare 50 microlitri in ciascun pozzetto delle piastre RNAi e nei pozzetti di una delle piastre di controllo vettoriale vuote. Erogare la soluzione di verme di tipo selvatico nella seconda piastra di controllo.Quindi lasciare tutte le piastre non sigillate per consentire l'aerazione e impedire l'evaporazione della coltura liquida impilando quattro o cinque piastre insieme, avvolgendole con un tovagliolo di carta umido seguito da un foglio di alluminio. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius e 200 giri/min per quattro giorni. Per le piastre, utilizzare una telecamera Falcon four M 60 collegata a un computer con un monitor per lo screening visivo dell'aumento della battitura rispetto agli animali transgenici del dominio PreOn trattati con il controllo.Il vantaggio principale dell'utilizzo di una stazione di lavoro automatizzata per la manipolazione dei liquidi per erogare i vermi nelle piastre R RNAi è che riduce notevolmente la variabilità e il numero di vermi per pozzetto. Per eseguire un test di motilità su piastre solide e convalidare i cloni RNAi candidati, i batteri crescono i batteri RNAi durante la notte secondo il protocollo di testo. Quindi utilizzare un millimolare IPTG per indurre l'espressione dell'RNA DS per tre ore.Utilizzare 150 microlitri di ciascun clone batterico RNAi per seminare piastre NGM precedentemente preparate che si diffondono in uno strato sottile. Lasciare asciugare i batteri per due giorni a temperatura ambiente al buio sotto uno stereomicroscopio. Determinare la quantità di vermi sincronizzati e la sospensione come descritto in precedenza e aggiungere da 25 a 30 L di larve in ciascuna piastra sperimentale.Incubare i nematodi a 20 gradi Celsius per quattro giorni fino a quando i vermi non raggiungono. Secondo giorno dell'età adulta per quantificare la motilità dei vermi, accendi la fotocamera e il semplice software di imaging PCI. Fare clic sull'icona della fotocamera per abilitare la regolazione delle condizioni di imaging.Quindi, impostare la condizione di imaging come segue. Impostare il guadagno su zero, la modalità luce su un indice di alta velocità su uno e il binning su due. Quindi fare clic su live ed esposizione automatica e regolare le condizioni di illuminazione spostando gli specchi del microscopio e le manopole di luminosità e contrasto.Fare clic sull'ora, scansionare e digitare una cartella e un nome di file impostare il ritardo del campo a 20 millisecondi e l'arresto al tempo a 30 secondi. Premi live review per scegliere l'area della lastra da registrare. Quindi picchiettare la piastra tre o quattro volte sul palco.Confermare rapidamente la sua posizione nel campo visivo e premere start al termine della registrazione del filmato, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e scegliere Esporta sequenza di montaggio per esportare il filmato da un formato CXD a un file A VI. Per analizzare i video di motilità, aprire l'immagine J scegliere la scheda plugin, quindi scegliere worm tracker e selezionare Worm Tracker batch, e selezionare la directory contenente tutti i file da analizzare nella finestra di input principale di Worm Tracker batch caricare i valori di input come descritto qui. Una spiegazione per ciascuno dei parametri può essere trovata nelle istruzioni che accompagnano il plugin.Fare clic su OK e consentire l'esecuzione dell'analisi del movimento. Infine, per curare i risultati, confermare che tutte le tracce rilevate provengono dall'effettiva eleganza marina ed eliminare gli artefatti. Apri i file TXT creati per ogni filmato e copia le informazioni in un file del software di analisi dei dati.Apri i file zip delle etichette creati ed esegui il TIFF delle etichette risultanti per controllare ed eliminare manualmente le false tracce di worm. Yesper Peterson, un ex postdoc in laboratorio, ha avuto per la prima volta l'idea del worm tracker come sostituto della nostra valutazione manuale di CL Elegance motil, che è una lettura della tossicità. Il worm tracker ci consente di eseguire questi esperimenti in modo automatizzato senza pregiudizi da parte dell'utente, valutando al contempo più condizioni in un lasso di tempo più breve utilizzando l'imaging time-lapse.L'RFP marcato R due E due, che si accumula nelle vescicole tubulari, è stato visto trasportato all'interno e tra le cellule da coex che esprime un sensore di ripiegamento o un reporter di stress. Insieme alla cellula proteica simile a PreOn, è possibile valutare gli effetti autonomi e non cellulari. L'espressione di R due E due nelle cellule muscolari porta ad un'insorgenza precoce dell'aggregazione di Q 44 nell'intestino, rivelando che R due E due ha effetti autonomi non cellulari sulla co-espressione della proteostasi di R due E due Con la SOD tre PGFP Il reporter di stress ossidativo trascrizionale porta alla sovraregolazione del reporter in diversi tessuti, dimostrando che il dominio PreOn induce una risposta allo stress ossidativo non cellulare in modo autonomo seguendo lo screening dell'intero genoma.Questo filmato dimostra che l'imaging e la visualizzazione ad alta risoluzione sullo schermo del computer consentono lo screening simultaneo di un quarto di lastra. Una volta padroneggiati, i protocolli di screening possono essere eseguiti in 12 cicli di 25 lastre per sessione. Se vengono eseguite due sessioni a settimana, l'intera libreria RNAi può essere sottoposta a screening entro sei settimane. Il worm tracker è stato utilizzato per quantificare la motilità dell'eleganza del C, come si vede qui.Worm Tracker converte un video originale in un formato binario e ad ogni worm viene assegnata una traccia. I video elaborati possono essere visualizzati con tracce sovrapposte per eliminare manualmente eventuali artefatti. Il parametro delle lunghezze del corpo al secondo normalizza le potenziali differenze di dimensioni. Nematodi.Questo metodo ha identificato 35 soppressori della tossicità indotta da PreOn che hanno aumentato il fenotipo della motilità ad almeno il 133% e fino al 256% rispetto ai vermi trattati con controllo. Durante il leasing del worm tracker, è importante ricordarsi di verificare manualmente le tracce dei worm ottenuti. Il software fa un ottimo lavoro nell'identificare i vermi, ma a volte lo sfondo può ancora essere erroneamente identificato come un animale.Pertanto, ricordati di controllare i tuoi video dopo aver eseguito worm tracker su di essi. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie neurodegenerative, come ad esempio se una certa proteina di collegamento della malattia è in grado di diffondersi da cellula a cellula, se esiste un legame tra la trasmissione intercellulare e la complessa tossicità di queste proteine. Capretti.

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Saggio β-amiloide tossicità utilizzando un transgenici C. elegans Modello

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Imaging time-lapse per monitorare la diffusione transcellulare di proteine simili ai prioni nei nematodi transgenici

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