Name: Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Scopri un protocollo efficiente per isolare grandi quantità di monociti murini dal midollo osseo, riducendo costi e sacrifici animali nella ricerca cardiovascolare. Questo metodo facilita studi sulla crescita dei vasi collaterali.

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Questo lavoro è stato supportato dal DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft, Fondazione tedesca per la ricerca) SFB 854 (Sonderforschungsbereich, centro di ricerca collaborativa). 
Grazie a Hans-Holger Gärtner, Audiovisuelles Medienzentrum, Otto-von-Guericke University Magdeburg, Magdeburgo, Germania, per il supporto tecnico.

Questo studio è stato condotto con il permesso dello Stato della Sassonia e della Sassonia-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, secondo la sezione 8 della legge tedesca per la protezione degli animali (24D-9168,11-1 / 2008-24). Isolation 1 Cella 1.1 Preparazione di femore e tibia <ol><li> Anestetizzare il mouse utilizzando una concentrazione di isoflurano 5% vaporizzando isoflurano in un contenitore chiuso. Dopo che il mouse ha smesso di muoversi per 3 secondi, eseguire la dislocazione cervicale. </li><li> Disinfettare arti posteriori con etanolo (96%). Togliere la pelle e muscoli e separare le ossa con un bisturi sterile. <ol><li> Inizia con una incisione cutanea inguinale, ed estendere l&#39;incisione verso il malleolo mediale ed eseguire una dissezione circolare della pelle intorno al polpaccio inferiore. Togliere la pelle delle gambe completamente peeling prossimale. </li><li> Staccare il muscolo quadricipite dal femore con un bisturi affilato, rimuovere entrambi i peroneo anterioreei gruppi muscolo gastrocnemio e disarticolare la gamba alla articolazione dell&#39;anca individuando e dissezione dei legamenti. </li><li> Inizia anteriormente e procedere intorno all&#39;articolazione ruotando con cura la gamba e sezionare i legamenti, disarticolare quindi l&#39;articolazione. </li></ol></li><li> Lavare femore e tibia con etanolo al 96% per un minimo di 90 sec per garantire preparazione cellulare asettica. Continua il processo di lavaggio con PBS sterile per risciacquare l&#39;etanolo residuo. Nota: Tutti i passi successivi devono essere sterile per evitare contaminazioni. </li></ol> 1.2 La raccolta di midollo osseo <ol><li> Tagliare l&#39;estremità prossimale e distale di ciascun osso con un paio di forbici sottili per accedere agli alberi femorale e tibiale. Fate attenzione con questo passo, dal momento che queste ossa si rompono molto facilmente. </li><li> Lavare le ossa con supporto caldo (M199 + 10% di siero fetale bovino (FCS), + 1% penicillina / streptomicina). Utilizzare un ago sterile 28-G, una siringa da 1 ml, e tra 10-15 ml di mezzo perosso per il risciacquo. </li><li> Tenere l&#39;osso con una pinza sottile e risciacquare uno per uno fino a quando non diventa semi-trasparente. Applicare con attenzione la pressione all&#39;estremità dello stantuffo della siringa in modo da minimizzare lo stress cellulare. </li><li> Filtrare il midollo osseo attraverso un 70 micron nylon web e raccogliere il filtrato. Per estrarre la quantità massima di midollo osseo, lavare ripetutamente dalle estremità distali e prossimali. </li><li> Sciacquare il setaccio con PBS e raccogliere il filtrato. Rimuovere con cautela i detriti e conglomerati cellulari di blanda agitazione e pipettaggio. </li></ol> 1.3 Coltivazione <ol><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 10 min a RT. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule con circa 25 ml di terreno. Ripetere una volta. </li><li> Risospendere le cellule in 6 ml di terreno dopo la seconda fase di lavaggio. Mescolare 50 ml di soluzione di cellule con 50 ml di trypan blu. Contare le cellule in una camera di conteggio al microscopio ottico. Calcolare il numero di cells nella soluzione con questa formula: <img alt="Equazione 1" fo:content-width="1.3in" src="/files/ftp_upload/52347/52347eq1.jpg" /></li><li> Seme le cellule su piastre di superficie ultra-bassa fissaggio 6 pozzetti per prevenire l&#39;adesione permanente al fondo della piastra. Utilizzare una concentrazione di 10 6 cellule per ml con fino a 6 ml per pozzetto. </li><li> Supplemento la sospensione con 20 ng / ml M-CSF per promuovere la differenziazione delle cellule. </li><li> Coltivare le cellule per 5 giorni a 37 ° C e 5% di anidride carbonica e di osservare tutti i giorni. </li></ol> 1.4 La raccolta di cellule Nota: Queste procedure devono essere eseguite su ghiaccio. Procedere con o 1.4.1 o 1.4.2 di conseguenza. <ol><li> A questo punto, raccogliere tutta la cultura, tra cui i macrofagi differenziati che aderiranno alla cultura-piastre, anche se sono lastre di superficie ultra-low-attaccamento. <ol><li> Raccolto l&#39;intera cultura delicatamente pipettando e staccare con una soluzione di 4 ° C PBS, 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) e 2 mM