Name: Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Scopri un metodo economico per identificare interazioni chimico-genetiche in Saccharomyces cerevisiae. Questa tecnica consente di rivelare i processi biologici bersaglio di specifici composti chimici.

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La ricerca in laboratorio CJN è sostenuto da sovvenzioni di funzionamento dal NSERC, la Canadian Cancer Society Research Institute (CCSRI), e la Canadian Breast Cancer Foundation (BC-Yukon Branch).

NOTA: Il flusso generale di questa procedura è illustrata nella figura 2. 1. Determinazione della Dose Growth-inibitorio <ol><li> Preparazione del lievito cultura durante la notte NOTA: I media la crescita del lievito estratto-peptone-destrosio (YEPD) utilizzato in questo protocollo è una ricetta standard 13. <ol><li> Streak out BY4741 (Mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) le cellule su un piatto agar YEPD e incubare per 48 ore a 30 ° C o fino a formare colonie visibili. </li><li> Preparare culture durante la notte inoculando 5 ml di YEPD mezzi liquidi in un recipiente di coltura sterile con una singola colonia. Incubare una notte a 30 ° C con rotazione continua o agitazione. La cultura tipicamente raggiungere la saturazione del mattino (~ 2 × 10 8 cellule / ml). </li></ol></li><li> Preparazione agar solido contenente vari dosaggi chimici <ol><li> Preparare alcuni stock diil prodotto chimico da testare a 100x la concentrazione finale desiderata in un solvente appropriato. NOTA: Le concentrazioni efficaci dipendono dalla chimica, e devono essere determinati empiricamente. Si consiglia pertanto di verificare inizialmente un&#39;ampia gamma concentrazione finale, vale a dire, dal basso all&#39;alto mM mM. </li><li> Per ciascuna concentrazione della sostanza chimica da testare, un&#39;aliquota 3 ml di agar fuso YEPD ad un vari provetta sterile. Luogo in 55 ° C bagnomaria per evitare di solidificazione. </li><li> Per ogni concentrazione di sostanza chimica da testare aggiungere 30 ml di composto 100x ai media fusi, vortice 2-3 secondi per mescolare, e pipetta 1 ml in ogni coppia di pozzetti duplicati in un 12-pozzetti. Assicurati di includere un solo veicolo di controllo. Lasciare piastre di impostare notte a temperatura ambiente. Eliminare qualsiasi supporto aggiuntivo. </li></ol></li><li> Cellule spread placcatura <ol><li> Seminare 10 ml di YEPD mezzi liquidi con 2 ml di una cultura lievito saturo, coltivate durante la notte, come nella fase 1.1.2. </li><li> Piatto 25 ml di cultura lievito diluito per pozzetto, distribuiti in modo uniforme con perline di vetro sterili o asta, e permettono la piastra si asciughi sotto una fiamma. Incubare la piastra a 30 ° C per 48 ore. </li><li> Valutare la crescita del lievito (sia numero totale e la dimensione delle colonie) sulle piastre. Selezionare una concentrazione sub-letale di composto che non inibisce la crescita di oltre l&#39;10% -15% per eseguire lo schermo. </li></ol></li></ol> 2. sistematica schermo chimica genetica <ol><li> Manutenzione di delezione-mutante-array (DMA) e preparazione della Sorgente Piastra <ol><li> Per una descrizione dettagliata sulla costruzione di matrici mutanti cancellazione dalle scorte glicerolo consultare Baryshnikova et al. 14. Una volta mutanti di delezione sono schierati con una densità di 384 colonie per piastra, il DMA può essere conservato per parecchi mesi a 4 ° C. Replica su agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418, se necessario, per evitare le colonie di crescere in ognialtro. NOTA: Multiple repliche di serie dovrebbero essere evitati per prevenire la perdita dei ceppi a crescita lenta e ridurre al minimo la comparsa di mutanti soppressori. Ciò è particolarmente importante se il mantenimento delle collezioni come aploidi. </li><li> Eseguire il replica-placcatura usando un microbica arraying sistema robotico. In alternativa, manipolare le colonie usando strumenti pinning manuali schierati. NOTA: La collezione cancellazione lievito è disponibile come aploidi e diploidi da diverse fonti commerciali e in genere viene fornito come scorte glicerolo in piastre da 96 pozzetti. </li></ol></li><li> Condensazione la matrice delezione mutante <ol><li> Preparare 250 ml di agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418. La concentrazione effettiva dei G418 può variare e ciascuna partita deve essere testato empiricamente. </li><li> Preparare cinque piastre di agar YEPD versando 50 ml di agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418 per piastra. Fare questo un giorno prima condensazione matrice e consentono le piastre raffreddare a temperatura ambienteerature durante la notte su una superficie piatta. NOTA: Quattro piastre saranno necessari per la raccolta a densità 1.536-deformazione, il quinto piatto viene versato come un extra. </li><li> Rimuovere le 16 piastre Petri contenenti raccolta delezione mutante con una densità di 384 colonie per piastra e lasciare riposare a temperatura ambiente (~ 1 ora). </li><li> Asciugare la condensa che si è formata sul coperchio di ogni piatto con un compito delicato pulire. In caso contrario si può causare gocce d&#39;acqua depositato sulla matrice e la contaminazione incrociata dei mutanti schierati. </li><li> Utilizzando una matrice pinning robot microbica, condensare il DMA da una densità di 384 colonie per piastra (16 piatti Petri) a 1.536 colonie per piastra (4 piatti Petri). Eseguire questo in modo che il 1 ° colonia dalla piastra 1 perni alla riga 1 colonna 1 della matrice condensata, il 1 ° colonia