Name: Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Scopri come creare gel di poliacrilammide per saggi di invadopodi e forza di trazione su cellule tumorali. Questo metodo consente di studiare l'attività invasiva e la contrattilità in risposta a diverse rigidità della matrice.

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1. Preparazione di vetrini di vetro per PAA <ol><li> Pulire 12 millimetri coprioggetto con panni bassi lint. </li><li> Flame i coprioggetti 12 mm e il coprioggetto 14 millimetri nel micropozzetto di ogni piatto di vetro fondo 35 millimetri facendoli passare attraverso una fiamma becco Bunsen con una pinzetta. </li><li> Trattare i pozzetti con 200 ml di 0,1 N NaOH per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min. </li><li> Trattare i pozzetti con 50-100 ml di 3-amminopropiltrimetossisilano per 10 minuti a temperatura ambiente nella cappa. Questo prodotto chimico reagisce con plastica; quindi, utilizzare pipette di vetro e non riempire completamente i pozzetti per evitare il contatto con la plastica piatto. </li><li> Lavare i pozzetti con acqua ultrapura per circa 10 minuti fino a quando il 3 amminopropiltrimetossisilano diventa chiaro. </li><li> Sciacquare i pozzetti con acqua ultrapura due volte con una bottiglia a spruzzo. </li><li> Lavare i pozzetti con 2 ml di acqua ultrapura unt temperatura ambiente su un bilanciere fissato a una velocità media (~ 1 Hz) per 10 min. </li><li> Aspirare e asciugare i pozzetti per 30 min. </li><li> Trattare i pozzetti con 2 ml di soluzione di glutaraldeide allo 0,5% a temperatura ambiente su un bilanciere fissato a una velocità media (~ 1 Hz) per 30 min. </li><li> Lavare i micropozzetti con 2 ml di acqua ultrapura a temperatura ambiente su un bilanciere funzionante a velocità media (~ 1 Hz) per 10 min. Ripetere altre due volte per un totale di 30 min. </li><li> Pozzetti a secco con un angolo ripido (60 ° o superiore) per 30 minuti. Nota: I piatti possono essere conservati per 2 mesi in un essiccatore. </li></ol> 2. Preparazione del PAA per Invadopodi saggi <ol><li> Per una soluzione del PAA molle (8% acrilammide e 0,05% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 25 ml di 2% BIS, e 574 ml di acqua ultrapura (Tabella 1). </li><li> Per una soluzione del PAA disco (8% acrilammide e 0,35% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 175 e #181; l del 2% BIS, e 409 ml di acqua ultrapura (Tabella 1). </li><li> Per una soluzione del PAA rigida (12% acrilammide e 0,60% BRI) 1 ml, 300 ml di combinare 40% acrilammide, 300 ml di 2% BIS, e 169 ml di acqua ultrapura (Tabella 1). </li><li> Degassare le soluzioni per 15 min. Aggiungere 200, 215, e 230 ml di 1 mg / ml di fibronectina plasma umano in acqua ultrapura alle molli, duri, rigidi e soluzioni di PAA, rispettivamente. Per tutte le soluzioni, aggiungere 1 ml di 10 mg / ml di acido acrilico N-idrossisuccinimmide (NHS) estere, 5 microlitri di 100 mg / ml, persolfato di ammonio e 2 ml di N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiletilendiammina (TEMED Tabella 1). Mescolare con dolce pipettaggio e evitare di creare bolle in soluzioni. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Ml) </td><td> 2% (Ml) </td><td> Ultrapure Acqua (Ml) </td><td> 1 mg / ml FN (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ml) </td><td> TEMED (Ml) </td><td> Elastico Modulo (Pa) </td></tr><tr><td> Morbido </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 574 </td><td> 200 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Duro </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 409 </td><td> 215 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rigido </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 169 </td><td> 230 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Ingrediente voluMES e conseguente moduli elastici per ZAP morbide, dure e rigide utilizzati nei test Invadopodi. AA = acrilamide, FN = fibronectina, APS = persolfato di ammonio. <ol start="5"><li> Pipettare 8,48 ml di soluzione di PAA al centro di ciascun pozzetto. Nota: Questo volume produce teoricamente PAA di 75 micron di spessore. </li><li> Abbassare delicatamente il lato fiammato del vetrino 12 mm appoggiata al droplet del micropozzetto con una pinzetta. </li><li> Lasciare che la soluzione PAA sandwich per polimerizzare per 15-30 min. Verificare polimerizzazione controllando la soluzione rimanente. </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS 1x per ogni piatto e rimuovere i 12 millimetri coprioggetto con una pinzetta. Nota: 10x PBS viene effettuata in laboratorio e composto da 0,011 M KH 2 PO 4, 1,54 M di NaCl, e 0,056 M Na 2 HPO 4. </li><li> Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li></ol> 3. Priparazione del PAA per forza trazione saggi <ol><li> Per una soluzione del PAA molle (8% acrilammide e 0,05% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 25 ml di 2% BIS, e 566 ml di acqua ultrapura (Tabella 2). </li><li> Per una soluzione del PAA disco (8% acrilammide e 0,35% BRI) 1 ml, 200 ml di combinare 40% acrilammide, 175 ml di 2% BIS, e 401 ml di acqua ultrapura (Tabella 2). </li><li> Per una soluzione del PAA rigida (12% acrilammide e 0,60% BRI) 1 ml, 300 ml di combinare 40% acrilammide, 300 ml di 2% BIS, e 161 ml di acqua ultrapura (Tabella 2). </li><li> Degassare le soluzioni per 15 min. Aggiungere 200, 215, e 230 ml di 1 mg / ml di fibronectina plasma umano ai morbidi, duri, rigidi e soluzioni di PAA, rispettivamente. Sonicare 8 ml di 200 nm microsfere rosse fluorescenti (eccitazione / emissione di 580/605 nm) per 30 sec. Per ogni soluzione, aggiungere 8 ml di 200 microsfere fluorescenti rossi nm,1 ml di 10 mg / ml di acido acrilico estere NHS, 5 microlitri di 100 mg / persolfato di ammonio ml e 2 microlitri di TEMED (Tabella 2). Mescolare con dolce pipettaggio e evitare di creare bolle in soluzioni. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td style="width:40px"> PAA (1 ml) </td><td> 40% AA (Ml) </td><td> 2% BIS (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> Ultrapure Acqua (Ml) </td><td> 1 mg / ml FN (Ml) </td><td> Microsfere (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 10 mg / ml NHS Ester (Ml) </td><td style="padding-left: 4px; padding-right: 4px;"> 100 mg / ml APS (Ml) </td><td> TEMED (Ml) </td><td> Elastico Modulo (Pa) </td></tr><tr><td> Morbido </td><td> 200 </td><td> 25 </td><td> 566 </td><td> 200 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 1023 </td></tr><tr><td> Duro </td><td> 200 </td><td> 175 </td><td> 401 </td><td> 215 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 7307 </td></tr><tr><td> Rigido </td><td> 300 </td><td> 300 </td><td> 161 </td><td> 230 </td><td> 8 </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 2 </td><td> 22692 </td></tr></tbody></table> Tabella 2:. Volumi ingrediente e conseguente moduli elastici per ZAP morbide, dure e rigide utilizzati nei test di forza di trazione AA = acrilamide, FN = fibronectina, APS = persolfato di ammonio. <ol start="5"><li> Pipettare 8,48 ml di soluzione di PAA al centro di ciascun pozzetto. Nota: Questo volume produce teoricamente PAA di 75 micron di spessore. </li><li> Abbassare delicatamente il lato fiammata di the 12 millimetri coprioggetto al droplet del micropozzetto con una pinzetta. </li><li> Lasciare che la soluzione PAA sandwich per polimerizzare per 15-30 min. Verificare polimerizzazione controllando soluzione rimanente. </li><li> Aggiungere 2 ml di PBS 1x per ogni piatto e rimuovere i 12 millimetri coprioggetto con una pinzetta. </li><li> Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li></ol> 4. Preparazione di ECM per Invadopodi saggi <ol><li> Riscaldare la soluzione di gelatina (1% gelatina e 1% di saccarosio) a 37 ° C. </li><li> Trattare le PAA con 150 microlitri della soluzione di gelatina per 1 min poi accuratamente aspirato dal fondo dei pozzetti quando si tiene i piatti fondo di vetro con un angolo di 45 °. </li><li> Essiccare il sottile strato residuo di gelatina sulle PAA ai pozzetti con un angolo ripido (60 ° o maggiore) per ottimizzare l&#39;essiccazione per 60 min. </li><li> Trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di glutaraldeide allo 0,5% in refrigerate iCe per 15 minuti seguita da temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li><li> Trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di boroidruro di sodio per 1 min. Battere delicatamente piatti sul banco per rimuovere le bolle che si formano sulla superficie della gelatina. </li><li> Aspirare e lavare i pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li><li> Diluire una soluzione fibronectina plasma umano marcato con FITC a 50 pg / ml con PBS 1x e centrifugare a 175.000 xg a 4 ° C per 15 min. O acquistare in commercio fibronectina etichettati o etichettarlo come segue: <ol><li> Disciogliere 5 mg di fibronectina in 10 ml di tampone borato (170 mM di sodio tetraidrato metaborato e 40 mM NaCl) e posto in tubi di dialisi. </li><li> Etichetta la fibronectina posizionando il tubo in 200 ml di tampone borato contenente 6 mg di FITC disciolto a temperatura ambiente su un agitatore magneticoimpostare al minimo per 1,5 ore al buio. </li><li> Dializzare con 500 ml di PBS 1x su un agitatore magnetico impostato al minimo per 3 giorni in una stanza buia fredda (4 ° C) con due volumi cambia un giorno. </li><li> Concentrazione fibronectina Calcolare FITC-marcato sulla base della densità ottica di aliquote diluito (1: 200) a 280 nm e 493 nm come [OD 280 - (0,36 x OD 493)] / 1,4 volte il fattore di diluizione di 200 volte 2 (che rappresenta per il glicerolo concentrare la fibronectina nel passaggio successivo) conseguente unità mg / ml. </li><li> Dializzare notte in una soluzione di glicerolo al 50% su un agitatore magnetico impostato al minimo durante la notte in una camera fredda buio a 4 ° C.) </li></ol></li><li> Trattare i pozzetti con 150 microlitri della soluzione di fibronectina FITC-marcato a temperatura ambiente per 60 minuti al buio. </li><li> Aspirare accuratamente la soluzione fibronectina coniugati con fluoresceina dal fondo dei pozzetti quando si tiene i piatti fondo di vetro aun angolo di 45 ° e quindi riempire il vetro piatti inferiori con soluzione di etanolo al 70% a temperatura ambiente per 10 min in una cappa di coltura cellulare scuro per la sterilizzazione. Anche riempire vetro fondo coperchi piatto o pulire con panni imbevuti lint bassi nel 70% di etanolo. </li><li> Lavare i piatti fondo di vetro da riempire con 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte con 2 ml di PBS 1x per un totale di 15 min. </li></ol> 5. Preparazione e Imaging di Invadopodi Assays <ol><li> Aggiungere 25.000 cellule tumorali in 2 ml di terreno Invadopodi (1: 1 DMEM e RPMI 1640 con 5% di siero a basso contenuto proteico, siero bovino fetale al 10%, e 20 ng / ml di fresco aggiunto del fattore di crescita epidermico) ai piatti fondo di vetro e incubare una notte. </li><li> Aspirare e trattare i pozzetti con 2 ml di una soluzione di paraformaldeide 3,7% a temperatura ambiente al buio per 20 minuti per fissare le cellule. </li><li> Dopo due lavaggi rapidi con 2 ml di 1x PBS, trattare i pozzetti con 2 ml di Triton X-100 soluzione 0,1% a camera temperatura al buio per 5 min a permeabilize cellule. </li><li> Dopo un lavaggio rapido con 2 ml di 1x PBS, trattare i pozzetti con 3% di albumina sierica bovina soluzione bloccante a temperatura ambiente al buio per 60 minuti per bloccare le cellule. </li><li> Incubare