EDTA. Ripetere fino a quando le piastre sono chiare di rimanere cellule aderenti - confermano al microscopio in caso di incertezza. </li></ol></li><li> In alternativa, scartare macrofagi aderenti raccogliendo il surnatante con le cellule in sospensione, che contengono prevalentemente monociti. <ol><li> Raccogliere le cellule non aderenti con una soluzione di PBS senza EDTA e 0,5% BSA. Non applicare troppa forza per evitare di spostare leggermente macrofagi aderenti. </li></ol></li></ol> 1.5 FACS-Analysis (Opzionale) Nota: È possibile esaurire la sospensione cellulare di cellule progenitrici essendo soggetti a regimi e CD117 + dall&#39;uso di MACS. Utilizzare protocolli produttore per questa procedura. <ol><li> Raccogliere le cellule in base a uno i punti 1.4.1 e 1.4.2. </li><li> Centrifugare le cellule a 250 xg per 10 min a 4 ° C e ripetere questo passo. </li><li> Risospendere almeno 250.000 cellule in 300 ml di FACS bUffer per sonda. </li><li> Trasferire la soluzione di cellule su un 96-pozzetti-(30 microlitri per pozzetto). </li><li> Centrifugare la sospensione cellulare a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante e aggiungere 25 ml di anticorpi ad ogni pozzetto (diluizione usare produttore). </li><li> Colorare le cellule con anticorpi (seguenti protocolli produttore per fenotipizzazione cellulare dopo passaggi 1.5.1-1.5.6. Marker comunemente usati per l&#39;identificazione dei monociti / macrofagi includono CD11b, F4 / 80 (figura 3), CD115 (figura 2), e Gr- 1. Nota: Per una descrizione più dettagliata delle soluzioni cellulari, si consiglia l&#39;uso di marcatori come CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, e CD192. Caratteristiche cellulari sono stati precedentemente descritti 12. </li><li> Incubare le sonde per 20 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugare le sonde a 250 xg per 5 minuti a 4 ° C e risospendere con 200 microlitri di tampone FACS. Ripetere thè un passo due volte. </li><li> Trasferire le sonde in tubi FACS ed eseguire l&#39;analisi FACS 12. </li><li> Eseguire analisi FACS 12 al giorno 0, 3 e 5 per analizzare la differenziazione cellulare. </li></ol> 2. Tail Vein Injection 2.1 Preparazione <ol><li> Riscaldare gli animali su una piastra riscaldante a 37 ° C per circa 10 min. Osservare gli animali, mentre il riscaldamento a riconoscere i segni di surriscaldamento. </li><li> Risospendere i monociti, isolati in passaggi 1.1- 1.4, in 150 ml di NaCl, e caricare le cellule in una siringa da 1 ml di insulina con un ago 30G. Leggermente agitare la soluzione prima di caricare la siringa per assicurare tutti i monociti vengono iniettati. Maneggiare sempre le cellule in ghiaccio per evitare l&#39;attaccamento calore mediata e l&#39;attivazione dei monociti. </li></ol> 2.2 Trattenere <ol><li> Evitare di disturbare gli altri topi in gabbia quando si sceglie un mouse per iniezione endovenosa. </li><li> Posizionare il mouse il limitatore. Evitare troppo prEssure e stare attenti con gli arti posteriori. (Figura 4) Nota: In alternativa, utilizzare l&#39;anestesia generale per garantire stress accudimento degli animali. </li><li> Assicurarsi che il mouse ha spazio per respirare prima di chiudere il limitatore. </li></ol> 2.3 Iniezione <ol><li> Disinfettare il sito di iniezione con disinfettante. Spruzzare sulla coda del mouse e lasciate riposare per almeno 1 min. </li><li> Interrompere il flusso di sangue venoso della coda, applicando una leggera pressione sul lato coda laterale sopra il sito di iniezione, per una migliore visibilità delle vene. </li><li> Girare la coda di 90 gradi, prima dell&#39;iniezione. (Figura 5) </li><li> Iniettare un angolo di 45 gradi. Iniettare lentamente e non più di 5 ml per g di evitare gli animali danneggiare. </li><li> Se c&#39;è una bolla, che è un segno di una iniezione fallito, interrompere immediatamente e ripetere l&#39;iniezione più prossimale. </li><li> Fermare l&#39;emorragia sul lato iniezione applicando dolce pressione per circa 1 min. </li><li> Al termine della procedura, aprire riavvolgitore e posizionare il mouse nella gabbia. </li><li> Osservare il mouse per 20 minuti al fine di garantire che l&#39;animale non è stato danneggiato da iniezione e decubito sternale è mantenuta. Estendere il tempo di osservazione fino a quando il mouse riprende conoscenza sufficiente. Ritorna il mouse per la compagnia di altri animali solo dopo che ha pienamente recuperato. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Descriviamo un metodo semplice e conveniente per isolare grandi quantità di monociti murini da midollo osseo. In confronto ad altri protocolli che utilizzano sangue periferico, che ottengono rendimenti monociti 5 su 1.4 x10 6, siamo in grado di ottenere rendimenti più elevati di 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monociti da un singolo mouse donatore. Quando si considera sfide con questo metodo, è importante ricordare la possibilità di contaminazione quando si l...