di piastra 2 alla riga 1, colonna 2, 1 ° colonia di piastra 3 alla riga 2 e colonna 1, e la colonia 1 ° piatto 4 a Row 2colonna 2. </li><li> Incubare la matrice consolidato a 30 ° C per una notte. </li><li> Esaminare la matrice di garantire il trasferimento uniforme delle colonie da lastre di origine. Ci saranno diverse posizioni vuote, appositamente incorporate nella matrice, che fungono da guida per garantire la DMA è stato condensato correttamente (Figura 4A). NOTA: Questi saranno i piatti di origine per la placcatura replica sul supporto contenente il composto in esame. Una piastra singola fonte può essere utilizzata per più pinnings. Anche molti robot avranno una funzione di compensazione, che garantirà un numero simile di lievito vengono trasferiti ogni volta. </li></ol></li><li> Piastra Replica matrice eliminazione mutante <ol><li> Preparare 700 ml di controllo (solo veicolo) e 700 ml di mezzi sperimentali (-chimici contenenti). Questo è sufficiente per l&#39;esecuzione del test in triplice copia (12 piastre per condizione, più due extra). </li><li> Versare 50 ml di YEPD agar contenenti test chimico o di controllo per piastra. Lasciare le piastre to raffreddare a temperatura ambiente per una notte su una superficie piatta. </li><li> Utilizzando il robot piatto replica, inoculare il DMA su tre serie di piastre contenenti sostanze chimiche a concentrazione determinato sperimentalmente, così come tre set di piastre contenenti il ​​controllo del veicolo. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 24-48 ore. </li></ol></li></ol> 3. piastrine e analisi dei dati <ol><li> Rimuovere le piastre da incubatore e permettere loro di venire a temperatura ambiente (~ 1 ora) prima di imaging. Questo consentirà di evitare la formazione di condensa, mentre l&#39;imaging le piastre. </li><li> Fosfori a 24 e 48 ore rimuovendo il coperchio e mettendo la faccia in giù su un letto piano dello scanner. Catturare immagini con una risoluzione di almeno 300 dpi. In alternativa, utilizzare una fotocamera digitale per catturare le immagini. Se così facendo, piatti segnaposto faccia in su uno sfondo scuro e rimuovere i coperchi di immagine. NOTA: Il formato del file e posizionamento delle piastre dipenderanno dal programma di quantificazione utilizzato. </li&gt; <li> Eseguire la quantificazione e il confronto delle dimensioni della colonia di matrice utilizzando uno dei numerosi programmi open source, tra cui Balony 15, SGAtools 16, e ScreenMill 17. </li></ol> 4. Validazione di schermo NOTA: In questa fase diverse eliminazioni di lievito mutanti segnerà come ipersensibili alla chimica di interesse. Queste interazioni chimiche-genetici devono essere convalidati prossimo in due modi. Innanzitutto l&#39;identità di ceppi sensibili dovrebbe essere confermata mediante PCR. In secondo luogo, la sensibilità chimica deve essere segnato in modo indipendente. Per eseguire un breve protocollo per l&#39;esecuzione di test avvistamento per convalidare ceppo ipersensibilità, una tecnica comune in lievito biologia. <ol><li> Streak out desiderato (ipersensibilità) mutanti della collezione eliminazione lievito su agar YEPD contenente 200 mg / ml di G418. Incubare a 30 ° C fino formano colonie. Verificare il genotipo del ceppo mediante PCR diagnostico con primer secondoprotocollo del produttore. </li><li> Seminare 5 ml del liquido YEPD per ogni ceppo e incubare una notte a 30 ° C con rotazione o agitazione. </li><li> Misurare OD 600 e diluire ogni ceppo di OD 600 = 1 in dH sterile 2 O. Queste sono oggi le colture di lieviti normalizzati. </li><li> Dispensare 100 l di normalizzato wild-type di lievito (BY4741) cultura e A1 di una piastra a 96 pozzetti. Dispensare 100 l di fino a sette ceppi supplementari per pozzi B1-H1. </li><li> Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 90 ml di dH 2 O sterile per pozzi A2-H2 attraverso A6-H6. Infine, preparare una serie di diluizioni 1:10 di colture di lieviti normalizzati. Inizia in serie pipettando 10 ml di colonna 1, colonna 2, con una pipetta multicanale, e continuare attraverso la piastra a 96 pozzetti prima di aver effettuato sei diluizioni (ie, 10 0-10 -5). </li><li> Trasferire 2-5 ml di colture di lievito diluito in una griglia con un multicanalepipetta su terreni solidi YEPD contenenti prodotti chimici e dei veicoli di controllo. Incubare le piastre a temperatura appropriata per 24-48 ore. </li><li> Ispezionare le piastre e confrontare la sensibilità di selezionare mutanti ad agenti chimici (rispetto al BY4741 controllo). Fosfori a 24 e 48 ore come al punto 3.2. NOTA: Mentre l&#39;identificazione di diversi ceppi ipersensibili con ontologie geniche correlate o funzioni presta fiducia alla validità dello schermo, la trasformazione di un ceppo delezione ipersensibile con un plasmide contenente una copia del gene wild-type è necessaria per stabilire formalmente che un gene cancellazione di interesse (e le mutazioni non nascosti secondo sito) provoca la sensibilità ai farmaci. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Delineato qui è un approccio per la generazione di profili di interazione chimico-genetico. Il metodo è semplice: confrontando le dimensioni delle colonie di ciascun ceppo in complete collezioni delezione genica in presenza e in assenza di una sostanza chimica, tutti i geni necessari per tollerare un insulto chimica sono identificati. Analisi annotazione arricchimento della lista risultante dei ceppi sensibili può quindi essere utilizzato per fornire una visione in una modalità di azione chimica. Mentre questo protocoll...

