Preparazione e caratterizzazione di SDF-1α-Chitosan-Destrano solfato nanoparticelle

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di preparare e caratterizzare le nanoparticelle SD F1 Alpha Chias e destrano solfato. La preparazione delle nanoparticelle si ottiene mescolando prima il fattore di homing delle cellule staminali, il fattore delle cellule stromali uno alfa o S df uno alfa con destrano solfato per consentire il legame al glicano caricato negativamente. Come seconda fase, l'ozano viene aggiunto alla miscela un glicano caricato positivamente formando un complesso polielettrolitico con destrano solfato.

Successivamente viene aggiunto solfato di zinco per stabilizzare i complessi con ponti di zinco. La particella risultante ha un nucleo denso circondato da un guscio caricato negativamente. Le particelle vengono successivamente misurate per le loro dimensioni e il potenziale zeta, nonché il contenuto e l'attività di S df one alpha nelle nanoparticelle Il vantaggio principale delle nanoparticelle SDF one alpha glycan è che l'SDF one alpha incorporato è completamente attivo senza essere rilasciato dalle particelle.

Pertanto, le particelle potrebbero essere utili per fungere da segnale erminico stazionario nella terapia con cellule staminali. Per iniziare, preparare le soluzioni madre come descritto nel protocollo di testo e sterilizzarle attraverso membrane filtranti da 0,22 micron. Valutare i livelli di endotossine nella soluzione preparata con il saggio del coagulo in gel di lisato di lisato di acido ulu ameba.

Assicurarsi che i livelli siano inferiori a 0,06 unità di endotossina per millilitro. Successivamente, a 0,18 millilitri di acqua ultrapura, si passa a una fiala di vetro da 1,5 millilitri contenente un'ancoretta magnetica. Impostare la velocità di agitazione a 800 giri/min, quindi aggiungere 0,1 millilitri di destrano solfato all'1% e mescolare dopo due minuti.

Aggiungere 0,08 milligrammi di SD F1 alfa e mescolare per 20 minuti. Aggiungere goccia a goccia 0,33 millilitri di tizen allo 0,1% e mescolare per cinque minuti. Modificare la velocità di agitazione al massimo e aggiungere lentamente 0,1 millilitri di solfato di zinco con una siringa a tenuta di gas.

Riportare la velocità di agitazione a 800 giri/min e mescolare per 30 minuti. Quindi aggiungere 0,4 millilitri di mannitolo al 15% e mescolare dopo cinque minuti. Trasferire la miscela di reazione in una provetta da 1,5 millilitri e centrifugare a 16.000 g e quattro gradi Celsius per 10 minuti.

Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e utilizzare una pipetta per rimuovere l'ultima goccia di liquido. Aggiungere lentamente 0,2 millilitri di mannitolo al 5% e sospendere il pellet con una siringa ad ago calibro 29 da 0,5 millilitri. Quindi aggiungere un ulteriore millilitro di manitolo al 5% prima di centrifugare.

Una seconda volta alle 16.000 GS per 15 minuti. Dopo aver ripetuto il processo di centrifugazione in sospensione Resus, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 0,2 millilitri di mannitolo al 5%. La dimensione delle particelle e il potenziale zeta sono analizzati rispettivamente mediante diffusione dinamica della luce e diffusione della luce elettroforetica.

Per iniziare, selezionare una procedura operativa dall'elenco SOP, che contiene i parametri per la misurazione delle dimensioni delle particelle attraverso la diffusione dinamica della luce. Come elencato nel protocollo di testo, diluire il campione di particelle alfa SD F1 con acqua. Quindi caricare 100 microlitri di campione su un UV Q Vet usa e getta come un Einor Q Vet.

Inserire il Q vet nel portacellulare e attendere che la regolazione dell'intensità raggiunga l'ottimale prima di iniziare l'acquisizione dei dati. Al termine della misurazione, registrare i risultati cumulo del diametro e dell'indice di polidispersione. Fare la media dei risultati ottenuti da ciascuna delle quattro letture ripetute e calcolare la deviazione standard per la misurazione del potenziale zeta attraverso la diffusione della luce elettroforetica.

Caricare 500 microlitri del campione di particelle diluito dieci volte nella cella di flusso. Selezionare una procedura operativa dall'elenco SOP del potenziale Zeta, che contiene i parametri per la misurazione elencati nel protocollo di testo. Registra i risultati del potenziale zeta.

Quindi calcolare la media dei risultati ottenuti da ciascuna delle cinque letture ripetute e calcolare la deviazione standard. Riscaldare i campioni diluiti di SD F1 alfa libero e legato a particelle in tampone per campioni laly a 100 gradi Celsius per 10 minuti. Vorticare i campioni due volte durante il riscaldamento di 10 minuti per dissociare completamente le particelle dopo aver raffreddato i campioni a temperatura ambiente per due minuti, la centrifuga aveva 10, 000 Gs per 0,5 a un minuto per far scendere di nuovo il vortice di condensa d'acqua per mescolare bene.