L'isolamento dei monociti è importante e critico per molti studi in vitro e in vivo. Queste cellule sono bersagli di malattie come l'arteriopatia periferica, la malattia coronarica o altre malattie ischemiche, poiché la crescita dei vasi collaterali è fortemente guidata dall'infiammazione locale. Le risposte infiammatorie comprendono l'attivazione endoteliale e il reclutamento locale di leucociti, principalmente monociti, che poi maturano in macrofagi e creano un ambiente altamente arteriogenico secernendo molteplici fattori di crescita per indurre il rimodellamento di un'arteriola in un'arteria collaterale funzionale1-3. I monociti maturano anche in cellule dendritiche, che vengono spesso utilizzate per studi immunologici4,5 e ricerca sul cancro6,7.
Problematico nell'approccio per l'isolamento dei monociti dal sangue periferico8 è l'alto numero di animali donatori necessari per produrre una quantità sufficiente di monociti per la maggior parte delle analisi. I protocolli precedenti descrivono metodi come la centrifugazione in gradiente di densità e la deplezione cellulare tramite MACS9 durante l'isolamento dei monociti; Tuttavia, queste tecniche possono alterare le caratteristiche e la funzionalità dei monociti, il che può portare a difficoltà di interpretazione10,11. Inoltre, questi metodi sono difficili e possono ridurre la riproducibilità sperimentale.
Il nostro obiettivo con questo protocollo è fornire un metodo semplice ed economico per generare grandi quantità di monociti derivati dal midollo osseo. Grazie all'elevata resa cellulare di 11 x 106 ± 3 x 106 cellule ottenute da questo protocollo, possiamo ridurre sostanzialmente il numero di topi necessari durante l'isolamento dei monociti derivati dal midollo osseo. La procedura può essere completata in un lasso di tempo minimo e senza utilizzare tecniche costose e complicate come indicato sopra. Qui, estraiamo i monociti dalla sospensione nativa del midollo osseo di topi donatori, coltiviamo la sospensione su piastre di attacco ultrabasse e integriamo la soluzione con 20 ng/ml di M-CFS. Il 5° giorno di incubazione, le cellule vengono raccolte e caratterizzate per confermare le proprietà funzionali e fenotipiche.
Per gli esperimenti nel campo dell'arteriogenesi, il trapianto endovenoso di questi monociti derivati dal midollo osseo nei topi è un metodo efficace di somministrazione sistemica di farmaci, che può essere combinato con la legatura dell'arteria femorale nei comuni modelli di arteriopatia periferica.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 6 pozzetti con attacco ultra basso</td><td>Corning Incorporated, NY, USA</td><td></td><td>Piastra a 6 pozzetti con attacco ultra basso, con tappo, sterile</td></tr><tr><td>di età compresa tra 8 e 12 settimane, maschio, topi balb/c&nbsp;</td><td>Charles River, Sulzfeld, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colorazione blu a cellule morte</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>GE Healthcare, Friburgo, Germania</td><td></td><td>Frazione V, pH 7.0</td></tr><tr><td>Canules</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germania</td><td></td><td>28G, 30G</td></tr><tr><td>CD115</td><td>eBioscience, San Diego, Stati Uniti</td><td>12-1152</td><td></td></tr><tr><td>CD11b</td><td>eBioscience, San Diego, Stati Uniti</td><td>53-0112</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td>Con tappo, steril</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germania</td><td></td><td>Allegra&reg; Centrifuga X-15R</td></tr><tr><td>Crema depilatoria</td><td>Veet, Mannheim, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente disinfettante</td><td>Sch&uuml; lke& Mayr GmbH, Norderstedt, Germania</td><td></td><td>Kodan Tinktur forte</td></tr><tr><td>Bisturi monouso n. 10</td><td>Feather rasoio di sicurezza Co.Ltd, Osaka, Giappone&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 