Gli strumenti e le risorse disponibili nel organismo modello Saccharomyces cerevisiae genetici hanno permesso grandi studi di genomica funzionale che forniscono insieme nuovi indizi su come i geni funzionano come reti per soddisfare i requisiti dei sistemi biologici. La pietra angolare di questi strumenti è stata la creazione collaborativa di un set completo di delezioni geniche non essenziali di tutte le fasi di lettura aperte nel lievito 1,2. Un&#39;osservazione sorprendente è che solo il ~ 20% dei geni di lievito sono necessari per la vitalità quando cresciuto come aploidi in condizioni standard di laboratorio. Ciò evidenzia la capacità di una cellula per tamponare contro perturbazioni genomiche attraverso l&#39;utilizzo di percorsi biologici alternativi. Mutanti genetici che sono vitali singolarmente, ma letali in combinazione, segnalano percorsi biologici paralleli collegati o convergenti e formano reti di interazione genetica che descrivono la funzione biologica. Con lo sviluppo di te condizionalealleli mperature-sensibili e hypomorphic di geni essenziali della tecnologia non è stato limitato allo studio di geni non essenziali 3,4. Questo concetto è stato applicato su scala genomica produce un imparziale mappa interazione genetica che illustra come i geni coinvolti in processi cellulari simili raggruppano 5. Perturbazioni chimiche di reti genetiche delezioni geniche mimici (Figura 1) 6. Interrogazione composti inibitori della crescita contro una matrice ad alta densità di ceppi di eliminazione per ipersensibilità identifica un profilo di interazione chimico-genetico, cioè una lista di geni che è richiesto di tollerare lo stress chimico. Come interazioni genetiche, schermi di grandi dimensioni di librerie chimiche hanno dimostrato che i composti con una modalità d&#39;azione simile grappolo insieme 7. Pertanto, stabilendo il profilo interazione chimica-genetica di un composto della modalità di azione può dedurre confrontandola con larinterazione genetica e chimica sintetica ge scala genetica Dataset 8,9. Schermi chimico-genetico su larga scala, in cui vengono interrogati decine di composti, sono stati eseguiti da saggi concorrenza barcode. In questo approccio, la raccolta aggregata dei ceppi di delezione è coltivato in massa per diverse generazioni in un piccolo volume di supporti contenenti una sostanza chimica. Dal momento che ogni mutante eliminazione nasconde un codice a barre genetico unico, la redditività / crescita dei singoli mutanti nel pool di ceppi cancellazione è monitorata da microarray o high-throughput sequencing 10. La presunzione di idoneità monitorando dimensioni colonia di mutanti fisicamente Arrayed coltivate su agar solido contenente un composto bioattivo è anche un metodo efficace per identificare interazioni chimiche-genetica 11,12. Questo approccio offre un&#39;alternativa conveniente per lo screening basato sulla concorrenza ed è adatto per saggiare le piccole librerie di sostanze chimiche.Delineato qui è una semplice metodologia per la produzione di un elenco di interazioni chimico-genetico in S. cerevisiae che non si basa su manipolazioni biologia molecolare o infrastrutture. Si richiede solo una collezione di eliminazione di lievito, un apparato pinning robotizzato o manuale, e liberamente disponibili software di analisi dell&#39;immagine.