le micropozzetti con 150 ml di anticorpo anti-topo cortactin (1: 750) in soluzione a temperatura ambiente al buio blocco per 60 min. </li><li> Lavare pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li><li> Incubare i pozzetti con 150 ml di capra anti-topo 633 anticorpi (1: 500) e 546 falloidina (1: 750) in soluzione a temperatura ambiente al buio blocco per 60 min. </li><li> Lavare pozzetti con 2 ml di 1x PBS per 5 min. Ripetere altre due volte per un totale di 15 min. </li><li> Aggiungere sei gocce di mezzo di montaggio per riempire ogni micropozzetto e coprire con 22 x 22 lamelle. </li><li> Immagine cortactin e actina per identificare Invadopodi con eccitazione e di emissione filtri di 632/647 nm e556/570 nm, rispettivamente, con un obiettivo ad immersione in olio ad alta NA, 40X su un ampio campo di microscopio invertito. Analogamente, immagine fibronectina identificare degrado ECM utilizzando un filtro di eccitazione ed emissione di 492/518 nm. </li></ol> 6. Preparazione e Imaging di forza trazione Assays <ol><li> Aggiungere 15.000 cellule tumorali in 2 ml di terreno Invadopodi ai piatti fondo di vetro e incubare durante la notte. </li><li> Aspirare media nei piatti fondo di vetro e sostituire con 2 ml di mezzo L-15, con le stesse integratori (siero ipoproteica 5%, siero bovino fetale al 10%, e 20 ng / ml di fresco aggiunto del fattore di crescita epidermico), pre -warmed a 37 ° C. </li><li> Incubare i piatti inferiori vetro in una camera ambientale su un microscopio invertito pre-equilibrati a 37 ° C con umidità elevata per 1 ora. </li><li> Prendere quattro serie di immagini con un elevato NA, 40X obiettivo su un microscopio a grande campo invertito, con una fase automatizzata per marcare posizioni cellulari: <ol><li> Celle di immagine su dip dei PAA con contrasto di fase (immagine &quot;fase&quot;). </li><li> Microsfere fluorescenti immagine utilizzando filtri di eccitazione ed emissione di 560/645 nm concentrandosi leggermente sotto le celle fino al primo strato di microsfere nella parte superiore del PAA è a fuoco (immagine &quot;sottolineato&quot;). </li><li> In aggiunta, si concentrano al fondo del PAA (utilizzando le microsfere come marcatori) e prendere una immagine (un&#39;immagine &quot;bottom&quot;). Nota: Lo scopo di questa immagine è di registrare la z-posizione per ottenere lo spessore effettivo PAA in ciascuna posizione per i calcoli forza di trazione come descritto in Risultati rappresentativi. </li><li> Dopo queste immagini sono state acquisite a più posizioni, mescolare delicatamente in 220 ml di soluzione al 10% Triton-X per rimuovere le cellule. Microsfere fotografia in cima ZAP in ciascuna posizione come precedentemente descritto (immagine &quot;nullo&quot;). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Jaalouk, D. E., Lammerding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction gone awry.</a> Nature. 10, 63-73 (2009).</li>
<li>Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tension+mounts%3A+mechanics+meets+morphogenesis+and+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+mammary+gland+biology+and+neoplasia%22%5BJournal%5D)">The tension mounts: mechanics meets morphogenesis and malignancy.</a> Journal of mammary gland biology and neoplasia. 9, 325-342 (2004).</li>
<li>Parekh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+and+modulation+of+invadopodia+across+a+wide+range+of+rigidities%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensing and modulation of invadopodia across a wide range of rigidities.</a> Biophysical. 100, 573-582 (2011).</li>
<li>Jerrell, R. J., Parekh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+mediate+extracellular+matrix+degradation+by+invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses mediate extracellular matrix degradation by invadopodia.</a> Acta biomaterialia. 10, 1886-1896 (2014).</li>
<li>Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+traction+stresses+increase+with+increasing+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential.</a> PLoS ONE. 7, e32572(2012).</li>
<li>Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-14+is+a+mechanically+regulated+activator+of+secreted+MMPs+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2014).</li>
<li>Haage, A., Schneider, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+contractility+and+extracellular+matrix+stiffness+regulate+matrix+metalloproteinase+activity+in+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cellular contractility and extracellular matrix stiffness regulate matrix metalloproteinase activity in pancreatic cancer cells.</a> FASEB J. , (2014).</li>
<li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%3A+specialized+cell+structures+for+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Invadopodia: specialized cell structures for cancer invasion.</a> Clinical & experimental metastasis. 23, 97-105 (2006).</li>
<li>Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invadopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Invadopodia.</a> Curr Biol. 18, R362-364 (2008).</li>
<li>Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+cell+invasion+and+migration+during+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Directed cell invasion and migration during metastasis.</a> Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).</li>
<li>Alexander, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+promotes+invadopodia+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity promotes invadopodia activity.</a> Curr Biol. 18, 1295-1299 (2008).</li>
