Rapida identificazione dei chimici genetici Interactions in

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di utilizzare le cellule di lievito per trovare i processi biologici bersaglio di una sostanza chimica di interesse. Ciò si ottiene determinando prima il profilo dose-risposta di una sostanza chimica per il lievito. Il secondo passo consiste nel far crescere una collezione completa di ceppi knockout genici di lievito su una dose subletale di sostanza chimica e su una piastra di controllo.

Successivamente vengono identificati i mutanti del lievito che sono ipersensibili alla sostanza chimica. Questo elenco viene analizzato bioinformaticamente per rivelare tutti i geni necessari per tollerare la sostanza chimica. Il passo finale consiste nell'eseguire una replica biologica dell'esperimento a bassa produttività.

Questo convalida tutte le interazioni geniche chimiche trovate. In definitiva, questo metodo di screening genetico chimico ad alto rendimento viene utilizzato per mostrare quali prodotti genici e percorsi biologici vengono utilizzati per tollerare la sostanza chimica di interesse. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la crescita competitiva di mutanti con codice a barre in coltura liquida, è che non sono necessarie tecniche di biologia molecolare.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia chimica, come ad esempio come una nuova piccola molecola può inibire la crescita delle cellule eucariotiche. Per iniziare, prepara una coltura di lievito durante la notte strisciando BY 4 7 4 1 cellule su piastra A-Y-E-P-D e incuba per 48 ore a 30 gradi Celsius o fino a quando non si formano colonie visibili. Quando le colonie saranno pronte.

Preparare colture liquide durante la notte prelevando una singola colonia e inoculando cinque millilitri di terreno liquido YEPD in un recipiente sterile. Quindi incubare per una notte a 30 gradi Celsius con rotazione continua o agitazione. Successivamente, preparare terreni di agar solidi contenenti varie dosi della sostanza chimica da testare.

Per fare questo. Innanzitutto, preparare diverse soluzioni madre della sostanza chimica di interesse a 100 volte la concentrazione finale in un solvente appropriato. Quindi, per ogni concentrazione da testare, aliquotare tre millilitri di agar YEPD fuso in diverse provette di coltura sterili.

Immergere i tubi contenenti l'agar in un bagno d'acqua a 55 gradi Celsius per evitare la solidificazione dell'agar. Ora, per ogni concentrazione di sostanza chimica da testare a 13, rilascio bianco del composto 100 x in un'aliquota di agar tex fuso, la provetta per due o tre secondi per mescolare e poi pipettare un millilitro da ciascuna provetta in pozzetti duplicati in una piastra a 12 mondi, lasciare che la piastra si solidifichi per una notte a temperatura ambiente. Il giorno seguente, inoculare 10 millilitri di terreno liquido YEPD con due microlitri di coltura di lievito saturo durante la notte.

Quindi pipettare 25 microlitri di questa coltura sulla sostanza chimica contenente agar nei pozzetti della piastra da 12 balene e distribuire uniformemente utilizzando perle di vetro sterili o un'asta sterile. Lasciare asciugare la piastra sotto una fiamma e poi incubare la piastra a 30 gradi Celsius per 48 ore. Trascorso il tempo di incubazione, valutare il numero totale e le dimensioni delle colonie nei pozzetti.

Identificare una concentrazione subletale di composto che non inibisca la crescita di oltre il 10-15% da utilizzare nello schermo. Mantenere il tasso di mutazione di delezione a una densità di 384 colonie per piastra replicando su 16 piastre di agar YEPD, contenenti 200 microlitri per millilitro di G quattro 18. Utilizzando un sistema robotico di array microbico o strumenti di pinning manuale ogni tre mesi.

Conservare le piastre a quattro gradi Celsius fino al momento del bisogno. Quindi preparare 250 millilitri di terreno di coltura agar YEPD con la stessa concentrazione di G, quattro piastre da 18 o cinque agar e lasciarle raffreddare per una notte a temperatura ambiente su una superficie piana e uniforme. Rimuovere le piastre contenenti la collezione di mutanti di delezione dalla conservazione a quattro gradi Celsius e lasciare che le piastre raggiungano la temperatura ambiente.

Utilizzare un panno delicato per rimuovere la condensa che si è formata sul coperchio di ciascuna piastra per evitare che le goccioline d'acqua si depositino sull'array e la contaminazione incrociata dei mutanti dell'array. Chiedere al robot di blocco dell'array microbico di condensare l'array mutante di delezione da una densità di 384 colonie per piastra su 16 piastre di Petri a 1.536 colonie per piastra su quattro piastre di Petri. Dopo aver incubato l'array a 30 gradi Celsius durante la notte, esaminare l'array per garantire un trasferimento uniforme delle colonie dalle piastre di origine.

Ci saranno diverse posizioni vuote incorporate nell'array, che fungono da guida per verificare che l'array mutante di delezione sia stato condensato correttamente. Queste saranno le piastre di origine utilizzate per replicare su supporti contenenti il composto di interesse. Una singola piastra sorgente può essere utilizzata per più pinning.

Inoltre, molti robot hanno caratteristiche di offset che lo permetteranno, il che garantirà un numero simile di lieviti trasferiti ogni volta. Per impostare la riparazione dell'array mutante di delezione della piastra replica, 700 millilitri di solo veicolo di controllo e agar YEPD sperimentale contenente la sostanza chimica di interesse. Questo è sufficiente per eseguire il test in triplicato.