<table><tbody><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>Per terreni liquidi/solidi YEPD aggiungere alla concentrazione finale dell'1% (p/v)</td></tr><tr><td>Polvere di tyrptone</td><td>BD Biosciences</td><td>211820</td><td>Per terreni liquidi/solidi YEPD aggiungere alla concentrazione finale del 2% (p/v)</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Anachemia</td><td>31096-380</td><td>Per i mezzi liquidi/solidi YEPD aggiungere al 2% di concentrazione finale (p/v) &#8212; Non sterilizzare in autoclave. Preparare la soluzione madre al 20%, filtrare e sterilizzare e aggiungere al terreno dopo la sterilizzazione in autoclave.</td></tr><tr><td>Agar A</td><td>Bio Basic</td><td>FB0010</td><td>Per YEPD solidi aggiungere al 2% di concentrazione finale (p/v)G418</td></tr> <tr><td></td><td>A.G. Scientific Inc.</td><td>G-1033</td><td>Prepara 1.000 stock a 200&nbsp; mg/ml in dH2O e filtro sterilizzare.</td></tr><tr><td>piastra a 12 pozzetti</td><td>Greiner Bio One</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>provette per coltura da 5 ml</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-2376-080</td><td></td></tr><tr><td>piastra Petri da 10 cm</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>ROTOR HDA</td><td>Singer Instruments&nbsp;</td><td>ROT-001</td><td>robot di spillatura per array microbici ad alta produttività</td></tr><tr><td>PLUSPLATE&copy; Petri Dish</td><td>Singer Strumenti&nbsp;</td><td>PLU-001</td><td>Scatola da 200 piatti</td></tr><tr><td>384 RePad a perno corto</td><td>Strumenti Singer</td><td>RP-MP-384</td><td>Scatola da 1.000 pad</td></tr><tr><td>1536 RePad a pin corto</td><td>Strumenti Singer&nbsp;</td><td>RP-MP-1536</td><td>Scatola da 1.000 pastiglie</td></tr><tr><td colspan="4">Strumenti di spillatura alternativi:</td></tr><tr><td>Sistemi Robtic completamente automatizzati</td><td>S& P robotics</td><td>http://www.sprobotics.com</td><td>Sono disponibili diversi sistemi robitici e di imaging automatizzati per la gestione delle colonie.</td></tr><tr><td>Strumenti di bloccaggio manuale</td><td>V& P Scientific</td><td>http://www.vp-scientific.com</td><td>Strumenti e accessori per la replica portatile.</td></tr></tbody></table>

rapida identificazione dei chimici genetici interactions in<em&gt; saccharomyces cerevisiae</em

