Name: Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Scopri la preparazione e caratterizzazione di nanoparticelle di chitosano-destrano solfato con SDF-1α per applicazioni in terapie con cellule staminali. Questo metodo valuta dimensioni, potenziale zeta e attività biologica.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH: HL671795, HL048743, e HL108630.

1. Preparazione di SDF-1α Glycan nanoparticelle Grazie allo scopo della fornitura in vivo, sterilizzare tutti i contenitori, pipette e puntali usati nella preparazione. <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni madre in UltraPure Acqua: 1% di solfato di destrano; 1 M NaOH (sterile filtrata con una membrana PES); 0,1% chitosano in 0,2% di acido acetico glaciale (filtro attraverso 0,8 e 0,22 micron filtri consecutivamente e regolare il pH a 5,5 con NaOH in seguito); 0.1 M ZnSO4; 15% mannitolo; e 0,92 mg / ml SDF-1α (memorizzati in aliquote a 80 ° C, e conservato a 4 ° C una volta scongelati). </li><li> Sterilizzare soluzioni madre attraverso 0,22 micron membrane filtranti. Valutare i livelli di endotossine nella soluzione preparata con dosaggio limulus lisato di amebociti (LAL) gel coagulo. Assicurarsi che i livelli sono &lt;0,06 EU / ml. </li><li> Aggiungere 0,18 ml UltraPure acqua per un flaconcino di vetro da 1,5 ml contenente un bastoncino magnetico. Impostare la velocità scalpore a 800 giri al minuto. Aggiungere 0,1 ml 1%solfato destrano e mescolare per 2 minuti. Aggiungere 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml di 0,92 mg / ml SDF-1α soluzione) e mescolare per 20 min. </li><li> Aggiungere 0,33 ml 0,1% chitosano, goccia a goccia e mescolare per 5 min. Cambio di velocità mescolare al massimo e aggiungere 0,1 ml 0,1 M ZnSO4 lentamente con una siringa da 0,1 ml (oltre 1 min). </li><li> Ritorna velocità mescolare a 800 giri al minuto e mescolare per 30 min. Aggiungere 0,4 ml 15% mannitolo e mescolare per 5 min. Trasferire la miscela di reazione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Centrifugare a 16.000 xga 4 ° C per 10 min. Nota: La presenza di mannitolo facilita la risospensione delle particelle dopo centrifugazione. A seconda della compattezza del pellet, la concentrazione mannitolo può essere variata da 0% al 5%. La completa risospensione delle particelle dopo ogni centrifugazione è fondamentale per evitare aggregati nella sospensione finale. </li><li> Aspirare il surnatante e utilizzare una pipetta per rimuovere l&#39;ultima goccia di liquido lentamente. Aggiungere 0,2 ml 5% mannitolo. Sospendere il pellet con 0,5 ml, 29 G neesiringa dle. Aggiungere 1 ml 5% mannitolo. Centrifugare a 16.000 xg per 15 min. </li><li> Ripetere il punto 1.6. </li><li> Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 0,2 ml 5% mannitolo. Conservare la sospensione di particelle a 4 ° C. Nota: La sospensione di particelle può anche essere congelati a -80 ° C o liofilizzato. Compresi 5% mannitolo nella sospensione è essenziale per prevenire l&#39;aggregazione delle particelle dopo il congelamento e scongelamento o dopo liofilizzazione e reidratazione. Mannitolo può essere rimosso mediante centrifugazione della sospensione dopo lo stoccaggio. </li></ol> 2. Determinazione della dimensione delle particelle e Zeta Potenziale La dimensione delle particelle e il potenziale zeta sono analizzati mediante dynamic light scattering e light scattering elettroforetico, rispettivamente, con un analizzatore di particelle indicato nella Lista dei Materiali. <ol><li> Impostare i seguenti parametri per la misurazione delle dimensioni delle particelle: i tempi di accumulazione: 70; Tempi di ripetizione: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluente: acqua; Regolazione Intensità: auto. </li><li> Diluire il campione di SDF-1α-DS-CS con acqua (diluizione 10 volte). Caricare 100 microlitri del campione ad una cuvetta UV monouso come una cuvetta Eppendorf. Inserire la cuvetta nel supporto cella. Attendere che la regolazione dell&#39;intensità di raggiungere &quot;Optimum&quot; (~ 10.000 cps). Avviare acquisizione dati. </li><li> Dopo la misurazione è completata, registrare i risultati cumulanti di diametro (nm) e l&#39;indice di polidispersità. Media dei risultati ottenuti da ciascuna delle 4 letture ripetute e calcolare la deviazione standard. </li><li> Carico 500 ml di 10 volte diluito campione di particelle ad una cella di flusso per la misura potenziale zeta. Impostare i seguenti parametri per la misurazione: i tempi di accumulazione: 10; Ripetere