Versare i piatti utilizzando l'agar di controllo e sperimentale. Aggiungendo 50 millilitri a ogni piatto. Lasciare raffreddare le piastre a temperatura ambiente per una notte su una superficie piana e uniforme, utilizzando il robot per riapplicare una piastra.

Inoculare l'array di doppi mutanti su tre serie di piastre contenenti sostanze chimiche alla concentrazione determinata sperimentalmente, nonché su azzeri di piastre contenenti il controllo del veicolo. Incubare le piastre sul piano di lavoro a temperatura ambiente per un totale di 24-48 ore di immagine. Le piastre sono 24 e 48 ore di incubazione rimuovendo il coperchio e posizionandole a faccia in giù su uno scanner piano.

Acquisisci immagini con una risoluzione di almeno 300 DPI. In alternativa, utilizzare una fotocamera digitale per acquisire immagini. In tal caso, posizionare i piatti a faccia in su su uno sfondo scuro e rimuovere i coperchi per l'immagine.

Quindi esegui la quantificazione e il confronto delle dimensioni delle colonie di array utilizzando uno dei numerosi programmi open source, tra cui gli strumenti SGA a sfera e il mulino a vaglio. In questa fase, diversi mutanti con delezione del lievito saranno valutati come ipersensibili alla sostanza chimica di interesse per estrarre i mutanti ipersensibili desiderati dalla raccolta di delezione del lievito su YEPD. Ager contenente 200 microgrammi per microlitro di G, quattro 18 incubano a 30 gradi Celsius fino a formare colonie.

Dopo aver verificato il genotipo del ceppo mediante PCR diagnostica ed elettroforesi di Agel, inoculare cinque millilitri di liquido YPD con ciascun ceppo e incubare per una notte a 30 gradi Celsius con rotazione o agitazione. Misurare l'OD 600 di ciascuna coltura e diluire ogni ceppo fino a un OD 600 di uno in acqua distillata sterile. Queste sono ora le colture di lievito normalizzate.

Successivamente, erogare 100 microlitri di wild type normalizzato mediante coltura di lievito 4 7 4 1 al pozzetto A uno di una piastra da 96 pozzetti erogare 100 microlitri di un massimo di sette ceppi aggiuntivi ai pozzetti, da B uno a H uno. Quindi, erogare 90 microlitri di acqua sterile nei pozzi, da A due a H due fino a un sei a H sei. Infine preparare una serie di diluizioni da una a 10 di sculture G normalizzate.

Iniziare pipettando in serie 10 microlitri dalla colonna uno alla colonna due con una pipetta multicanale e continuare attraverso la piastra a 96 pozzetti fino a quando non vengono effettuate sei diluizioni. Quindi utilizzare la pipetta multicanale per due-cinque microlitri di colture di lievito diluite in una griglia su YEP D, terreni solidi contenenti sostanze chimiche e controllo del veicolo. Incubare le piastre alla temperatura appropriata per 24-48 ore dopo l'incubazione.

Ispezionare le piastre e confrontare la sensibilità di mutanti selezionati alla sostanza chimica rispetto alle piastre dell'immagine di controllo BY 47 41 a 24 e 48 ore. Come prima, le immagini seguenti mostrano i risultati della procedura per determinare la concentrazione inibitoria della subina della sostanza chimica. La prima immagine mostra la crescita di una coltura satura BY 4 7 4 1 diluita da uno a 5.000 e placcata su concentrazioni crescenti di cinque fluoro uracile.

La concentrazione di 10 micromolari viene selezionata come dose inibitoria sub-in. Questa immagine mostra la curva di crescita di BY 4, 7, 41 cellule in mezzi liquidi contenenti cinque fluro uracile. Circa quattro volte 10 su quattro cellule sono state depositate in triplicato e concentrazioni crescenti di cinque fluorouracile e densità ottiche sono state misurate ogni 10 minuti per 22 ore.

Ancora una volta, si può vedere che la dose di 10 micromolari è la dose inibitoria della subina. Queste immagini successive mostrano i risultati di un verde di genetica chimica di cinque fluoro uracile. Qui, viene mostrato un array mutante di delezione di S sachar visier replicato su agar YPD contenente 10 micromolari di cinque uracile Fluor a destra e il controllo DMSO a sinistra.

Questo grafico mostra i risultati della genetica chimica verde, la crescita relativa dei mutanti su 10 micromolari. Cinque uracile fluorescenti rispetto al controllo DMSO sono ordinati in base alla posizione del raggio. La crescita relativa dei mutanti su uracile 10 micromolari e cinque flora rispetto al controllo DMSO è ordinata in base al rapporto di dimensione della colonia.

Su entrambi i grafici è indicata una soglia di rapporto inferiore a 0,8. Questa immagine finale mostra i risultati di tre saggi di convalida. Diluizioni seriali di diversi ceppi mutanti isolati sono state coltivate con il controllo DMSO a sinistra, 10 micromolari, cinque fluoro UIL al centro e 0,015% di metilmetano sulfonato a destra.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi di lavorare con una copia affidabile dell'array di mutanti di delezione e convalidare i risultati utilizzando una metodologia indipendente come i saggi di spotting del lievito o la dissezione della tetrade del lievito. Questa tecnica fornisce un mezzo efficiente per gli scienziati nel campo della ricerca su piccole molecole per esplorare la modalità d'azione di un composto utilizzando approcci a livello di sistema nel lievito in gemmazione.