96%</td><td>Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbr&uuml; cken, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unità di estrazione Pipetus</td><td>Hirschmann Laborger&auml; te GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>AbD Serotec, D&uuml; sseldorf, Germania</td><td>MCA497APC</td><td></td></tr><tr><td>tampone FACS&nbsp;</td><td>Prodotto dal nostro gruppo con singoli componenti</td><td></td><td>PBS, 0,5% BSA, 0,1% NaN3</td></tr><tr><td>FACS dispositivo</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td>tubi BD FACS Canto II</td></tr><tr><td>FACS&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; pipetta</td><td>Becton Dickenson Labware, NY, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Sigma Aldrich, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Rubis, Stabio, Svizzera</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti</td><td>R&ouml; sner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gr1</td><td>eBioscience, San Diego, USA</td><td>53-5931</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante&nbsp;</td><td>Labotect GmbH, G&ouml; ttingen, Germania&nbsp;</td><td></td><td>Piastra riscaldante 062</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germania</td><td></td><td>Incu safe</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter Deutschland GmbH, Unterschlei&szlig; heim, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germania</td><td></td><td>Axiovert 40 &deg; C</td></tr><tr><td>Fattore stimolante la colonia di macrofagi</td><td>Sigma Aldrich, Amburgo, Germania<</td><td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/srp3110?lang=de&amp; region=DE">SRP3110&nbsp; </a></td><td></td></tr><tr><td>Agitatore meccanico</td><td>IKA, Staufen, Germania</td><td></td><td>ms2 minishaker</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria</td><td></td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Microprovette</td><td>Eppendorf AG, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banco di lavoro microbiologico</td><td>Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germania</td><td></td><td>Tampone</td></tr><tr><td>di lavaggio monociti sicuro per Hera&nbsp;</td><td>Prodotto dal nostro gruppo con componenti</td><td></td> singoli <td>PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA</td></tr><tr><td>Dispositivo di ritenuta per topi</td><td>Vari</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Berlin Chemie AG, Berlino, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3 (acido di sodio)</td><td>Sigma Aldrich, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera di conteggio Neubauer</td><td>Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-K&ouml; nigshofen, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Setaccio cellulare in nylon</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA</td><td></td><td>Filtro cellulare, 70 & micro; m dimensione della maglia</td></tr><tr><td>Penicillina/streptomicina</td><td>Sigma Aldrich, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Life technologies GmbH, Darmstadt, Germania</td><td></td><td>pH 7,4, sterile</td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf AG, Amburgo, Germania</td><td></td><td>10&micro; l/100&micro; l/200&micro; l/1.000&micro; l</td></tr><tr><td>Teste di pipettaggio</td><td>Eppendorf AG, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td>Cellstar 5 ml, 10 ml</td></tr><tr><td>Unità di aspirazione</td><td>Integra bioscience, Fernwald, Germania</td><td></td><td>Vacusafe comfort</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germania</td><td></td><td>1 ml Omnifix&reg; -F siringa per insulina</td></tr><tr><td>Tubi con tappo</td><td>Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germania</td><td></td><td>15 ml/50 ml Tubi Cellstar</td></tr><tr><td>Bagno di acqua calda</td><td>Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germania</td><td></td><td>Julabo SW22</td></tr></tbody></table>