volte: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluente: acqua; Regolazione Intensità: auto. Registrare i risultati del potenziale zeta (mV). Media la risultato di ciascuna delle 5 letture ripetute, e calcolare la deviatio serien. </li></ol> 3. Quantificazione di SDF-1α nelle particelle <ol><li> Diluire forma libera SDF-1α a concentrazioni di 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, e 0,05 mg / ml in tampone 1.3x Laemmli. Diluire 6 microlitri campioni SDF-1α-DS-CS con 40 microlitri 1.3x tampone Laemmli. (Preparare 4x Laemmli scorta contenente 0,25 M Tris-HCl, pH 7.5, 8% SDS, 40% glicerolo, 0,05 mg / ml bromofenolo blu, e l&#39;8% 2-mercaptoetanolo. Dividere la soluzione di riserva in piccole aliquote e tenere a -20 ° C per uso singolo.) </li><li> Riscaldare i campioni a 100 ° C per 10 min. Vortex campioni due volte (ciascuno per 10 sec a velocità massima) durante il tempo di riscaldamento 10 min per dissociare completamente le particelle. Raffreddare i campioni a RT per 2 min. Centrifugare a 10.000 xg per 0,5-1 minuti per abbattere la condensa dell&#39;acqua. Nuovo Vortex per mescolare bene. Nota: A questo punto, la soluzione del campione deve essere chiaro senza alcun precipitato visibile presente. </li><li> Load 10 &amp;# 181; l campione / bene ad un gel SDS 4-20%. Eseguire elettroforesi a 200 V per 20 min. Colorare il gel con Coomassie macchia proteine ​​blu. </li><li> Esaminare la densità di banda della proteina di SDF-1α con un imager e analisi densitometria software molecolare. Calcolare la quantità di SDF-1α nelle particelle contro una curva standard costruita con connessione standard SDF-1α. </li></ol> 4. In Vitro saggio di rilascio <ol><li> Mescolare particelle glycan SDF-1α con tampone fosfato di Dulbecco senza calcio e magnesio (D-PBS) in un rapporto 1: 1 (v / v). </li><li> Dividere la sospensione di particelle in 0,05 ml aliquote in provette da 1,5 ml. Caricare i campioni al fondo delle provette. Evitare l&#39;introduzione di bolle d&#39;aria o disturbare la superficie del liquido. Sigillare la parte superiore dei tubi con Parafilm. NOTA: In tal modo, il liquido rimane sul fondo durante la successiva rotazione top-to-bottom del mixer tubo. </li><li> Ruotare i tubi a 37 &amp;# 176; C su un rotante Mixer Micro-Tube. Rimuovere aliquote dai tubi ai tempi indicati e centrifugare immediatamente i campioni a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C. </li><li> Separare i supernatanti e pellet, e ricostituire il pellet con 0,05 ml di D-PBS. Conservare i campioni a -20 ° C. Dopo che tutti i campioni sono raccolti, esaminare i supernatanti e pellet su un gel SDS come descritto sopra. </li></ol> 5. Migration Assay Questo test misura l&#39;attività chemiotattica di SDF-1α. Interazione di SDF-1α con il suo recettore (CXCR4) sulla superficie cellulare provoca la migrazione della cellula verso il gradiente SDF-1α. In questo test, le cellule vengono caricati in un pozzo superiore (separati da una membrana semipermeabile da una minore ben) Soluzione e SDF-1α in un minor bene. <ol><li> Diluire SDF-1α (libero o di particelle-bound form) con tampone di migrazione (media RPMI-1640 contenente 0,5% di albumina sierica bovina) in un 3-fodiluizione in serie ld a concentrazioni finali di 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, e 0,05 ng / ml. </li><li> Aggiungere 0,6 ml della soluzione di SDF-1α diluito o tampone di migrazione solo (controllo negativo) per un pozzo nella piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 0,57 ml di tampone di migrazione a un pozzo (controllo cella di input). Incubare a 37 ° C per 30 min. Inserire un permeabile inserto coltura cellulare come Transwell (dimensione dei pori 5 micron, Ø 6,5 mm) sulla parte superiore del pozzo inferiore. Carico 0,1 ml cellule Jurkat (5 × 10 5) nella Transwell inserire. Caricare 0,03 ml cellule direttamente al controllo cella di input bene. Incubare la piastra a 37 ° C per 2 ore in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Rimuovere gli inserti Transwell. Trasferire le cellule che sono emigrati ai pozzetti inferiori ad una provetta di polistirene 4 ml. Contare le cellule migrate con citometro di flusso. </li><li> Calcolare la migrazione come percentuale del numero di cella di input (numero di cellule nel controllo cella di input ben x 100/30) dopo la sottrazione dei numeri in negative controlli (cellule migrate nei pozzetti contenenti solo buffer di migrazione). </li></ol>