<li>Barlow, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+breast+cancer+risk+prediction+model+for+women+undergoing+screening+mammography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Prospective breast cancer risk prediction model for women undergoing screening mammography.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1204-1214 (2006).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projecting+absolute+invasive+breast+cancer+risk+in+white+women+with+a+model+that+includes+mammographic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Projecting absolute invasive breast cancer risk in white women with a model that includes mammographic density.</a> Journal of the National Cancer Institute. 98, 1215-1226 (2006).</li>
<li>Butcher, D. T., Alliston, T., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tense+situation%3A+forcing+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tense situation: forcing tumour progression.</a> Nature reviews. Cancer. 9, 108-122 (2009).</li>
<li>Zaman, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+tumor+cells+in+3D+matrices+is+governed+by+matrix+stiffness+along+with+cell-matrix+adhesion+and+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 10889-10894 (2006).</li>
<li>Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+density-induced+mechanoregulation+of+breast+cell+phenotype%2C+signaling+and+gene+expression+through+a+FAK-ERK+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage.</a> Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophysical journal. 80, 1744-1757 (2001).</li>
<li>Rosel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+Rho%2FROCK+signaling+in+sarcoma+cells+drives+invasion+and+increased+generation+of+protrusive+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of Rho/ROCK signaling in sarcoma cells drives invasion and increased generation of protrusive forces.</a> Mol Cancer Res. 6, 1410-1420 (2008).</li>
<li>Indra, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+correlation+of+mechanical+forces+and+metastatic+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro correlation of mechanical forces and metastatic capacity.</a> Phys Biol. 8, 015015(2011).</li>
<li>Parekh, A., Weaver, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cancer+invasiveness+by+the+physical+extracellular+matrix+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+adhesion+%26+migration%22%5BJournal%5D)">Regulation of cancer invasiveness by the physical extracellular matrix environment.</a> Cell adhesion & migration. 3, 288-292 (2009).</li>
<li>Weaver, A. M., Page, J. M., Guelcher, S. A., Parekh, A. Methods in Molecular Biology in Adhesion Protein Protocols. Coutts, A. S. 1046, 3rd Edition, 171-189 (2013).</li>
<li>Samani, A., Zubovits, J., Plewes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+moduli+of+normal+and+pathological+human+breast+tissues%3A+an+inversion-technique-based+investigation+of+169+samples%29%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+medicine+and+biology%22%5BJournal%5D)">Elastic moduli of normal and pathological human breast tissues: an inversion-technique-based investigation of 169 samples).</a> Physics in medicine and biology. 52, 1565-1576 (2007).</li>
<li>Wang, J. H., Lin, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+traction+force+and+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biomechanics+and+modeling+in+mechanobiology%22%5BJournal%5D)">Cell traction force and measurement methods.</a> Biomechanics and modeling in mechanobiology. 6, 361-371 (2007).</li>
<li>Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+traction+stresses+exerted+by+locomoting+cells+with+the+elastic+substratum+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method.</a> Biophysical journal. 70, 2008-2022 (1996).</li>
<li>Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stresses+at+the+cell-to-substrate+interface+during+locomotion+of+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts.</a> Biophysical journal. 76, 2307-2316 (1999).</li>
<li>Engler, A. J., Rehfeldt, F., Sen, S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtissue+elasticity%3A+measurements+by+atomic+force+microscopy+and+its+influence+on+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtissue elasticity: measurements by atomic force microscopy and its influence on cell differentiation.</a> Methods Cell Biol. 83, 521-545 (2007).</li>
<li>Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyacrylamide+hydrogels+for+cell+mechanics%3A+steps+toward+optimization+and+alternative+uses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses.</a> Methods in cell biology. 83, 29-46 (2007).</li>
<li>Leach, J. B., Brown, X. Q., Jacot, J. G., Dimilla, P. A., Wong, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+and+branching+of+PC12+cells+on+very+soft+substrates+sharply+decreases+below+a+threshold+of+substrate+rigidity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Eng%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth and branching of PC12 cells on very soft substrates sharply decreases below a threshold of substrate rigidity.</a> J Neural Eng. 4, 26-34 (2007).</li>
<li>Zhou, J., Kim, H. Y., Wang, J. H., Davidson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+stiffening+of+embryonic+tissues+via+microtubules%2C+RhoGEF+and+the+assembly+of+contractile+bundles+of+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Macroscopic stiffening of embryonic tissues via microtubules, RhoGEF and the assembly of contractile bundles of actomyosin.</a> Development. 137, 2785-2794 (2010).</li>
<li>Buxboim, A., Rajagopal, K., Brown, A. E., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+deeply+cells+feel%3A+methods+for+thin+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Condens+Matter%22%5BJournal%5D)">How deeply cells feel: methods for thin gels.</a> J Phys Condens Matter. 22, 194116(2010).</li>
</ol>