isolamento e iniezione endovenosa di murine derivate dal midollo osseo monociti

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Come sottotipo di leucociti e progenitori dei macrofagi, i monociti sono coinvolti in molti processi importanti degli organismi e sono spesso oggetto di vari campi della scienza biomedica. Il metodo descritto di seguito è un modo semplice ed efficace per isolare i monociti murini dal midollo osseo eterogeneo.
Il midollo osseo del femore e della tibia dei topi Balb/c viene prelevato mediante lavaggio con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). La sospensione cellulare è integrata con fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) e coltivata su superfici di attacco ultra-basse per evitare la differenziazione dei monociti innescata dall'adesione. Le proprietà e la differenziazione dei monociti sono caratterizzate a vari intervalli. Per la fenotipizzazione viene utilizzata la selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS), con marcatori come CD11b, CD115 e F4/80. Al termine della coltivazione, la sospensione è costituita per il 45%± per il 12% da monociti. Rimuovendo i macrofagi adesivi, la purezza può essere aumentata fino all'86%± al 6%. Dopo l'isolamento, i monociti possono essere utilizzati in vari modi e uno dei metodi più efficaci e comuni per la somministrazione in vivo è l'iniezione endovenosa della vena caudale. 
Questa tecnica di isolamento e applicazione è importante per gli studi su modelli murini, specialmente nei campi dell'infiammazione o dell'immunologia. I monociti possono anche essere utilizzati terapeuticamente in modelli murini di malattia.

La soluzione di cellule estratte dal midollo osseo murino costituito da vari tipi di cellule. I principali tipi di cellule sono linfociti, granulociti e monociti. Le cellule possono essere stimati in base alle dimensioni e granularità, che è mostrato in Figura 1 per entrambe le sospensioni nativi e cellule raccolte dopo 5 giorni di differenziazione. Si noti la composizione cellulare spostamento durante la coltivazione. Tuttavia, la classificazione accurata delle popolazioni deve poter contare su espress...

Qui presentiamo un protocollo che genera grandi quantità di monociti murini da midollo osseo eterogeneo per applicazioni traduzionali. Rispetto ad altri, questo nuovo metodo aiuta a ridurre il numero di animali sacrificati e abbassa i costi evitando metodi costosi come la separazione cellulare magnetica ad alto gradiente (MACS).