<ol><li>Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colloidal+polyelectrolyte+complexes+of+chitosan+and+dextran+sulfate+towards+versatile+nanocarriers+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Colloidal polyelectrolyte complexes of chitosan and dextran sulfate towards versatile nanocarriers of bioactive molecules.</a> Eur J Pharm Biopharm. 78 (1), 10-18 (2011).</li>
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<li>Ghadge, S. K., Muhlstedt, S., Ozcelik, C., Bader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+as+a+therapeutic+stem+cell+homing+factor+in+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha as a therapeutic stem cell homing factor in myocardial infarction.</a> Pharmacol Ther. 129 (1), 97-108 (2011).</li>
<li>Sharma, M., Afrin, F., Satija, N., Tripathi, R. P., Gangenahalli, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-derived+factor-1%2FCXCR4+signaling%3A+indispensable+role+in+homing+and+engraftment+of+hematopoietic+stem+cells+in+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Stromal-derived factor-1/CXCR4 signaling: indispensable role in homing and engraftment of hematopoietic stem cells in bone marrow.</a> Stem Cells Dev. 20 (6), 933-946 (2011).</li>
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<li>Amara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+cell-derived+factor-1alpha+associates+with+heparan+sulfates+through+the+first+beta-strand+of+the+chemokine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stromal cell-derived factor-1alpha associates with heparan sulfates through the first beta-strand of the chemokine.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23916-23925 (1999).</li>
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<li>Yin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDF-1alpha+in+glycan+nanoparticles+exhibits+full+activity+and+reduces+pulmonary+hypertension+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">SDF-1alpha in glycan nanoparticles exhibits full activity and reduces pulmonary hypertension in rats.</a> Biomacromolecules. 14 (11), 4009-4020 (2013).</li>
<li>Huang, M., Vitharana, S. N., Peek, L. J., Coop, T., Berkland, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+complexes+stabilize+and+controllably+release+vascular+endothelial+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte complexes stabilize and controllably release vascular endothelial growth factor.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1607-1614 (2007).</li>
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<li>Carrillo-Conde, B. R., Roychoudhury, R., Chavez-Santoscoy, A. V., Narasimhan, B., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+synthesis+of+carbohydrates+and+functionalization+of+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput synthesis of carbohydrates and functionalization of polyanhydride nanoparticles.</a> J Vis Exp. (65), 3967(2012).</li>
<li>Xu, J., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+gene+delivery+and+transfection+in+human+pancreatic+cancer+cells+using+epidermal+growth+factor+receptor-targeted+gelatin+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Therapeutic gene delivery and transfection in human pancreatic cancer cells using epidermal growth factor receptor-targeted gelatin nanoparticles.</a> J Vis Exp. (59), e3612(2012).</li>
<li>Lauten, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoglycan+complex+formulation+extends+VEGF+retention+time+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Nanoglycan complex formulation extends VEGF retention time in the lung.</a> Biomacromolecules. 11 (7), 1863-1872 (2010).</li>
<li>Schatz, C., Domard, A., Viton, C., Pichot, C., Delair, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+and+efficient+formation+of+colloids+of+biopolymer-based+polyelectrolyte+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Versatile and efficient formation of colloids of biopolymer-based polyelectrolyte complexes.</a> Biomacromolecules. 5 (5), 1882-1892 (2004).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Come accennato in precedenza, le nanoparticelle DS-CS sono formati attraverso la neutralizzazione di carica tra polianione (DS) e policatione (CS) molecole. Poiché l&#39;interazione di carica avviene facilmente durante la collisione molecolare, la concentrazione delle soluzioni polimeriche e la velocità di agitazione durante la miscelazione è critica per la dimensione delle particelle risultanti. Una tendenza generale è che più diluita DS e CS soluzioni 15 e superiori risultato velocità di agitazione in parti...