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health in premio Numero K25CA143412 (Parekh). Vorremmo riconoscere che un ulteriore sostegno è stato fornito dal Dipartimento di Otorinolaringoiatria. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

Vi presentiamo un metodo per la fabbricazione di PAA che possono essere utilizzati come base per Invadopodi e forza di trazione saggi di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili. Mentre CPA sono stati a lungo utilizzati per osservare gli effetti sulle cellule rigidità e calcolare le forze di trazione 18,24,27, questo protocollo è il primo a sviluppare test paralleli basati su CPA con le stesse rigidità di correlare i comportamenti cellulari invasive e contrattili in risposta alla matrice pro...

La rigidità del ECM associati al tumore è stato identificato come un fattore significativo nel determinare comportamenti maligni aumentando actomiosina contrattilità 1-3. Anche se questo effetto è stato dimostrato soprattutto con le cellule del cancro al seno, la rigidità matrice è stato trovato per modificare le proprietà invasive di cellule derivate da una varietà di tumori 4-8 che suggeriscono che la rigidità del tumore può svolgere un ruolo in altri tipi di tumori. Per penetrare i tessuti reticolati durante la migrazione invasivo, le cellule tumorali utilizzano sporgenze adesive ricche di actina conosciuti come Invadopodi che localizzare proteasi a degradare focally ECM 9. Invadopodi sono considerati un segno distintivo di cellule invasive e sono stati implicati in invasione delle cellule tumorali e metastasi 10,11. Il lavoro precedente ha mostrato che la rigidità matrice può regolare numeri Invadopodi e associati ECM degrado 4,12 attraverso l&#39;attività miosina II e proteine ​​meccanosensibili 12. Dato checorrelazione tra la densità del tumore e cancro aggressività 13,14, questi risultati suggeriscono un meccanismo attraverso il quale le cellule tumorali possono rispondere ai tessuti tumorali rigidi guidare invasione e metastasi attraverso actomiosina contrattilità. In vitro rigidità ECM e nella densità del tessuto vivo hanno dimostrato di regolare il comportamento invasivo delle cellule tumorali 1,15-17. Mentre actomiosina contrattilità sembra essere importante in questo processo, gli studi in corso il conflitto come se la capacità metastatica è correlata ad un aumento o diminuzione forze contrattili 6,18-20. Inoltre, resta noto se queste forze mediare direttamente l&#39;attività Invadopodi 21. Abbiamo recentemente scoperto che le forze contrattili cellula tumorale dipendevano rigidità matrice ed erano predittivi di ECM degrado da Invadopodi 5. Questi risultati suggeriscono che le forze cellulari possono svolgere un ruolo importante nella progressione del cancro mediando Invadopodi actività in risposta alle proprietà meccaniche del microambiente tumorale. Al fine di correlare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali 5, abbiamo modificato un protocollo per la creazione di ZAP con differenti rigidità precedentemente utilizzati per studiare l&#39;attività Invadopodi rigidità-dipendente 4,12,22. Con reticolazione chimica fibronectina plasma umano durante ZAP, questi idrogel modificati possono essere utilizzate come base per entrambi Invadopodi e forza di trazione saggi per assicurare che le cellule sperimentato le stesse rigidità in entrambi gli esperimenti 5. Nei saggi Invadopodi, la fibronectina fornisce un dominio di legame naturale per la gelatina di collegare la ECM sovrapposto alla ZAP per rilevare degradazione della matrice. Nei saggi di forza di trazione, la fibronectina fornisce un ligando per adesione cellulare diretta per rilevare spostamenti microsfere utilizzate per calcolare le forze di trazione cellulari. Questo metodo comporta quello che abbiamo chiamato morbido, duro,e CPA rigidi che sono legati ai piatti fondo di vetro e hanno moduli elastici, E, di 1.023, 7.307, e 22.692 Pa 5 che abbracciano la gamma di proprietà meccaniche segnalate per i tessuti normali e tumorali 23.

