Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare le variazioni della carica della membrana cellulare dopo l'adesione a diversi substrati materiali. Questo viene ottenuto coltivando i microrganismi in un mezzo ricco di nutrienti per aumentarne il numero. Successivamente, le superfici materiali a cui i microrganismi aderiranno vengono pulite e funzionalizzate per ottimizzare i tassi di adesione microbica.

Successivamente, i microrganismi vengono seminati su diversi substrati materiali per consentire l'analisi mediante microscopia a forza di sonda Kelvin o imaging KPFM. I risultati mostrano che il tipo di substrato materiale e la sua carica intrinseca influenzano l'attività cellulare, come evidenziato da variazioni nella carica della membrana cellulare e nell'adesione cellulare. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'elettroforesi, la diffusione della luce e la determinazione del punto isoelettrico, è che la KPFM permette l'esame della carica di singole cellule e biofilm anziché di intere colture o colonie.

Questo è vantaggioso quando si desidera confrontare le caratteristiche elettriche tra cellula e cellula e nei biofilm con elevata accuratezza e precisione. Per iniziare, preparare piastre di agar al 5% di sangue di pecora, seminare i batteri MRSA sulle piastre preparate e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius per ottenere singole colonie ben isolate. Preparare 500 millilitri di brodo triptico di soia, integrato con glucosio all'1% e cloruro di sodio allo 0,1%, e sterilizzare in autoclave, insieme a due provette di vetro pulite e a una scatola di pipette da un millilitro.

Dopo aver lasciato raffreddare il mezzo e i tubi di prova sotto una cappa a sicurezza biologica o vicino a un becco Bunsen, pipettare sei millilitri di TSB in ciascun tubo di prova. Utilizzando una delle piastre di agar al sangue di pecora precedentemente preparate, inoculare una singola colonia di MRSA in uno dei tubi. Utilizzare il secondo tubo come controllo negativo per garantire la sterilità e incubare i tubi in un incubatore reciproco per 24 ore a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto.

Il tubo di MRSA dovrebbe mostrare crescita oppure non dovrebbe essersi sviluppato nulla nel tubo di controllo. Successivamente, creare una sottocoltura utilizzando un millilitro della coltura di 24 ore per inoculare sei millilitri di brodo triptico di soia fresco e incubare a 37 gradi Celsius e 200 giri al minuto per altre sei ore. Quindi pipettare un millilitro della coltura in un tubo afus e centrifugare a 850 ×g per tre minuti.

Rimuovere il soprannatante e utilizzare acqua deionizzata per lavare il pellet due volte con pinzette nella mano dominante. Tenere un disco campione in acciaio inossidabile da 20 millimetri e utilizzare cinque millilitri di acqua deionizzata per pulire ciascun lato. Posizionare i dischi puliti in un becher contenente acqua deionizzata e sottoporli a sonificazione per un minuto dopo la sonificazione.

Utilizzare la pinzetta per rimuovere i dischetti campione dal becher e appoggiarli ad un angolo di circa 60 gradi contro il bordo di una piastra di Petri aperta su un tovagliolo di carta. Per farli asciugare completamente, utilizzare il coperchio della piastra per coprire i dischetti in fase di essiccazione. Una volta asciutti, trasferire il disco in una piastra di Petri per funzionalizzare la superficie del disco. Pipettare da 200 a 400 microlitri di poliolisina allo 0,1% sui dischetti all'interno di una cappa a sicurezza biologica e incubare a temperatura ambiente per un'ora, utilizzando la pinzetta per tenere i dischetti.

Usare acqua deionizzata per lavarli come dimostrato precedentemente in questo video. Successivamente, piastrare da 200 a 400 microlitri di cellule risospese, lavate due volte, sui dischetti campione rivestiti. Dopo un'incubazione a temperatura ambiente per 30 minuti, lavare delicatamente i dischetti con un millilitro di acqua deionizzata.

Lasciare asciugare i dischi durante la notte prima dell'acquisizione delle immagini per eseguire la microscopia a forza della sonda di Kelvin. Accendere il computer insieme al microscopio a forza atomica o AFM, al controller HEB e al controller MAC tre. Aprire un software di acquisizione immagini AFM come Ulence P ovu overview.

Selezionare A-C-A-F-M o la denominazione corretta per l'acquisizione in modalità a contatto intermittente. Utilizzando una pinzetta FM con la mano dominante e tenendo aperto il supporto a scatto con l'altra mano, inserire con attenzione la mensola A-K-P-F-M nella testa dello strumento. Caricare con cura la testa nell'A FM e collegare i cavi della luce laser e del motore di sollevamento del palchetto.

