Un punto di vista tecnico in Modern Tree-Ring Research - Come superare Dendroecological e legno anatomiche sfide

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di generare legno ben replicato e ad alta risoluzione. Un set di dati anatomici per studiare gli effetti del tempo e dei fattori ambientali sulla crescita di alberi e arbusti. Ciò si ottiene utilizzando un fluido non newtoniano per stabilizzare le cellule vegetali durante la sezione del microtomo, consentendo un'analisi microscopica dettagliata dei campioni come seconda fase.

Le micro sezioni vengono colorate due volte per facilitare la differenziazione delle cellule lignificate e non lignificate, quindi vengono scattate immagini digitali dei campioni. In definitiva, è possibile eseguire analisi automatizzate della crescita delle piante e le relative analisi delle serie temporali per consentire la valutazione dei parametri anatomici del legno di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è l'invio del punteggio del campione che con le nostre tecniche le celle non vengono riempite di segatura, con il risultato di campioni di qualità molto chiara per l'analisi delle immagini.

Inoltre, l'aggiunta di un fluido non Newton alle cellule durante il sezionamento consente di evitare la lunga tecnica di inclusione del campione in paraffina. I nuovi microtomi che vedremo nel video sono stati sviluppati nel nostro laboratorio di incorporazione del Lu Netti centrale degli Shang Dubs e di Zurigo. Si distinguono per un'elevata stabilità della guida, che consente il taglio di esemplari grandi e densi.

Per il campionamento di carotaggi di fusti di alberi. Inizia posizionando un nucleo di incremento affilato perpendicolarmente all'asse di crescita del fusto dell'albero. Quindi gira il nucleo e usa un estrattore per rimuovere il campione di carotaggio risultante dall'albero.

Etichettare il nucleo con un ID specifico contrassegnato a matita morbida sulla superficie del nucleo e ripetere la procedura sul lato opposto dello stelo quando tutti i campioni sono stati raccolti. Conservare le anime etichettate in un contenitore appropriato per proteggerle da danni durante il trasporto. Quindi, una volta tornati in laboratorio, montare i campioni di carotaggio in direzione della fibra, in posizione verticale su travi di supporto in legno con colla per legno resistente all'acqua, e lasciarli asciugare per il campionamento del microcarotaggio.

Per prima cosa, usa uno scalpello per rimuovere una parte della corteccia, se necessario. Quindi posizionare uno speciale dispositivo di punzonatura perpendicolare all'asse di crescita sullo stelo appena dimostrato e utilizzare un martello per penetrare lo xilema dello stelo a circa due centimetri di profondità. Ruotare il dispositivo di punzonatura per rompere il micro nucleo risultante all'interno dell'utensile.

Quindi rimuovere il torsolo dallo stelo e conservarlo in una provetta da microcentrifuga etichettata. Per tagliare una superficie piana su un campione di carota, iniziare fissando il nucleo incrementale di interesse nel supporto del nucleo di un microtomo di nucleo di nuova concezione per tagliare le superfici piane sui nuclei per tutta la loro estensione. Quindi sollevare il nucleo fino a toccare leggermente la lama, che è fissata su una guida con cuscinetti a sfera sull'estensione del nucleo, e tirare la lama per tagliare la prima parte della parte superiore del nucleo.

Quindi, spingi il coltello dietro il torsolo. Sollevare il portacampioni di circa 10 micron e ripetere la procedura di taglio fino a circa un terzo di quello del nucleo. Il diametro viene ridotto risultando in una superficie liscia continua.

Per un'analisi dettagliata delle immagini della struttura anatomica dei campioni, le microsezioni devono essere preparate con un altro tipo di microtomo. Innanzitutto, fissa il campione di nucleo di interesse nel supporto del microtomo del microtomo. Quindi posizionare la lama del microtomo guidata dalla guida del cuscinetto a sfere e tirare la lama sopra il nucleo.

Spingere indietro la lama per sollevare il campione da 20 a 30 micron. Quindi tirare la lama sul campione. Ancora una volta, ripetendo questo processo fino a creare una superficie continua sulla parte superiore del campione.

Ora, usando un pennello, copri la superficie risultante con una soluzione di amido di mais. Quindi sollevare il campione di 15 micron e posizionare il pennello sulla superficie del campione. Tirare lentamente le lame verso il campione iniziando un taglio sottile sotto la spazzola e usando la spazzola per guidare la sezione sulla superficie della lama quando l'intera sezione è stata tagliata.