<table><tbody><tr><td>3-Aminopropiltrimetossisilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>Acrilammide (40%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>Acido acrilico Estere NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8060</td><td>preparare fresco in cappa aspirante 10 mg/ml in DMSO</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 falloidina</td><td>Life Technologies</td><td>A22283</td><td>può anche utilizzare rodamina</td></tr><tr><td>ammonio persolfato</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>preparare una soluzione fresca al 10% in 1x PBS</td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount</td><td>Polysciences</td><td>18606</td><td>utilizzare 6 gocce per riempire i micropozzetti</td></tr><tr><td>BIS (2%)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>RPI</td><td>A30075</td><td>fare il 3% per la soluzione bloccante in 1x PBS e conservare in 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti (12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>tubo per dialisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9777</td><td>pre-equilibrato in tampone borato per 15 - 30 min</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td>uso per fare invadopodia medio</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>uso per fare acido acrilico NHS soluzione estere</td></tr><tr><td>Fattore di crescita</td><td>epidermico Vita Tecnologie</td><td>PHG0311</td><td>utilizzare per rendere il mezzo di invadopodia</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>PHARMCO-AAPER</td><td>E200</td><td>diluito con acqua ultrapura al 70%</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td>utilizzare per rendere il mezzo di invadopodia</td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7250</td><td>proteggere dalla luce</td></tr><tr><td>Gelatina</td><td>Polysciences</td><td>00639</td><td>in genere preparare 10 ml di soluzione di saccarosio all'1% e gelatina all'1% in PBS e conservare a 4 gradi C (preriscaldare il PBS per sciogliere facilmente la gelatina)</td></tr><tr><td>Piatti con fondo in vetro (vetrini da 35 mm)</td><td>I vetrini coprioggetti</td> <td>MatTek</td><td>P35G-0-14-C</td> sono</tr><tr><td>glutaraldeide non rivestita (25%)</td><td>Polysciences</td><td>01909</td><td>diluire con 1x PBS allo 0,5%Anticorpo</td></tr> <tr><td>anti-topo di capra Alexa Fluor 633 Life</td><td>Technologies</td><td>A21050</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina plasmatica umana</td><td>Life Technologies</td><td>33016-015</td><td>aggiungere 5 ml di acqua ultrapura per ottenere 1 mg/ml; aliquotare in volumi in base all'uso per evitare eccessivi cicli di congelamento e scongelamento</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>PX-1565-1</td><td>utilizzare per produrre 10 stock di PBS</td></tr><tr><td>Anticorpo anti-cortactina 4F11 di topo</td><td>EMD Millipore</td><td>05-180</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>SX-0720-1</td><td>utilizzare per produrre 10 stock di PBS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>RPI</td><td>S23020</td><td>utilizzare per produrre 10 tamponi stock PBS e borato</td></tr><tr><td>NaOH (1 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>diluire con acqua ultrapura a 0,1 N</td></tr><tr><td>Nu-Serum (siero a basso contenuto proteico)</td><td>BD Biosciences</td><td>355500</td><td>utilizzare per rendere invadopodia medio</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Acros</td><td>416785000</td><td>in genere fare il 10% di stock in 1x PBS, preparare in cappa aspirante e aggiungere alcuni ml di NaOH forte per sciogliere facilmente la paraformaldeide, quindi riportare a pH 7,4 con forte HCl)</td></tr><tr><td>PBS (sterile)</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td>utilizzare per colture cellulari</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>utilizzare per rendere invadopodia medio</td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452882</td><td>preparare fresco in cappa aspirante 1 mg/ml in 1x PBS</td></tr><tr><td>Il metaborato di sodio tetraidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0251</td><td>utilizza per fare il tampone borato</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>RPI</td><td>S24060</td><td>in genere produce 10 ml di soluzione di saccarosio all'1% / gelatina all'1% in PBS e conserva a 4 &deg; C (preriscaldare il PBS per sciogliere facilmente la gelatina)</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td>produce il 10% di stock in 1x PBS e utilizzare così com'è per la rimozione delle cellule nel saggio della forza di trazione o diluire con 1x PBS per la colorazione</td></tr></tbody></table>