Solfato Dextran (DS) e chitosano (CS) sono polisaccaridi con più sostituiti gruppi solfato carica negativa (a DS), o gruppi di ammine cariche positivamente (deacetilata CS). Quando miscelato in una soluzione acquosa, i due polisaccaridi formano complessi polielettroliti attraverso interazioni elettrostatiche. I complessi risultanti possono formare grandi aggregati che verrà a fasi separate dalla soluzione acquosa (precipitati), o piccole particelle che sono disperdibili in acqua (colloidi). Le condizioni specifiche che contribuiscono a questi risultati sono stati ampiamente studiati e sono stati riassunti ed illustrato in dettaglio in una recente revisione 1. Tra queste condizioni, due requisiti fondamentali per la produzione di particelle idrodispersibili sono i polimeri di carica opposta devono 1), una massa molare significativamente diverse; e 2) essere miscelato in un rapporto non stechiometrica. Queste condizioni permetteranno ai complessati segmenti polimerici carica neutrale generate dalla caricaneutralizzazione di segregare e formare il nucleo della particella, e il polimero in eccesso per formare il guscio esterno 1. Le particelle glycan descritti in questo protocollo sono destinati per la consegna polmonare, e sono progettati per essere al netto carica negativa, e di dimensioni nanometriche. La carica superficiale negativa riduce la probabilità di assorbimento cellulare delle particelle 2,3. Particelle di dimensioni nanometriche facilitano il passaggio attraverso le vie aeree distali. Per raggiungere questo obiettivo, la quantità di DS usato in questa preparazione è in eccesso di CS (rapporto in peso 3: 1); ed alto peso molecolare DS (medio ponderale Mw 500.000) e basso peso molecolare CS (MW 50-190 kDa, 75-85% deacetilato) sono utilizzati. SDF-1α è un fattore di homing delle cellule staminali, che esercita la funzione di riferimento attraverso la sua attività chemiotattica. SDF-1α svolge un ruolo importante in homing e manutenzione di cellule staminali ematopoietiche del midollo osseo, e nel reclutamento di progecellule Nitor per tessuti periferici per la riparazione del pregiudizio 4,5. SDF-1α ha un sito-eparina vincolante nella sua sequenza della proteina, che permette la proteina di legarsi all&#39;eparina / eparansolfato, formare dimeri, essere protetti da proteasi inattivazione (CD26 / DPPIV), e di interagire con le cellule bersaglio tramite i recettori della superficie cellulare 6-8. DS ha simili proprietà strutturali come eparina / eparansolfato; pertanto, il legame di SDF-1α DS sarebbe simile a quella dei ligandi polimerici naturali. Nella seguente protocollo, si descrive la preparazione di nanoparticelle SDF-1α-DS-CS. Le procedure rappresentano una delle formulazioni precedentemente studiate 9. Il protocollo è originariamente adattato da un&#39;indagine di nanoparticelle VEGF-DS-CS 10. Una piccola scala preparazione è descritta, che può essere facilmente scalata con le stesse soluzioni stock e condizioni di preparazione. Dopo la preparazione, le particelle sono caratterizzati by esaminando le loro dimensioni, potenziale zeta, estensione di incorporazione SDF-1α, tempo di rilascio in vitro, e l&#39;attività del incorporata SDF-1α.