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Ciao, mi chiamo Helen Kuster e lavoro nel gruppo di ricerca cardiovascolare del dottor Harold e come professore all'Università Auto Vica di MacBook. Siamo interessati all'isolamento e caratterizzazione di monociti marini al fine di utilizzarli come veicoli nella crescita di vasi collaterali. I seguenti passaggi principali sono necessari per la coltivazione di monociti derivati dal midollo osseo: primo, anestesia del topo e dislocazione cervicale; secondo, estrazione e risciacquo del femore.Terza filtrazione del midollo osseo. Quarto e quinto passaggio di lavaggio con mezzo, sesto coltura delle cellule in piastre a adesione ultrabassa. Sesta citometria a flusso.Per estrarre i monociti dal midollo osseo, il topo verrà anestetizzato utilizzando ISO fluorina ed eutanasizzato mediante dislocazione cervicale. Il topo verrà fissato e entrambi gli arti inferiori saranno separati con un bisturi sterile. Verranno quindi prelevati entrambi il femore e la tibia e lavati con etanolo al 96% per un minimo di 90 secondi.Dopo questo, tutti i passaggi devono essere rigorosamente sterili per evitare contaminazioni. I muscoli o i tendini verranno rimossi dall'osso. Femore e tibia vengono risciacquati con PBS caldo più volte.Per il prelievo del midollo osseo, le estremità prossimale e distale di ciascun osso vengono tagliate con un paio di forbici fini. Per risciacquare l'osso, occorre un ago da 28 G per steroidi, una siringa da un millilitro e da 10 a 15 millilitri di mezzo per osso. Successivamente, il midollo osseo viene filtrato attraverso un filtro da 70 micrometri S, tenendo l'osso con una pinzetta fine.Sciacquare le ossa una alla volta finché non diventano traslucide. Per minimizzare lo stress cellulare, applicare con attenzione pressione sullo stantuffo della siringa. Sciacquare il set con PBS.Successivamente, le cellule vengono centrifugate a 250 G per 10 minuti a temperatura ambiente. E vengono risospese nuovamente nel mezzo? Dopo questo passaggio, ripetere nuovamente il passaggio.Per i monociti derivati dal midollo osseo ottenuti dal midollo osseo nativo, utilizziamo M 199 con 1% di penicillina e streptomicina e 10% di siero fetale bovino. Inoltre, aggiungiamo 20 nanogrammi per millilitro di INE MCSF nel primo giorno. Otto nanogrammi per millilitro di interferone gamma vengono aggiunti nell'ultimo giorno di coltura al mezzo.Se si desidera un'upregolazione dell'MHC di classe II, le cellule vengono seminate in piastre con attaccamento ultra-basso e pozzetti profondi per impedire l'adesione permanente al fondo. Utilizziamo una concentrazione di 1 × 10⁶ cellule per millilitro con un volume fino a 6 mL per pozzetto. Il periodo di coltura è di cinque giorni a una temperatura di 37 °C e 5% di anidride carbonica.Le cellule vengono controllate quotidianamente dopo cinque giorni, quando dal 60 all'80% delle cellule sono monociti. Mi chiamo Martin Bachner e sono uno studente in medicina presso l'Auto Fungi University, Dipartimento di Cardiologia, Anologia e Cronologia. Quando si esegue l'iniezione endovenosa, è importante esercitarsi molto prima di praticarla, altrimenti non si sarà in grado di somministrare i monociti in modo adeguato.Gli esperimenti hanno dimostrato che i monociti sono più efficaci nel migliorare l'agenesia arteriosa quando somministrati per via sistemica. Un metodo comune di somministrazione sistemica del farmaco è l'iniezione nella coda. Nel nostro caso, iniettiamo 2,5 milioni di monociti, che vengono sospesi nuovamente in cloruro di sodio.Nella coda dell'arteria del topo sono presenti quattro vasi sul lato ventrale e dorsale e due vene sul lato laterale. Pertanto, per l'iniezione in vena caudale, è necessario ruotare la coda di circa 90 gradi. Per facilitare la procedura, il topo deve essere riscaldato utilizzando un tappetino riscaldante per circa 10 minuti.Gli animali devono essere osservati riscaldandoli. Questo è importante per riconoscere i segni di surriscaldamento. Inoltre, abbiamo bisogno di questo agente infettivo e di un ago da 30 gene montato su una siringa per insulina da un millilitro.Fissare attentamente l'animale in un dispositivo di contenimento, il che rende molto più facile effettuare l'iniezione