Quindi allineare il laser sulla punta del cantilever. Per allineare il laser sulla punta del cantilever, ruotare la manopola anteriore-posteriore in senso orario alcune volte per spostare il laser sopra il chip del cantilever.

Quando il laser raggiunge il chip, verrà bloccato e non sarà più visibile. Ruotare quindi la manopola frontale-posteriore in senso antiorario finché il punto laser non riappare. Il laser si trova ora sul bordo del chip.

Ruotare la manopola da sinistra a destra per posizionare il laser sul cantilever. Mentre il laser attraversa il cantilever, scomparirà e riapparirà in rapida successione. Il punto del laser dovrebbe essere visibile sul coperchio in vetro smerigliato in cui in seguito sarà posizionata l'unità del fotodiodo.

Ruotare la manopola frontale-posteriore in senso antiorario per spostare il punto lungo la mensola verso la punta finché il punto sul vetro smerigliato non scompare. Ora ruotare leggermente la manopola frontale-posteriore in senso orario per posizionare il laser in modo che si trovi esattamente sulla punta della mensola; il punto laser riapparirà sul vetro smerigliato. Una volta allineato il laser, mantenere il motore di sollevamento della piastra in posizione aperta per 10 secondi per assicurare uno spazio sufficiente tra la mensola e il campione.

Quando si collega il campione all'A FM, posizionare ora il campione sullo stadio KPFM. Utilizzare un filo di rame per collegare a massa il campione e connettere i fili appropriati dall'A FM allo stadio del campione. Successivamente, collegare lo stadio all'A FM tramite il software dell'A FM.

Assicurarsi che il tempo di impostazione non superi i 10 millisecondi e che le velocità di avvicinamento non superino i due micron al secondo. Per evitare danni alla punta, regolare la mensola e iniziare a spostare la punta della mensola verso il campione. Una volta che la punta della mensola raggiunge la superficie del campione, selezionare una dimensione della finestra di imaging e un'area di imaging ideale, ottimizzando i guadagni dell'occhio e di P insieme al punto di settaggio della mensola in modo da ottimizzare l'imaging topografico.

Una volta ottimizzata l'immagine topografica, attivare il modulo KPFM in modalità FM. Impostare la finestra di acquisizione su cinque micron per cinque micron con una risoluzione di 128 per 128 o velocità di scansione lente. Per le impostazioni KPFM in modalità FM, regolare l'eccitazione tra il 5 e il 10%. Impostare la frequenza di eccitazione tra uno e cinque kilohertz con una larghezza di banda di due kilohertz.

Impostare il guadagno delle NP di ferro per F-M-K-P-F-M al 0,3%. Dopo aver acquisito le immagini KPFM, utilizzare un software di elaborazione successiva all'acquisizione per analizzare le immagini e raccogliere i dati SP secondo le impostazioni descritte in questo video dimostrativo. Le immagini KPFM sono state ottenute da 15 cellule di MRSA su superfici in acciaio inossidabile e in oro. Qui di seguito sono mostrati i tipi di immagini raccolte.

Poiché la KPFM opera utilizzando due frequenze, sono state raccolte contemporaneamente immagini topografiche e dati elettrici della superficie cellulare. Sono stati applicati filtri termici alle mappe del potenziale superficiale al fine di individuare più facilmente piccole variazioni del potenziale superficiale. In questo grafico, le immagini sono state analizzate per determinare il potenziale elettrico della membrana microbica e successivamente utilizzate per effettuare confronti relativi alla crescita su diversi substrati.

Le scansioni del potenziale superficiale dei substrati di acciaio inossidabile nudo e oro nudo hanno mostrato potenziali superficiali complessivamente negativi. I dischi di acciaio inossidabile e oro rivestiti con lisina poliol mostravano entrambi uno spostamento verso potenziali superficiali positivi. I potenziali della membrana cellulare di MRSA variavano tra le superfici di acciaio inossidabile e oro.

Con l'acciaio inossidabile che presenta un potenziale di superficie della membrana notevolmente più positivo rispetto alle cellule di MRSA su substrato d'oro, che mostravano potenziali di superficie negativi. Per dimostrare le capacità complete della KPFM, qui si vede un esempio di grafico dell'altezza di un gradino di MRSA su acciaio inossidabile. Questo mostra la differenza di potenziale di superficie tra la superficie del substrato e la membrana microbica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia a forza con sonda di Kelvin per esaminare gli effetti della carica elettrica sull'adesione e l'attività delle cellule microbiche su diverse superfici di materiali.