<table><tbody><tr><td>Destrano solfato</td><td>Fisher</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>Chitosano, basso peso molecolare</td><td>Sigma</td><td>448869</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di zinco eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>204986</td><td></td></tr><tr><td>D-mannitolo</td><td>Sigma</td><td>M9546</td><td></td></tr><tr><td>Acqua ultrapura&nbsp;</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>SDF-1&alfa;</td><td>Preparato secondo il riferimento 8.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa, membrana in PES 0,22&nbsp; &#956; m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Micro Barre di Agitazione Magnetiche (2&nbsp; x&nbsp; 7&nbsp; mm)</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>14-513-63</td><td></td></tr><tr><td>Kit fiale in vetro; SUN-SRi</td><td>Fisher</td><td>14-823-182</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di particelle Delsa Nano C&nbsp;</td><td>Backman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf UVette Cuvets</td><td>Eppendorf</td><td>952010069</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 20% Mini-PROTEAN TGX Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>GelCode Blue Safe Protein Stain Fisher</td><td></td><td>PI-24592</td><td></td></tr><tr><td>Imager molecolare VersaDoc MP 4000 Sistema</td><td>BioRad</td><td>170-8640</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell Permeable Supporta</td><td>Corning</td><td>3421</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso Accuri C6 BD</td><td>Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato&nbsp;</td><td>Kit Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Pyrogent plus</td><td>Fisher</td><td>NC9753738</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione e caratterizzazione di sdf-1α-chitosan-destrano solfato nanoparticelle

Preparation and Characterization of SDF-1&#945;-Chitosan-Dextran Sulfate Nanoparticles

Il chitosano (CS) e il destrano solfato (DS) sono polisaccaridi carichi (glicani), che formano nanoparticelle a base di complessi polielettrolitici quando vengono miscelati in condizioni appropriate. Le nanoparticelle di glicano sono utili trasportatori di fattori proteici, che facilitano la veicolazione in vivo delle proteine e ne sostengono la ritenzione nel tessuto bersaglio. I complessi polielettrolitici glicani sono ideali anche per la consegna delle proteine, poiché l'incorporazione avviene in soluzione acquosa, il che riduce la probabilità di inattivazione delle proteine. Le proteine con un sito di legame dell'eparina aderiscono prontamente al destrano solfato e sono, a loro volta, stabilizzate dal legame. Queste particelle sono anche meno infiammatorie e tossiche se somministrate in vivo. Nel protocollo descritto di seguito, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), un fattore di homing delle cellule staminali, viene prima miscelato e incubato con destrano solfato. Il chitosano viene aggiunto alla miscela per formare complessi polielettrolitici, seguito da solfato di zinco per stabilizzare i complessi con ponti di zinco. Le particelle SDF-1α-DS-CS risultanti vengono misurate per dimensioni (diametro) e carica superficiale (potenziale zeta). Viene determinata la quantità di SDF-1α incorporata, seguita da misurazioni del suo tasso di rilascio in vitro e della sua attività chemiotattica in forma legata a particelle.

La dimensione e il potenziale zeta delle particelle preparate SDF-1α-DS-CS sono determinate con un analizzatore di particelle. La Figura 1 mostra l&#39;analisi della misura di formato. Dai risultati ottenuti cumulanti quattro misurazioni ripetute, il diametro medio delle particelle idrodinamico SDF-1α-DS-CS è 661 ± 8.2 (nm) e la polidispersità è 0.23 ± 0.02. Il risultato della misurazione potenziale zeta è mostrato in Figura 2. Dalle cinque misurazioni ripetute, il potenziale zeta delle...

L'obiettivo di questo protocollo è incorporare SDF-1α, un fattore di homing delle cellule staminali, nelle nanoparticelle destrano solfato-chitosano. Le particelle risultanti vengono misurate per le loro dimensioni e il potenziale zeta, nonché per il contenuto, l'attività e il tasso di rilascio in vitro di SDF-1α dalle nanoparticelle.

Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è preparare e caratterizzare nanoparticelle di SD F1 Alpha Chias e solfato di destrano. La preparazione delle nanoparticelle avviene innanzitutto mescolando il fattore di reclutamento delle cellule staminali, il fattore derivato dalle cellule stromali uno alfa o S df uno alfa, con il solfato di destrano, consentendo il legame con il glicano carico negativamente. Come secondo passaggio, viene aggiunto al miscuglio l'ozan, un glicano carico positivamente, che forma un complesso polielettrolitico con il solfato di destrano.Successivamente, viene aggiunto solfato di zinco per stabilizzare i complessi mediante ponti di zinco. La particella risultante presenta un nucleo denso circondato da uno strato esterno negativamente carico. Le particelle vengono quindi analizzate per determinarne la dimensione e il potenziale zeta, nonché il contenuto e l'attività di S df one alpha nelle nanoparticelle. Il principale vantaggio delle nanoparticelle glicano di SDF one alpha è che l'SDF one alpha incorporato è completamente attivo senza dover essere rilasciato dalle particelle.Pertanto, le particelle potrebbero risultare utili come segnale stazionario di hermine nella terapia con cellule staminali. Per iniziare, preparare le soluzioni madri come descritto nel protocollo testuale e sterilizzarle mediante membrane filtranti da 0,22 micron. Valutare i livelli di endotossine nella soluzione preparata mediante saggio gel-clot con lisato di ameba ulu.Assicurarsi che i livelli siano inferiori a 0,06 unità di endotossina per millilitro. Successivamente, aggiungere 0,18 millilitri di acqua ultrapura in un vial di vetro da 1,5 millilitri contenente un agitatore magnetico. Impostare la velocità di agitazione a 800 giri al minuto, quindi aggiungere 0,1 millilitri di solfato di destrano al 1% e agitare per due minuti.Aggiungere 0,08 milligrammi di SD F1 alpha e mescolare per 20 minuti. Aggiungere goccia a goccia 0,33 millilitri di 0,1% tizen e mescolare per cinque minuti. Impostare la velocità di agitazione al massimo e aggiungere lentamente 0,1 millilitri di solfato di zinco mediante siringa a tenuta stagna.Riportare la velocità di agitazione a 800 giri al minuto e agitare per 30 minuti. Successivamente aggiungere 0,4 millilitri di mannitolo al 15% e agitare dopo cinque minuti. Trasferire la miscela di reazione in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 16.000 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e utilizzare una pipetta per rimuovere l'ultima goccia di liquido. Aggiungere lentamente 0,2 millilitri di mannitolo al 5% e sospendere il pellet utilizzando una siringa da 0,5 millilitri con ago da 29 gauge. Quindi aggiungere un ulteriore millilitro di mannitolo al 5% prima della centrifugazione.Una seconda volta a 16.000 GS per 15 minuti. Dopo aver ripetuto il processo di centrifugazione della sospensione di risospensione, aspirare il soprannatante e risospendere il pellet in 0,2 millilitri di mannitolo al 5%. La dimensione delle particelle e il potenziale zeta vengono analizzati rispettivamente mediante scattering dinamico della luce e scattering elettroforetico della luce.Per iniziare, selezionare un'operazione dalla lista delle procedure operative standard (SOP), che contiene i parametri per la misurazione della dimensione delle particelle mediante scattering dinamico della luce. Come indicato nel protocollo testuale, diluire il campione di particelle alfa SD F1 con acqua. Successivamente, caricare 100 microlitri del campione in una cuvetta UV monouso Q Vet, ad esempio una Einor Q Vet.Inserire il Q vet nel portacellula e attendere che la regolazione dell'intensità raggiunga il livello ottimale prima di iniziare l'acquisizione dei dati. Al termine della misurazione, registrare i risultati cumulativi di diametro e indice di polidispersità. Calcolare la media dei risultati ottenuti da ciascuna delle quattro letture ripetute e determinare la deviazione standard per la misurazione del potenziale zeta mediante diffusione della luce elettroforetica.Caricare 500 microlitri del campione di particelle diluito dieci volte nella cella a flusso. Selezionare una procedura operativa dall'elenco SOP relativo al potenziale zeta, che contiene i parametri per la misurazione come indicato nel protocollo testuale. Registrare i risultati del potenziale zeta.Quindi, calcolare la media dei risultati ottenuti da ciascuna delle cinque letture ripetute e determinare la deviazione standard. Riscaldare i campioni diluiti di SD F1 alfa libero e legato alle particelle nel buffer campione lalysato a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Eseguire due vorticosi durante il riscaldamento di 10 minuti per dissociare completamente le particelle; dopo aver raffreddato i campioni a temperatura ambiente per due minuti, centrifugare a 10.000 ×g per 0,5-1 minuto per far sedimentare il condensato, quindi vorticosare nuovamente per ottenere una miscelazione omogenea.A questo punto, la soluzione campione dovrebbe essere limpida e priva di precipitato visibile. Successivamente, caricare 10 microlitri di