gel di poliacrilammide per invadopodi e trazione forza saggi sulle cellule tumorali

Polyacrylamide Gels for Invadopodia and Traction Force Assays on Cancer Cells

Tessuti tumorali rigidi sono stati fortemente implicati nella regolazione della migrazione delle cellule del cancro e l&#39;invasione. Migrazione invasiva attraverso i tessuti reticolati è facilitato da sporgenze ricchi di actina chiamati Invadopodi che proteoliticamente degradano la matrice extracellulare (ECM). Attività Invadopodi ha dimostrato di essere dipendente da rigidità ECM e il cancro delle cellule contrattili forze che suggeriscono che i segnali di rigidità possono regolare queste strutture subcellulari attraverso actomiosina contrattilità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali possono essere correlati in vitro utilizzando Invadopodi e forza di trazione test basati su gel di poliacrilammide (PaaS) di diversa rigidità. Mentre esistono delle differenze tra i due test, il protocollo qui presentata fornisce un metodo per la creazione di PAA thin può essere utilizzato in entrambi i test e sono facilmente adattabili alle esigenze biologiche e tecniche specifiche dell&#39;utente.

Nel saggio Invadopodi, Invadopodi sono in genere identificato da colocalizzazione di marcatori come actina e cortactin a strutture puntiformi all&#39;interno del corpo cellulare (Figura 1). Sia attivamente degradante e non degradanti Invadopodi può essere contato e si differenziano per se queste strutture sono colocalized con aree nere prive segnale fluorescente nella fibronectina coniugati con fluoresceina (Figura 1). Invadopodi vengono contati manualmente, e la degradazione ECM per ce...

Rigidità meccanica nel microambiente tumorale gioca un ruolo cruciale nel guidare il comportamento maligno aumentando l&#39;attività Invadopodi e actomiosina contrattilità. Utilizzando gel di poliacrilammide (PaaS), Invadopodi e forza di trazione test possono essere utilizzati per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali in risposta alla matrice rigidità.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

Rigid tumor tissues have been strongly implicated in regulating cancer cell migration and invasion. Invasive migration through cross-linked tissues is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare gel di poliacrilamide che possono essere utilizzati sia nei saggi di invasione, podia, che di forza di trazione per studiare le proprietà invasive e contrattili delle cellule tumorali. Questo viene ottenuto innanzitutto attivando le coprioggetti da 14 millimetri nelle piastre di vetro per garantire che i gel di poliacrilamide siano legati al vetro. Successivamente, vengono preparate soluzioni di poliacrilamide per entrambi i saggi, al fine di ottenere gel con diverse rigidità o proprietà meccaniche.Successivamente, i saggi sui podi invasi vengono preparati con uno strato sottile di matrice extracellulare marcata con fluorescenza per rilevare il degrado. Infine, i saggi vengono seminati con cellule tumorali per un'incubazione notturna, seguita da fissazione e colorazione dell'invadente, delle piastre podiali e da imaging in tempo reale delle piastre per la misura delle forze di trazione. In ultima analisi, la microscopia a fluorescenza viene utilizzata per ottenere immagini dell'invadente, dei podi e del degrado della matrice extracellulare.Mentre la microscopia a fluorescenza e a campo luminoso viene utilizzata rispettivamente per a

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In questo video, dimostriamo le tecniche sperimentali utilizzate per fabbricare compatibile, della matrice extracellulare (ECM) substrati rivestiti adatto per colture cellulari e che sono suscettibili di microscopia a forza di trazione e di osservare gli effetti di rigidità ECM sul comportamento delle cellule.