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determinare la modalità di azione delle sostanze chimiche bioattive è di interesse per una vasta gamma di accademici, farmaceutico, e gli scienziati industriali. Saccharomyces cerevisiae, o lievito in erba, è un modello eucariote che una collezione completa di ~ 6.000 mutanti di delezione genica e hypomorphic gene essenziale mutanti sono disponibili in commercio. Queste collezioni di mutanti possono essere utilizzati per rilevare sistematicamente interazioni chimico-gene, cioè geni necessari a tollerare una sostanza chimica. Queste informazioni, a sua volta, riporta sulla modalità probabile di azione del composto. Qui si descrive un protocollo per la rapida identificazione di interazioni chimiche-genetico in erba lievito. Noi dimostriamo il metodo utilizzando l&#39;agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU), che ha un meccanismo ben definito di azione. I nostri risultati mostrano che il vagabondo nucleare rna exosome e riparazione del DNA enzimi sono necessari per la proliferazione in presenza di 5-FU, che è coerente con le precedenti microarray approcci basati su codice a barre chimico genetiche e le conoscenze che il 5-FU influisce negativamente sia il metabolismo RNA e DNA. Sono descritti anche i protocolli di validazione richieste di questi schermi ad alto rendimento.

Come una convalida di questo approccio abbiamo effettuato un rappresentante chimica schermo interazione genetica dell&#39;agente chemioterapico 5-fluorouracile (5-FU) seguendo il protocollo descritto sopra. 5-FU si caratterizza per interrompere timidilato sintasi così come DNA e RNA metabolismo 18. Le interazioni genetiche chimiche su 5-FU sono ben studiati e sono stati studiati con tecniche di lievito barcode microarray utilizzando collezioni cancellazione eterozigoti e omozigoti 8,19. Qui mostria...

Qui presentiamo un metodo economico per definire le interazioni chimico-genetiche nel lievito in gemmazione. L'approccio si basa su tecniche fondamentali nella biologia molecolare del lievito ed è adatto per l'interrogazione meccanicistica di piccole e medie collezioni di sostanze chimiche e altri ambienti multimediali.

Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare le cellule di lievito per trovare i processi biologici bersaglio di una sostanza chimica di interesse. Ciò si ottiene determinando prima il profilo dose-risposta di una sostanza chimica per il lievito. Il secondo passo consiste nel far crescere una collezione completa di ceppi knockout genici di lievito su una dose subletale di sostanza chimica e su una piastra di controllo.Successivamente vengono identificati i mutanti del lievito che sono ipersensibili alla sostanza chimica. Questo elenco viene analizzato bioinformaticamente per rivelare tutti i geni necessari per tollerare la sostanza chimica. Il passo finale consiste nell'eseguire una replica biologica dell'esperimento a bassa produttività.Questo convalida tutte le interazioni geniche chimiche trovate. In definitiva, questo metodo di screening genetico chimico ad alto rendimento viene utilizzato per mostrare quali prodotti genici e percorsi biologici vengono utilizzati per tollerare la sostanza chimica di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la crescita competitiva di mutanti con codice a barre in coltura liquida, è che non sono necessarie tecniche di biologia molecolare.Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia chimica, come ad esempio come una nuova piccola molecola può inibire la crescita delle cellule eucariotiche. Per iniziare, prepara una coltura di lievito durante la notte strisciando BY 4 7 4 1 cellule su piastra A-Y-E-P-D e incuba per 48 ore a 30 gradi Celsius o fino a quando non si formano colonie visibili. Quando le colonie saranno pronte.Preparare colture liquide durante la notte prelevando una singola colonia e inoculando cinque millilitri di terreno liquido YEPD in un recipiente sterile. Quindi incubare per una notte a 30 gradi Celsius con rotazione continua o agitazione. Successivamente, preparare terreni di agar solidi contenenti varie dosi della sostanza chimica da testare.Per fare questo. Innanzitutto, preparare diverse soluzioni madre della sostanza chimica di interesse a 100 volte la concentrazione finale in un solvente appropriato. Quindi, per ogni concentrazione da testare, aliquotare tre millilitri di agar YEPD fuso in diverse provette di coltura sterili.Immergere i tubi contenenti l'agar in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius per evitare la solidificazione dell'agar. Ora, per ogni concentrazione di sostanza chimica da testare a 13, rilascio bianco del composto 100 x in un'aliquota di agar tex fuso, la provetta per due o tre secondi per mescolare e poi pipettare un millilitro da ciascuna provetta in pozzetti duplicati in una piastra a 12 mondi, lasciare che la piastra si solidifichi per una notte a temperatura ambiente. Il giorno seguente, inoculare 10 millilitri di terreno liquido YEPD con due microlitri di coltura di lievito saturo durante la notte.Quindi pipettare 25 microlitri di questa coltura sulla sostanza chimica contenente agar nei pozzetti della piastra da 12 balene e distribuire uniformemente utilizzando perle di vetro sterili o un'asta sterile. Lasciare asciugare la piastra sotto una fiamma e poi incubare la piastra a 30 gradi Celsius per 48 ore. Trascorso il tempo di incubazione, valutare il numero totale e le dimensioni delle colonie nei pozzetti.Identificare una concentrazione subletale di composto che non inibisca la crescita di oltre il 10-15% da utilizzare nello schermo. Mantenere il tasso di mutazione di delezione a una densità di 384 colonie per piastra replicando su 16 piastre di agar YEPD, contenenti 200 microlitri per millilitro di G quattro 18. Utilizzando un sistema robotico di array microbico o strumenti di pinning manuale ogni tre mesi.Conservare le piastre a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Quindi preparare 250 millilitri di terreno di coltura agar YEPD con la stessa concentrazione di G, quattro piastre da 18 o cinque agar e lasciarle raffreddare per una notte a temperatura ambiente su una superficie piana e uniforme. Rimuovere le piastre contenenti la collezione di mutanti di delezione dalla conservazione a quattro gradi Celsius e lasciare che le piastre raggiungano la temperatura ambiente.Utilizzare un panno delicato per rimuovere la condensa che si è formata sul coperchio di ciascuna piastra per evitare che le goccioline d'acqua si depositino sull'array e la contaminazione incrociata dei mutanti dell'array. Chiedere al robot di blocco dell'array microbico di condensare l'array mutante di delezione da una densità di 384 colonie per piastra su 16 piastre di Petri a 1.536 colonie per piastra su quattro piastre di Petri. Dopo aver incubato l'array a 30 gradi Celsius durante la notte, esaminare l'array per garantire un trasferimento uniforme delle colonie dalle piastre di origine.Ci saranno diverse posizioni vuote incorporate nell'array, che fungono da guida per verificare che l'array mutante di delezione sia stato condensato correttamente. Queste saranno le piastre di origine utilizzate per replicare su supporti contenenti il composto di interesse. Una singola piastra sorgente può essere utilizzata per più pinning.Inoltre, molti robot hanno caratteristiche di offset che lo permetteranno, il che garantirà un numero simile di lieviti trasferiti ogni volta. Per impostare la riparazione dell'array mutante di delezione della piastra replica, 700 millilitri di