A questo punto, la soluzione del campione dovrebbe essere limpida e non dovrebbe essere presente alcun precipitato visibile. Quindi caricare 10 microlitri di campione per pozzetto in un solfato ESAL di sodio dal 4 al 20% o in un gel SDS. Eseguire l'elettroforesi a 200 volt per 20 minuti prima di colorare il gel con la colorazione proteica blu kumasi.

Esamina la densità della banda proteica di SD F1 alfa utilizzando un imager molecolare e un software di analisi densitometrica. Calcolare la quantità di S DF one alpha nelle particelle rispetto a una curva standard costruita con standard SDF one alpha liberi per eseguire il saggio di rilascio in vitro miscelare particelle di alfa glicano SD F1 con soluzione salina tampone fosfato docos senza calcio e magnesio o DPBS in un rapporto uno a uno. Dividere la sospensione di particelle in aliquote da 0,05 millilitri in tubi da 1,5 millilitri.

Caricare i campioni sul fondo delle provette. Evitare di introdurre bolle d'aria o disturbare la superficie del liquido. Sigillare la parte superiore dei tubi con paraform.

Quindi ruotare i tubi a 37 gradi Celsius su un miscelatore rotante per microtubi. Togliere le aliquote dalle provette all'ora stabilita e centrifugare immediatamente i campioni a 16.000 Gs per 10 minuti a quattro gradi Celsius dopo la centrifugazione. Separare i surnatanti e i pellet.

Quindi ricostituire il pellet con 0,05 millilitri di DPBS. Dopo aver raccolto tutti i campioni, esaminare i surnatanti e i pellet su un gel SDS. Come in precedenza, questo test misura l'attività chemiotattica di S df.

Un'interazione alfa di S df un alfa con il suo recettore provoca la migrazione della cellula verso il gradiente alfa SD F1. Per iniziare, diluire la forma libera o legata alle particelle SD F1 alfa con tampone di migrazione in una diluizione seriale tripla fino alle concentrazioni finali elencate nel protocollo di testo. Aggiungere 0,6 millilitri della soluzione diluita di SD F1 alfa in un pozzetto nella piastra a 24 pozzetti per il controllo negativo.

Eseguire la stessa operazione solo per il buffer di migrazione, quindi aggiungere 0,57 millilitri di buffer di migrazione a un pozzetto per il controllo della cella di input. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, posizionare un inserto di coltura cellulare permeabile, come il transwell, sopra il pozzetto inferiore, caricare 0,1 millilitri di cellule jerk hat nell'inserto del transwell.

Quindi caricare 0,03 millilitri di celle direttamente sul controllo della cella di input. Incubare bene la piastra a 37 gradi Celsius per due ore in un incubatore di anidride carbonica al 5%. Dopo l'incubazione, rimuovere gli inserti di coltura cellulare.

Trasferire le cellule che sono migrate nei pozzetti inferiori in una provetta di polistirene da quattro millilitri. Contare le cellule migrate con un citometro a flusso. Infine, calcola la migrazione come percentuale del numero di cella di input dopo la sottrazione dei numeri nei controlli negativi.

Qui è mostrata l'analisi della misurazione delle dimensioni delle particelle SD F1 alfa destrano solfato ozan. Il risultato CUMUL mostra che il diametro idrodinamico della particella è di 671 nanometri e la polidispersità è di 0,24. Questa schermata mostra una delle cinque misurazioni ripetute del potenziale zeta delle particelle di solfato ozano SD F1 alfa DExT.

Il potenziale zeta è di meno 24,7 millivolt. La quantità di S df one alfa nelle particelle di S df one alfa destrano solfato ozan è stimata mediante elettroforesi su gel SDS. Qui è mostrato un gel SDS colorato con kumasi con standard SD F1 alfa destrano solfato kaizan nanoparticella di controllo e SD F1 alfa destrano solfato kaizan campioni di nanoparticelle caricati.

Una curva standard è costruita dall'analisi della densità della SD F1 Alpha Il calcolo delle bande standard dalla curva standard indica che la concentrazione di S DF one alpha nel campione di nanoparticelle SDF one alpha è di 0,03 milligrammi per millilitro. Per determinare il tasso di rilascio in vitro di S DF one alpha dalle nanoparticelle, la quantità di S DF one alpha rilasciata nel supernat e la quantità di sdf one alpha legata alle particelle nei pellet è stata determinata mediante colorazione kumasi di un gel SDS seguita da analisi citometrica. L'attività della particella legata S DF one alpha è misurata da un saggio di migrazione e, rispetto a quella, una SDF libera one alpha come mostrato qui.

La particella legata SDF un alfa ha indotto la stessa entità di migrazione di quella di un s DF libero un alfa a tutte le concentrazioni misurate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la formulazione delle particelle proteiche del glicano può essere alterata. A seconda dell'applicazione specifica, possono essere incorporate altre proteine e possono essere utilizzate diverse formulazioni per variare la dimensione delle particelle.

Speriamo che in questo video vengano dimostrate le tecniche di base in preparazione della raccolta delle nanoparticelle e quindi l'analisi funzionale dell'SDF one alpha incorporato.