Indagare le proteine ​​prioniche-come diffusione e tossicità di utilizzare i metazoi Organismo modello

L'obiettivo generale dei seguenti esperimenti è quello di esaminare la diffusione e la complessa tossicità di proteine simili a PreOn utilizzando l'organismo modello Metazoan C elegance. Ciò si ottiene monitorando il trasporto intra e intracellulare di vescicole contenenti la proteina simile a PreOn, utilizzando la microscopia a fluorescenza time-lapse. Successivamente, sensori di ripiegamento specifici per i tessuti e stress espresso in modo ubiquitario.

I reporter vengono utilizzati per valutare gli effetti autonomi e non autonomi delle cellule sulla fitness cellulare. Quindi viene eseguito uno screening RNAi dell'intero genoma al fine di identificare nuovi modificatori della tossicità indotta da PreOn. Lo screening viene eseguito in coltura liquida utilizzando la battitura come lettura della tossicità.

Infine, worm tracker, un plugin per l'immagine J viene utilizzato per quantificare il movimento dell'eleganza C in combinazione. Questi metodi consentono di individuare i percorsi genetici coinvolti nel movimento intercellulare delle proteine simili a PreOn e la loro tossicità autonoma non cellulare. Dopo aver preparato il controllo sincronizzato dell'eleganza del mare e le linee transgeniche del dominio PreOn e i tamponi 10% agros, secondo il protocollo di testo allegato, pipettare tre microlitri di 100 nanogrammi di perle di polistirene e tre microlitri di limassol da quattro millimolari nel tampone agros.

Utilizzando un filo di platino, prelevare i vermi di trasferimento all'età desiderata da una piastra nella soluzione e utilizzare un vetrino coprioggetti per coprire per visualizzare i vermi a livello subcellulare. Posizionare un vetrino nel supporto del vetrino del microscopio di un microscopio confocale e utilizzare un obiettivo a olio 63 x o 100 x 1,4 NA. Quindi, apri METAMORPH e seleziona l'acquisizione multidimensionale.

E nella scheda principale, seleziona le caselle per time lapse ed esegui diari. Nella scheda di salvataggio, selezionare o creare la cartella di directory per il salvataggio dei file e assegnare un nome al file Nella scheda della lunghezza d'onda, utilizzare Yoko quad red o un'illuminazione equivalente dell'imaging MRFP e regolare l'esposizione tra 100 e 300 millisecondi e il guadagno della fotocamera tra 100 e 300. Successivamente, nella scheda Time Lapse, imposta l'intervallo di tempo su un secondo, la durata su cinque minuti e il numero di punti temporali su 301.

Nella scheda Giornali di registrazione. Per il journal selezionare A FC set, Z hold e A FC tornare a Z hold per il tipo selezionare speciale due volte e per il punto iniziale, selezionare l'inizio del punto temporale e la fine del punto temporale. Al termine della configurazione, premere acquisisci Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi come le applicazioni di tracciamento delle particelle per misurare le proprietà dinamiche del discus.

Dopo aver sincronizzato il dominio prionico transgenico e durante il tipo di nematodi e copiato le piastre della libreria inger RNAI secondo il protocollo di testo, incubare le piastre RNAi duplicate a 37 gradi Celsius e 300 RPM per utilizzare i batteri HT one 15 E coli che ospitano il vettore vuoto L 4 4 4 0 come controllo. Coltivalo separatamente in una provetta di coltura e poi usa una pipetta multicanale per trasferire 65 microlitri di coltura in un quarto dei pozzetti di 2 96. Piastre a pozzetti con stazione di lavoro automatizzata contenente una testa multicanale erogata.

10 microlitri di cinque, millimolari di IPTG diluito in ciascun pozzetto dei batteri RNAi e delle piastre di controllo. Richiuderli prima di incubarli per tre ore mentre i batteri sono in incubazione. Mescolare il controllo sincronizzato di tipo selvatico e transgenico L 1 larve e M nove pozzetto tampone e pipettare da cinque a 10 microlitri su un microscopio di vetro.

Conta i vermi e calcola il numero di vermi per microlitro. Dopo le tre ore di incubazione batterica, rimuovere le piastre dall'incubatrice e lasciarle a temperatura ambiente per evitare che il calore stressi i vermi. Successivamente, integrare il tampone M nine con colesterolo IPTG e antibiotici secondo il protocollo di testo.

E aggiungere il volume appropriato di soluzione di verme transgenico del dominio PreOn a una concentrazione finale di 15 vermi per miscela di microlitri per distribuire uniformemente. Quindi erogare 50 microlitri in ciascun pozzetto delle piastre RNAi e nei pozzetti di una delle piastre di controllo vettoriale vuote. Erogare la soluzione di verme di tipo selvatico nella seconda piastra di controllo.

Quindi lasciare tutte le piastre non sigillate per consentire l'aerazione e impedire l'evaporazione della coltura liquida impilando quattro o cinque piastre insieme, avvolgendole con un tovagliolo di carta umido seguito da un foglio di alluminio. Incubare le piastre a 20 gradi Celsius e 200 giri/min per quattro giorni. Per le piastre, utilizzare una telecamera Falcon four M 60 collegata a un computer con un monitor per lo screening visivo dell'aumento della battitura rispetto agli animali transgenici del dominio PreOn trattati con il controllo.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di una stazione di lavoro automatizzata per la manipolazione dei liquidi per erogare i vermi nelle piastre R RNAi è che riduce notevolmente la variabilità e il numero di vermi per pozzetto. Per eseguire un test di motilità su piastre solide e convalidare i cloni RNAi candidati, i batteri crescono i batteri RNAi durante la notte secondo il protocollo di testo. Quindi utilizzare un millimolare IPTG per indurre l'espressione dell'RNA DS per tre ore.

