Superficie di misurazione potenziale di batteri Utilizzando Kelvin Probe microscopia a forza

L'obiettivo generale del seguente esperimento è osservare i cambiamenti nella carica della membrana cellulare dopo l'adesione a diversi substrati di materiali. Ciò si ottiene coltivando i microrganismi in un terreno ricco di sostanze nutritive per aumentarne il numero. Successivamente, le superfici del materiale a cui aderiranno i microrganismi vengono pulite e funzionalizzate per ottenere tassi di adesione microbica ottimali.

Quindi i microrganismi vengono placcati sui vari substrati del materiale per consentire la microscopia a forza della sonda Kelvin o l'imaging KPFM. I risultati mostrano che il tipo di substrato del materiale e la sua carica intrinseca hanno un effetto sull'attività cellulare, come si vede dai cambiamenti nella carica della membrana cellulare e nell'aderenza cellulare. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'elettroforetica, la diffusione della luce e la determinazione del punto isoelettrico è che la KPFM consente l'esame della carica di singole cellule e biofilm invece di intere colture o colonie.

Ciò è vantaggioso quando si desidera confrontare le caratteristiche elettriche da cellula a cellula e dal biofilm con elevata accuratezza e precisione. Per iniziare, preparare piastre di agar di sangue di pecora al 5%, strisciare i batteri MRSA sulle piastre preparate e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius per generare singole colonie isolate. Prepara 500 millilitri di brodo di soia trittico, integrato con autoclave all'1% di glucosio e cloruro di sodio allo 0,1%, insieme a due provette di vetro pulite e una scatola di sorsi di pipetta da un millilitro.

Dopo aver lasciato raffreddare il terreno e le provette sotto una cabina di biosicurezza o vicino a panini e bruciatore, pipettare sei millilitri di TSB in ciascuna provetta. Utilizzando una delle piastre di agar per sangue di pecora precedentemente preparate, inoculare una singola colonia di MRSA in una delle provette. Utilizzare la seconda provetta come controllo negativo per garantire la sterilità, incubare le provette in un'incubatrice reciproca per 24 ore a 37 gradi Celsius e 200 giri/min.

La provetta per MRSA dovrebbe mostrare crescita o non dovrebbe essere cresciuto nulla nella provetta di controllo. Successivamente, crea una sottocoltura utilizzando un millilitro dalla coltura 24 ore per inoculare sei millilitri di brodo di soia triptico fresco e incubare a 37 gradi Celsius e 200 RPM per altre sei ore. Quindi pipettare un millilitro di coltura in provetta di afus e centrifugare a 850 volte G per tre minuti.

Rimuovere il supinato e utilizzare acqua deionizzata per lavare il pellet due volte con una pinza nella mano dominante. Tenere un disco campione FM in acciaio inossidabile da 20 millimetri e utilizzare cinque millilitri di acqua deionizzata per pulire ogni lato. Mettere i dischi puliti in un bicchiere di acqua deionizzata e sonicare per un minuto dopo la sonicazione.

Utilizzare le pinze per rimuovere i dischi campione dal becher e appoggiarli con un angolo di circa 60 gradi contro il bordo di una capsula di Petri aperta su un tovagliolo di carta Per asciugare completamente, utilizzare il coperchio della capsula per coprire i dischi di asciugatura. Una volta asciutto, trasferire il disco in una capsula di Petri per funzionalizzare la superficie del disco. Pipettare da 200 a 400 microlitri di poliolo lisina allo 0,1% sui dischi in una cabina di biosicurezza e incubare a temperatura ambiente per un'ora utilizzando una pinza per tenere i dischi.

Usa acqua deionizzata per lavarli, come dimostrato in precedenza in questo video. Piastra successiva, da 200 a 400 microlitri di celle risospese che sono state lavate due volte sui dischi campione rivestiti. Dopo aver incubato la temperatura ambiente per 30 minuti, utilizzare delicatamente un millilitro di acqua deionizzata per lavare i dischi.

Lasciare asciugare i dischi durante la notte prima dell'imaging per eseguire l'imaging al microscopio Kelvin Probe Force. Accendi il computer insieme al microscopio a forza atomica o ai controller AFM, HEB e MAC three. Apri un software di imaging A FM come Ulence P ovu viewview.

Selezionare A-C-A-F-M o la designazione corretta per l'imaging in modalità contatto intermittente. Utilizzando una pinza FM nella mano dominante e tenendo aperto il supporto della clip caricato a molla nell'altra mano, posizionare con cura il cantilever AKPF nel copricapo. Caricare con cautela la cuffia nell'A FM e collegare la luce laser e i cavi del motore di sollevamento del palco.