Preparazione di matrici di reclamo per Quantificare Contrazione Cellular

Descriviamo il metodo di prototipo per la produzione di vetrini al microscopio a fluorescenza rivestite con gelatina per la visualizzazione invadopodia-mediata degradazione della matrice. Tecniche di calcolo utilizzando il software disponibile sono presentati per quantificare i livelli risultanti di proteolisi matrice di singole cellule all'interno di una popolazione mista e per gruppi multicellulari che comprende interi campi microscopici.

Misurazione quantitativa della Invadopodia-mediata proteolisi della matrice extracellulare in singoli contesti e pluricellulari

Questo video descrive il test di microscopia della forza di trazione. Il test determina la trazione cellulare delle cellule tumorali del colon umano sulla matrice extracellulare presente su idrogel elastico morbido con perle fluorescenti incorporate. Lo spostamento risultante delle perle fluorescenti viene misurato utilizzando un software appropriato.

Saggio di citometria da trazione: un metodo per quantificare la forza di trazione esercitata dalle cellule tumorali sulla ECM

Comunemente utilizzati, sono descritti metodi altamente accessibili per l'esame migrazione cellulare e l'invasione in vitro. Il primo metodo è il saggio chiusura della ferita cella che misura la motilità cellulare. Il secondo metodo è il transwell migrazione e invasione test che valuta la chemiotassi e la capacità invasiva delle cellule.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Il nostro laboratorio ha sviluppato idrogel di poliacrilamide DNA-reticolato, un sistema dinamico di idrogel, per comprendere meglio gli effetti di modulazione rigidità dei tessuti sulla funzione delle cellule. Qui, forniamo schemi, descrizioni e protocolli per preparare questi idrogel.

Preparazione di DNA-reticolato poliacrilammide idrogel

Viene descritto un protocollo per estrarre cellule umane primarie dal tumore chirurgico del colon e dai tessuti normali. Le cellule isolate vengono poi coltivate su substrati elastici morbidi (idrogel di poliacrilammide) funzionalizzati da una proteina della matrice extracellulare e incorporati con microsfere fluorescenti. La citometria di trazione viene eseguita per valutare le sollecitazioni contrattili cellulari.

Isolamento di primarie cellule del colon tumorali umane dai tessuti chirurgici e Coltura direttamente su più elastica e flessibile substrati per trazione citometria

Qui viene descritto un metodo che consente una preparazione rapida, efficiente ed economica di gel di poliacrilammide in un formato di piastra multipozzetto. Il metodo non richiede alcuna attrezzatura specializzata e potrebbe essere facilmente adottato da qualsiasi laboratorio di ricerca. Sarebbe particolarmente utile nella ricerca incentrata sulla comprensione delle risposte cellulari dipendenti dalla rigidità.

Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

differenziazione delle cellule è regolata da una serie di fattori microambientali, tra cui entrambe le proprietà composizione della matrice e materiale del substrato. Descriviamo qui una tecnica che utilizza microarrays di cellule in combinazione con una forza di trazione microscopio per valutare sia la differenziazione cellulare e biomeccaniche interazioni cellula-substrato in funzione del contesto microambientali.

Una piattaforma cellulare microarray high-throughput per l&#39;analisi correlativa cellulare Differenziazione e forze di trazione

La migrazione collettiva delle cellule nello sviluppo, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro è spesso guidata dai gradienti dei fattori di crescita o delle molecole di segnalazione. Descritto qui è un sistema sperimentale che combina la microscopia a trazione con un sistema microfluidico e una dimostrazione di come quantificare la meccanica della migrazione collettiva in gradiente biochimico.

Microscopia di trazione integrata con microfluidica per la migrazione collettiva chemiotattica

Per avanzare, i coni di crescita devono esercitare forze di trazione contro l'ambiente esterno. La generazione delle forze di trazione dipende dalla dinamica dell'actina e dall'accoppiamento della frizione. Il presente studio descrive i metodi per analizzare la dinamica dell'actina, l'accoppiamento della frizione e le forze di trazione per l'avanzamento del cono di crescita.

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

Descriviamo i miglioramenti a un metodo standard per misurare le forze di trazione cellulare, basato sulla stampa di microcontatti con una singola fase di pattern sottrattiva di array di punti di proteine della matrice extracellulare su idrogel morbidi. Questo metodo consente una fabbricazione più semplice e coerente dei modelli a isola, essenziale per controllare la forma del cluster cellulare.

Generazione di modelli per microscopia a trazione micropattern

Scopri come creare gel di poliacrilammide per saggi di invadopodi e forza di trazione su cellule tumorali. Questo metodo consente di studiare l'attività invasiva e la contrattilità in risposta a diverse rigidità della matrice.

Gel di poliacrilammide per Invadopodi e trazione Forza saggi sulle cellule tumorali

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