solo veicolo di controllo e agar YEPD sperimentale contenente la sostanza chimica di interesse. Questo è sufficiente per eseguire il test in triplicato.Versare i piatti utilizzando l'agar di controllo e sperimentale. Aggiungendo 50 millilitri a ogni piatto. Lasciare raffreddare le piastre a temperatura ambiente per una notte su una superficie piana e uniforme, utilizzando il robot per riapplicare una piastra.Inoculare l'array di doppi mutanti su tre serie di piastre contenenti sostanze chimiche alla concentrazione determinata sperimentalmente, nonché su azzeri di piastre contenenti il controllo del veicolo. Incubare le piastre sul piano di lavoro a temperatura ambiente per un totale di 24-48 ore di immagine. Le piastre sono 24 e 48 ore di incubazione rimuovendo il coperchio e posizionandole a faccia in giù su uno scanner piano.Acquisisci immagini con una risoluzione di almeno 300 DPI. In alternativa, utilizzare una fotocamera digitale per acquisire immagini. In tal caso, posizionare i piatti a faccia in su su uno sfondo scuro e rimuovere i coperchi per l'immagine.Quindi esegui la quantificazione e il confronto delle dimensioni delle colonie di array utilizzando uno dei numerosi programmi open source, tra cui gli strumenti SGA a sfera e il mulino a vaglio. In questa fase, diversi mutanti con delezione del lievito saranno valutati come ipersensibili alla sostanza chimica di interesse per estrarre i mutanti ipersensibili desiderati dalla raccolta di delezione del lievito su YEPD. Ager contenente 200 microgrammi per microlitro di G, quattro 18 incubano a 30 gradi Celsius fino a formare colonie.Dopo aver verificato il genotipo del ceppo mediante PCR diagnostica ed elettroforesi di Agel, inoculare cinque millilitri di liquido YPD con ciascun ceppo e incubare per una notte a 30 gradi Celsius con rotazione o agitazione. Misurare l'OD 600 di ciascuna coltura e diluire ogni ceppo fino a un OD 600 di uno in acqua distillata sterile. Queste sono ora le colture di lievito normalizzate.Successivamente, erogare 100 microlitri di wild type normalizzato mediante coltura di lievito 4 7 4 1 al pozzetto A uno di una piastra da 96 pozzetti erogare 100 microlitri di un massimo di sette ceppi aggiuntivi ai pozzetti, da B uno a H uno. Quindi, erogare 90 microlitri di acqua sterile nei pozzi, da A due a H due fino a un sei a H sei. Infine preparare una serie di diluizioni da una a 10 di sculture G normalizzate.Iniziare pipettando in serie 10 microlitri dalla colonna uno alla colonna due con una pipetta multicanale e continuare attraverso la piastra a 96 pozzetti fino a quando non vengono effettuate sei diluizioni. Quindi utilizzare la pipetta multicanale per due-cinque microlitri di colture di lievito diluite in una griglia su YEP D, terreni solidi contenenti sostanze chimiche e controllo del veicolo. Incubare le piastre alla temperatura appropriata per 24-48 ore dopo l'incubazione.Ispezionare le piastre e confrontare la sensibilità di mutanti selezionati alla sostanza chimica rispetto alle piastre dell'immagine di controllo BY 47 41 a 24 e 48 ore. Come prima, le immagini seguenti mostrano i risultati della procedura per determinare la concentrazione inibitoria della subina della sostanza chimica. La prima immagine mostra la crescita di una coltura satura BY 4 7 4 1 diluita da uno a 5.000 e placcata su concentrazioni crescenti di cinque fluoro uracile.La concentrazione di 10 micromolari viene selezionata come dose inibitoria sub-in. Questa immagine mostra la curva di crescita di BY 4, 7, 41 cellule in mezzi liquidi contenenti cinque fluro uracile. Circa quattro volte 10 su quattro cellule sono state depositate in triplicato e concentrazioni crescenti di cinque fluorouracile e densità ottiche sono state misurate ogni 10 minuti per 22 ore.Ancora una volta, si può vedere che la dose di 10 micromolari è la dose inibitoria della subina. Queste immagini successive mostrano i risultati di un verde di genetica chimica di cinque fluoro uracile. Qui, viene mostrato un array mutante di delezione di S sachar visier replicato su agar YPD contenente 10 micromolari di cinque uracile Fluor a destra e il controllo DMSO a sinistra.Questo grafico mostra i risultati della genetica chimica verde, la crescita relativa dei mutanti su 10 micromolari. Cinque uracile fluorescenti rispetto al controllo DMSO sono ordinati in base alla posizione del raggio. La crescita relativa dei mutanti su uracile 10 micromolari e cinque flora rispetto al controllo DMSO è ordinata in base al rapporto di dimensione della colonia.Su entrambi i grafici è indicata una soglia di rapporto inferiore a 0,8. Questa immagine finale mostra i risultati di tre saggi di convalida. Diluizioni seriali di diversi ceppi mutanti isolati sono state coltivate con il controllo DMSO a sinistra, 10 micromolari, cinque fluoro UIL al centro e 0,015% di metilmetano sulfonato a destra.Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi di lavorare con una copia affidabile dell'array di mutanti di delezione e convalidare i risultati utilizzando una metodologia indipendente come i saggi di spotting del lievito o la dissezione della tetrade del lievito. Questa tecnica fornisce un mezzo efficiente per gli scienziati nel campo della ricerca su piccole molecole per esplorare la modalità d'azione di un composto utilizzando approcci a livello di sistema nel lievito in gemmazione.