Quindi allineare il laser sulla punta del cantilever. Per allineare il laser sulla punta del cantilever. Ruotare la manopola dalla parte anteriore a quella posteriore in senso orario alcune volte per spostare il laser sopra il chip a sbalzo.

Quando il laser raggiunge il chip, questo si bloccherà e non sarà più visibile. Quindi ruotare la manopola dalla parte anteriore a quella posteriore in senso antiorario finché il punto laser non riappare. Il laser è ora sul bordo del chip.

Ruotare la manopola da sinistra a destra per posizionare il laser sul cantilever. Quando il laser passa sopra il cantilever, scomparirà e riapparirà in rapida successione. Il punto laser dovrebbe essere visibile nel coperchio in vetro smerigliato dove si posizionerà successivamente l'unità fotodiodo.

Ruotare la manopola dalla parte anteriore a quella posteriore in senso antiorario per spostare il punto lungo il cantilever verso la punta fino a quando il punto sul vetro smerigliato non scompare. Ora ruotare leggermente la manopola dalla parte anteriore a quella posteriore in senso orario per posizionare il laser in modo che si trovi proprio sulla punta del cantilever, il punto laser riapparirà sul vetro smerigliato. Una volta che il laser è allineato, tenere il motore di sollevamento del tavolino in posizione aperta per 10 secondi per garantire uno spazio sufficiente tra il cantilever e il campione.

Quando si collega il campione all'A FM, posizionare ora il campione sul tavolino KPFM. Utilizzare un filo di rame per mettere a terra il campione e collegare i fili appropriati dall'A FM allo stadio del campione. Quindi collegare il palco all'A FM nel software A FM.

Assicurarsi che il tempo di presa non sia superiore a 10 millisecondi e che le velocità di avvicinamento non superino i due micron al secondo. Per evitare danni alla punta, regolare il cantilever e iniziare a spostare la punta del cantilever verso il campione. Una volta che la punta a sbalzo raggiunge la superficie del campione, selezionare la dimensione della finestra di imaging e l'area di imaging ideale, ottimizzare i guadagni dell'occhio e del P insieme al set point a sbalzo in modo da ottimizzare l'imaging topografico.

Quando l'imaging topografico è ottimizzato, accendere il modulo KPFM in modalità FM. Imposta la finestra di imaging su cinque micron per cinque micron con una risoluzione di cinque 12 per cinque o una velocità di scansione bassa. Per le impostazioni FM KPFM, impostare l'unità tra il cinque e il 10% Impostare la frequenza dell'unità tra uno e cinque kilohertz con una larghezza di banda di due kilohertz.

Impostare i guadagni NP del ferro per F-M-K-P-F-M su 0,3%Dopo aver acquisito le immagini KPFM, utilizzare il software di post-elaborazione dell'imaging per analizzare le immagini e raccogliere i dati SP utilizzando le impostazioni descritte in questa dimostrazione video. Le immagini KPFM sono state scattate su 15 celle MRSA su superfici sia in acciaio inossidabile che in oro. Di seguito sono riportati i tipi di immagini raccolte.

Poiché KPFM funziona utilizzando doppie frequenze, sono state raccolte simultaneamente immagini topografiche e dati elettrici della superficie cellulare. I filtri termici sono stati applicati alle mappe del potenziale di superficie per discernere più facilmente piccoli cambiamenti nel potenziale di superficie. In questo grafico, le immagini sono state analizzate per determinare il potenziale della superficie della membrana microbica e quindi utilizzate per confrontare la crescita su diversi substrati.

Le scansioni del potenziale superficiale dei substrati nudi di acciaio inossidabile e oro nudo hanno mostrato potenziali superficiali complessivamente negativi. I dischi in acciaio inossidabile rivestito di poliolo lisina e oro hanno entrambi mostrato uno spostamento verso potenziali superficiali positivi. I potenziali di membrana cellulare MRSA variavano tra le superfici in acciaio inossidabile e oro.

Con l'acciaio inossidabile che mostra un potenziale di superficie di membrana positivo significativamente maggiore per le cellule rispetto alle celle MRSA sul substrato d'oro che mostrava potenziali di superficie negativi. Per dimostrare tutte le capacità di KPFM, qui si vede un esempio di un grafico dell'altezza del gradino di MRSA su acciaio inossidabile. Questo mostra la differenza di potenziale superficiale tra la superficie del substrato e la membrana microbica.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la microscopia a forza della sonda Kelvin per esaminare gli effetti della carica elettrica sull'adesione e l'attività delle cellule microbiche su diverse superfici del substrato del materiale.