Utilizzare 150 microlitri di ciascun clone batterico RNAi per seminare piastre NGM precedentemente preparate che si diffondono in uno strato sottile. Lasciare asciugare i batteri per due giorni a temperatura ambiente al buio sotto uno stereomicroscopio. Determinare la quantità di vermi sincronizzati e la sospensione come descritto in precedenza e aggiungere da 25 a 30 L di larve in ciascuna piastra sperimentale.

Incubare i nematodi a 20 gradi Celsius per quattro giorni fino a quando i vermi non raggiungono. Secondo giorno dell'età adulta per quantificare la motilità dei vermi, accendi la fotocamera e il semplice software di imaging PCI. Fare clic sull'icona della fotocamera per abilitare la regolazione delle condizioni di imaging.

Quindi, impostare la condizione di imaging come segue. Impostare il guadagno su zero, la modalità luce su un indice di alta velocità su uno e il binning su due. Quindi fare clic su live ed esposizione automatica e regolare le condizioni di illuminazione spostando gli specchi del microscopio e le manopole di luminosità e contrasto.

Fare clic sull'ora, scansionare e digitare una cartella e un nome di file impostare il ritardo del campo a 20 millisecondi e l'arresto al tempo a 30 secondi. Premi live review per scegliere l'area della lastra da registrare. Quindi picchiettare la piastra tre o quattro volte sul palco.

Confermare rapidamente la sua posizione nel campo visivo e premere start al termine della registrazione del filmato, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e scegliere Esporta sequenza di montaggio per esportare il filmato da un formato CXD a un file A VI. Per analizzare i video di motilità, aprire l'immagine J scegliere la scheda plugin, quindi scegliere worm tracker e selezionare Worm Tracker batch, e selezionare la directory contenente tutti i file da analizzare nella finestra di input principale di Worm Tracker batch caricare i valori di input come descritto qui. Una spiegazione per ciascuno dei parametri può essere trovata nelle istruzioni che accompagnano il plugin.

Fare clic su OK e consentire l'esecuzione dell'analisi del movimento. Infine, per curare i risultati, confermare che tutte le tracce rilevate provengono dall'effettiva eleganza marina ed eliminare gli artefatti. Apri i file TXT creati per ogni filmato e copia le informazioni in un file del software di analisi dei dati.

Apri i file zip delle etichette creati ed esegui il TIFF delle etichette risultanti per controllare ed eliminare manualmente le false tracce di worm. Yesper Peterson, un ex postdoc in laboratorio, ha avuto per la prima volta l'idea del worm tracker come sostituto della nostra valutazione manuale di CL Elegance motil, che è una lettura della tossicità. Il worm tracker ci consente di eseguire questi esperimenti in modo automatizzato senza pregiudizi da parte dell'utente, valutando al contempo più condizioni in un lasso di tempo più breve utilizzando l'imaging time-lapse.

L'RFP marcato R due E due, che si accumula nelle vescicole tubulari, è stato visto trasportato all'interno e tra le cellule da coex che esprime un sensore di ripiegamento o un reporter di stress. Insieme alla cellula proteica simile a PreOn, è possibile valutare gli effetti autonomi e non cellulari. L'espressione di R due E due nelle cellule muscolari porta ad un'insorgenza precoce dell'aggregazione di Q 44 nell'intestino, rivelando che R due E due ha effetti autonomi non cellulari sulla co-espressione della proteostasi di R due E due Con la SOD tre PGFP Il reporter di stress ossidativo trascrizionale porta alla sovraregolazione del reporter in diversi tessuti, dimostrando che il dominio PreOn induce una risposta allo stress ossidativo non cellulare in modo autonomo seguendo lo screening dell'intero genoma.

Questo filmato dimostra che l'imaging e la visualizzazione ad alta risoluzione sullo schermo del computer consentono lo screening simultaneo di un quarto di lastra. Una volta padroneggiati, i protocolli di screening possono essere eseguiti in 12 cicli di 25 lastre per sessione. Se vengono eseguite due sessioni a settimana, l'intera libreria RNAi può essere sottoposta a screening entro sei settimane. Il worm tracker è stato utilizzato per quantificare la motilità dell'eleganza del C, come si vede qui.

Worm Tracker converte un video originale in un formato binario e ad ogni worm viene assegnata una traccia. I video elaborati possono essere visualizzati con tracce sovrapposte per eliminare manualmente eventuali artefatti. Il parametro delle lunghezze del corpo al secondo normalizza le potenziali differenze di dimensioni. Nematodi.

Questo metodo ha identificato 35 soppressori della tossicità indotta da PreOn che hanno aumentato il fenotipo della motilità ad almeno il 133% e fino al 256% rispetto ai vermi trattati con controllo. Durante il leasing del worm tracker, è importante ricordarsi di verificare manualmente le tracce dei worm ottenuti. Il software fa un ottimo lavoro nell'identificare i vermi, ma a volte lo sfondo può ancora essere erroneamente identificato come un animale.

Pertanto, ricordati di controllare i tuoi video dopo aver eseguito worm tracker su di essi. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle malattie neurodegenerative, come ad esempio se una certa proteina di collegamento della malattia è in grado di diffondersi da cellula a cellula, se esiste un legame tra la trasmissione intercellulare e la complessa tossicità di queste proteine. Capretti.