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Abbiamo sviluppato completa, imparziale genoma schermate per capire gene-farmaco e interazioni gene-ambiente. Metodi per lo screening queste collezioni mutanti sono presentati.

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Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

In questo video, dimostriamo il test del lievito modificato one-hybrid, che rileva più proteine che interagiscono con il DNA bersaglio. Le cellule di lievito trasformate contengono la sequenza di DNA bersaglio a monte del gene reporter. Inoltre, esprimono proteine del fattore di trascrizione. Quando le proteine formano complessi e si legano al DNA bersaglio, il gene reporter viene espresso e può essere rilevato enzimaticamente.

Saggio ibrido lievito-uno modificato per rilevare le interazioni eteromeriche tra complesso proteico e DNA

Descriviamo la cedola endogena cromatina accoppiata con sequenza ad alto rendimento (ChEC-seq), un metodo ortogonale di immunoprecipitazione cromatina (ChIP) per la mappatura dei siti di legame proteico a livello genomico con proteine ​​di fusione microscopica nuclease (MNase).

Mappatura di interazioni proteine-DNA con ChEC-seq nel gene-wide<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Vi presentiamo un protocollo di schermo semplice soppressore in fissione lievito. Questo metodo è efficiente, privo di sostanza mutagena e selettivo per le mutazioni che si verificano spesso in un singolo locus genomico.  Il protocollo è adatto per isolare i soppressori che alleviare i difetti di crescita in coltura liquida che sono causati da una mutazione o una droga.

Una schermata di soppressore Deep-sequenziamento-assistita, spontanea nel lievito a fissione Schizosaccharomyces pombe

L'emizigozia reciprocata tramite sequenziamento (RH-seq) è un nuovo potente metodo per mappare la base genetica di una differenza tra le specie. I pool di emizigotes sono generati dalla mutagenesi trasposonista e la loro forma fisica è monitorata attraverso la crescita competitiva utilizzando il sequenziamento ad alto tutto. L'analisi dei dati risultanti individua i geni alla base del tratto.

Mappatura genetica delle differenze di termotolleranza tra le specie di Saccamici Yeast tramite l'analisi dell'emizigosità reciproca genomica

I patogeni batterici secernono proteine nell'ospite che prendono di mira processi biologici cruciali. Identificare le vie host mirate alle proteine degli effetti batterici è fondamentale per affrontare la patogenesi molecolare. Qui, viene descritto un metodo che utilizza un soppressore di lievito modificato e uno schermo di tossicità per chiarire le vie dell'ospite mirate alle proteine degli efettori batterici tossici.

Identificazione dei percorsi host mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando la tossicità del lievito e gli schermi soppressori

Per studiare le interazioni chaperone-chaperone e chaperone-substrato, eseguiamo screening di interazione sintetica in Caenorhabditis elegans utilizzando l'interferenza dell'RNA in combinazione con mutazioni lievi o sovraespressione di chaperoni e monitoriamo la disfunzione proteica tessuto-specifica a livello di organismo.

Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche

Qui, descriviamo l'utilizzo di Grafix (Gradient Fixation), una centrifugazione a gradiente di glicerolo in presenza di un reticolante, per identificare le interazioni tra fattori di splicing che si legano transitoriamente al complesso spliceosoma.

Utilizzo di Grafix per la rilevazione di interattori transitori di sottocomplessi di saccharomyces cerevisiae spliceosomi

Questo lavoro descrive un protocollo per uno screening genetico multicopia soppressore in Schizosaccharomyces pombe. Questa schermata utilizza una libreria plasmidica dell'intero genoma per identificare cloni soppressori di un fenotipo con perdita di funzione associato a un ceppo mutante di query. Nuovi soppressori genetici del mutante nullo ell1 sono stati identificati utilizzando questa schermata.

Screening genetico per l'identificazione di soppressori multicopia in Schizosaccharomyces pombe

I saggi di acquisizione D-loop (DLC) e D-loop extension (DLE) utilizzano il principio della legatura di prossimità insieme alla PCR quantitativa per quantificare la formazione di D-loop, l'estensione del D-loop e la formazione del prodotto nel sito di una rottura inducibile a doppio filamento in Saccharomyces cerevisiae.

Individuazione di intermedi di ricombinazione omologhi tramite legatura di prossimità e PCR quantitativa in Saccharomyces cerevisiae

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