nella coda. Assicurarsi che il topo abbia spazio sufficiente per respirare prima di caricare la soluzione nella siringa. Vortexare la soluzione di monociti per garantire che tutti i monociti possano essere iniettati.Disinfetta il sito di iniezione per evitare infezioni, prendi la coda tra il pollice e l'indice. Nel punto più distale, l'ago viene inserito con un angolo piatto. Se posizionato nella vena, è molto facile iniettare la soluzione di monociti.Se si forma una vescica, è un segno di iniezione errata. È necessario interrompere immediatamente e riprovare. Prossimale, cercare sempre di iniettare lentamente e non più di cinque microlitri per grammo.Se l'iniezione ha avuto successo, arrestare l'emorragia nel sito di iniezione applicando una leggera pressione per circa un minuto. Al termine della procedura, aprire il retrattore e posizionare il topo nella sua gabbia per caratterizzare i monociti. Utilizziamo gli anticorpi con una combinazione di antigeni, ovvero CD 11 B, F quattro 80, CD 115 e GL uno.L'espressione di questi antigeni è correlata a uno stadio di sviluppo utile per l'analisi dei monociti. Abbiamo raccolto i dati al giorno 0, 3, 5 e 7; la purezza dei monociti aumenta fino al 90% al giorno 5. Per raggiungere tale purezza, è fondamentale eseguire un'efficiente deplezione dei macrofagi tissutali.Le cellule terrine vengono eliminate utilizzando un buffer di lavaggio senza EDTA. Per depletare le cellule terrine, utilizziamo un buffer di lavaggio contenente EDTA e pipettaggio delicato. Questo diagramma mostra i principali tipi cellulari per la loro coltura monolayer.I diversi tipi cellulari mostrati sono: uno linfociti, due monociti, tre granulociti, con aumento della purezza dei monociti dopo il quinto giorno. E coltura. Notare il cambiamento nella composizione cellulare durante la coltivazione: la popolazione cellulare comprende uno monociti e due macrofagi.Figura due, cronologia dell'espressione di CD115 durante la differenziazione. Si noti che oltre il 95% di tutte le cellule è positivo per CD115 dopo cinque giorni di differenziazione, indicando che la stragrande maggioranza delle cellule è costituita da monociti o macrofagi. La classificazione può basarsi sulla dimensione cellulare e sulla granulosità, ma i marcatori cellulari specifici sono più affidabili.Figura tre, aumento dell'espressione della maturità dei monociti e dei macrofagi. Marcatore F four 80, giorno cinque, osservare la comparsa di una popolazione con espressione intermedia di F four 80, compatibile con il fenotipo monocitario. Giorno sette, osservare lo spostamento verso destra dell'espressione di F four 80, compatibile con la maturazione dei macrofagi.L'isolamento dei monociti è importante ed essenziale per molti studi in vitro e in vivo. Queste cellule rappresentano un bersaglio interessante, ad esempio, in relazione a malattie come la malattia arteriosa periferica o la cardiopatia coronarica, che sono associate all'ischemia. Il midollo osseo proveniente da femore e tibia di topi da biopsia viene raccolto lavando le ossa con mezzo caldo; la sospensione cellulare viene integrata con M-CSF e coltivata su superfici a bassissimo attaccamento per evitare la differenziazione indotta dall'adesione dei monociti. Le proprietà e la differenziazione dei monociti vengono verificate in diversi momenti e fasi mediante marcatori come CD11b, CD115 e FO80, utilizzati per definire il fenotipo delle cellule.Se si desidera una somministrazione sistemica del farmaco, l'iniezione endovenosa rappresenta un metodo semplice ed efficace. Abbiamo descritto il metodo per isolare grandi quantità di monociti MI dal midollo osseo in modo semplice ed economico. Con questo nuovo metodo, siamo in grado di generare circa 11 milioni di monociti per topo.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Il trapianto di midollo osseo fornisce un modo per modificare il genotipo delle cellule del midollo osseo derivate. Se il gene di interesse viene espresso in cellule di midollo osseo sia derivati ​​e non le cellule del midollo osseo derivate, trapianto di midollo osseo può modificare le cellule del midollo osseo derivate da un genotipo diverso senza cambiare la non-genotipo delle cellule del midollo osseo derivate.