Utilizzare un altro pennello e acqua per rimuovere il tessuto dalla lama e posizionarlo su un vetrino per consentire la distinzione tra le strutture lignificate e non lignificate. Lavare via il glicerolo con acqua usando una pipetta. Quindi, coprire la parte umida con alcune gocce di una miscela di zafferano e blu astro.

Dopo cinque minuti, lavare via i coloranti con acqua e poi disidratare immediatamente la sezione con successivi trattamenti con etanolo. Dopo il trattamento con etanolo disidratato, sciacquare ripetutamente la sezione al 100% xol. Non appena lo xol rimane chiaro.

Copri il fazzoletto con una goccia di balsamo 100% Canada e un bicchiere di copertura facendo attenzione ad evitare bolle d'aria. Quindi posiziona il micro scivolo risultante tra due strisce di plastica resistente al calore e posizionalo su una piastra metallica. Posiziona un peso sopra la diapositiva per mantenere la sezione piatta, quindi posiziona la diapositiva in un forno a 60 gradi Celsius.

Dopo 12 ore, lasciare raffreddare il vetrino a temperatura ambiente, quindi rimuovere il peso e la striscia di plastica. Infine, pulire il vetrino utilizzando lamette da barba per rimuovere eventuali residui di balsamo seguendo le procedure di sezionamento e colorazione presentate prima di poter preparare tutti i tipi di campioni di diverse dimensioni e forme, anche utilizzando appositi supporti per il corso per creare immagini digitali delle superfici del nucleo per l'analisi dei vasi. Per prima cosa, tagliare il piano della superficie del nucleo con il microtomo del nucleo come appena dimostrato e utilizzare un pennarello per colorare di nero la superficie risultante.

Non appena il colorante si asciuga, strofina la superficie del nucleo con gesso bianco e poi premi il gesso nelle celle con un dito. Rimuovere il gesso in eccesso, quindi posizionare il nucleo sul tavolino di un microscopio binoculare dotato di una fotocamera digitale a partire da un lato del nucleo. Ora acquisisci una sequenza di immagini leggermente sovrapposte fino a catturare l'intera superficie.

Quindi unisci le singole immagini per creare un'immagine completa della superficie del nucleo per creare immagini digitali dalle micro diapositive. Posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio e scegliere l'ingrandimento appropriato per le strutture da analizzare. Infine, acquisire immagini sovrapposte delle sezioni montate sui micro vetrini puliti, come appena dimostrato per il campione di superficie del nucleo, e unire le immagini per creare un'immagine completa della sezione.

La capacità di avere celle aperte è un primo passo importante verso l'adattamento delle strutture anatomiche dendroecologiche in un'analisi di serie storiche. Per un'analisi più dettagliata delle traches legnose precoci o tardive nelle conifere, sono necessarie microsezioni di alta qualità. Potenziali artefatti come la rottura delle pareti cellulari devono essere evitati.

L'applicazione di un fluido non newtoniano al campione, come la soluzione di amido di mais, come appena dimostrato, supporta la stabilità della struttura cellulare. Le micro sezioni consentono una determinazione più sicura delle classifiche annuali. Ciò è particolarmente vero per le conifere che crescono ai loro limiti naturali.

Come si vede qui, gli anelli estremamente stretti sono frequenti ma difficili da rilevare macroscopicamente. In casi estremi, gli anelli sono costituiti da una o due file di celle, che possono essere visibili solo quando si utilizzano micro sezioni. Quando si analizzano le immagini ad alti ingrandimenti, sono visibili singole cellule.

software di analisi semi-automatico consente di determinare le variazioni di singoli parametri, come lo spessore della parete cellulare, per tutti gli anelli visibili all'interno dell'immagine, indicando la necessità di un'analisi di serie temporali estese. La doppia colorazione delle micro sezioni permette la visualizzazione delle diverse fasi di lignificazione. Queste informazioni possono quindi essere correlate ai dati ambientali del rispettivo periodo di vegetazione per determinare una relazione più dettagliata tra clima e crescita dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ecologia DRO per esplorare i vari parametri anatomici di alberi e arbusti. L'utilizzo di questo metodo riduce drasticamente il tempo necessario per produrre sezioni grandi e di alta qualità. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come lavorare sotto una cappa aspirante e indossare guanti.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare set di dati anatomici ben replicati e altamente risolti per supportare l'analisi delle serie temporali.