campione per pozzetto su un gel di elettroforesi SDS-PAGE al 4-20%. Eseguire l'elettroforesi a 200 volt per 20 minuti prima di colorare il gel con la colorazione proteica kumasi blue.Esaminare la densità della banda proteica di SD F1 alpha mediante un sistema di imaging molecolare e un software di analisi densitometrica. Calcolare la quantità di S DF one alpha nelle particelle confrontandola con una curva standard costruita utilizzando standard liberi di SDF one alpha per eseguire il saggio di rilascio in vitro. Mescolare le particelle di glicani di SD F1 alpha con soluzione salina fosfato docos priva di calcio e magnesio o DPBS in rapporto uno a uno. Dividere la sospensione di particelle in aliquote di 0,05 millilitri in provette da 1,5 millilitri.Caricare i campioni fino al fondo delle provette. Evitare di introdurre bolle d'aria o di disturbare la superficie del liquido. Sigillare la parte superiore delle provette con paraform.Quindi ruotare le provette a 37 gradi Celsius su un agitatore rotante per microprovette. Prelievarne aliquote dalle provette ai tempi stabiliti e centrifugare immediatamente i campioni a 16.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Separare i soprannatanti e i pellet.Quindi ricostituire il pellet con 0,05 millilitri di DPBS. Dopo aver raccolto tutti i campioni, analizzare i soprannatanti e i pellet su un gel SDS. Come in precedenza, questo saggio misura l'attività chemiotattica di S df.Un'interazione alfa di S df una alfa con il suo recettore induce la migrazione della cellula verso il gradiente di SD F1 alfa. Per iniziare, diluire la forma libera o legata a particelle di SD F1 alfa con il buffer per migrazione in una diluizione seriale triplice fino alle concentrazioni finali indicate nel protocollo del testo. Aggiungere 0,6 millilitri della soluzione di SD F1 alfa diluita in una pozzetta della piastra a 24 pozzette per il controllo negativo.Eseguire la stessa operazione anche per il buffer di migrazione, quindi aggiungere 0,57 millilitri di buffer di migrazione in una pozzetta per il controllo delle cellule in ingresso. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, posizionare un inserto per coltura cellulare permeabile, come un transwell, sopra la pozzetta inferiore e caricare 0,1 millilitri di cellule jerk hat nell'inserto del transwell.Quindi caricare direttamente 0,03 millilitri di cellule nel controllo della cella di ingresso. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due ore in un incubatore con 5% di anidride carbonica. Al termine dell'incubazione, rimuovere gli inserti per coltura cellulare.Trasferire le cellule che hanno migrato nei pozzetti inferiori in un tubo di polistirene da quattro millilitri. Contare le cellule migrate mediante citometria a flusso. Infine, calcolare la migrazione come percentuale del numero iniziale di cellule, sottraendo i valori dei controlli negativi.Qui viene mostrata l'analisi della misurazione della dimensione delle particelle di destrano solfato SD F1 alfa ozano. Il risultato CUMUL mostra un diametro idrodinamico delle particelle di 671 nanometri e una polidispersione pari a 0,24. Questa schermata mostra una delle cinque misurazioni ripetute del potenziale zeta delle particelle di destrano solfato SD F1 alfa ozano.Il potenziale zeta è di meno 24,7 millivolt. La quantità di S df uno alfa nelle particelle nano di S df uno alfa solfato di destrano ozan viene stimata mediante elettroforesi su gel SDS. Qui è mostrato un gel SDS colorato con kumasi, caricato con standard di S dF1 alfa, nanoparticella controllo solfato di destrano kaizan e campioni di nanoparticelle di solfato di destrano S dF1 alfa kaizan.Viene costruita una curva standard a partire dall'analisi della densità delle bande del campione standard SD F1 Alpha. Il calcolo della concentrazione a partire dalla curva standard indica che la concentrazione di S DF one alpha nel campione di nanoparticelle di SDF one alpha è di 0,03 milligrammi per millilitro. Per determinare il tasso di rilascio in vitro di S DF one alpha dalle nanoparticelle, la quantità di S DF one alpha rilasciata nel sopranatante e la quantità di SDF one alpha legata alle particelle nei pellet è stata determinata mediante colorazione con kumasi di un gel SDS seguita da analisi citometrica. L'attività di S DF one alpha legata alle particelle viene misurata mediante un saggio di migrazione e confrontata con quella di SDF one alpha libera, come mostrato qui.La migrazione indotta da SDF-1α legato alle particelle è risultata uguale a quella indotta da SDF-1α libero a tutte le concentrazioni misurate. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la formulazione delle particelle di glicoproteine può essere modificata. A seconda dell'applicazione specifica, è possibile incorporare altre proteine e utilizzare diverse formulazioni per variare la dimensione delle particelle.Speriamo che questo video abbia illustrato le tecniche di base per la preparazione della raccolta di nanoparticelle e successivamente per l'analisi funzionale della SDF-1α incorporata.

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