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

In questo video, dimostriamo l'attivazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo in risposta al lipopolisaccaride batterico e all'immunoglobulina per via endovenosa.

Attivazione di macrofagi derivati dal midollo osseo di topo in risposta agli anticorpi

Si descrive un protocollo per l'isolamento e la purificazione di neutrofili dal midollo osseo di topo per centrifugazione in gradiente di densità e di etichettatura neutrofili utilizzando coloranti CellTracker. Questo rappresenta un metodo semplice e veloce, riproducibile ed economico per ottenere un gran numero di neutrofili per studi funzionali a valle o di trasferimento ed inseguimento esperimenti adottive.

Isolamento, la purificazione e della dicitura del mouse Bone Marrow neutrofili per studi funzionali ed Esperienze trasferimento adottivo

I monociti sono mediatori importanti di arteriogenesi nel contesto della malattia arteriosa periferica. Utilizzando una matrice del tipo di membrana basale e la microscopia intravital, questo protocollo indaga l'angiogenesi di homing e tumore-relativa del monocito dopo l'iniezione del monocito nel modello murino di legatura dell'arteria femorale.

Microscopia intravital del monocito Homing e l'angiogenesi tumore-relativa in un modello murino della malattia arteriosa periferica

Monocito-derivate DC (MoDC) può percepire la minor quantità di molecole associate al pericolo e sono pertanto facilmente innescato. Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di MoDC da sangue e tumori e la loro attivazione con complessi immuni evidenziando le principali precauzioni che dovrebbero essere considerate al fine di evitare loro attivazione prematura.

Protocollo di isolamento del Mouse cellule dentritiche monocito-derivate e loro attivazione successiva In Vitro con tumore immunocomplessi

Questo protocollo è stato stabilito per coltivare macrofagi murini primari carenti di tetraidrobiopterina (BH4) e ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) per studiare la biologia no-redox. Lo studio si concentra sulla riduzione della potenziale contaminazione di BH4 e di altri artefatti trovati nei metodi tradizionali di isolamento e coltura che possono confondere i risultati sperimentali e l'interpretazione dei risultati.

Isolamento e coltura in vitro di macrofagi derivati dal midollo osseo per lo studio della biologia NO-Redox

Qui, presentiamo un metodo economico ed efficiente per isolare e generare cellule dendritiche derivate dal midollo osseo ad alta purezza dai topi dopo 7 giorni di coltura con 10 ng / mL GM-CSF / IL-4.

Protocollo economico ed efficiente per l'isolamento e la coltura di cellule dendritiche derivate dal midollo osseo da topi

Il presente protocollo descrive l'isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.

Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi

Questo protocollo descrive l'iniezione intrafemorale di alcune cellule staminali ematopoietiche o leucemiche, comprese le cellule geneticamente modificate, in modelli murini di xenotrapianto, che consentiranno non solo il trapianto rapido e sicuro di cellule, ma anche analisi seriali del midollo osseo.

Le iniezioni intrafemorali semplificate con topi vivi consentono un'analisi continua del midollo osseo

Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

Scopri un protocollo efficiente per isolare grandi quantità di monociti murini dal midollo osseo, riducendo costi e sacrifici animali nella ricerca cardiovascolare. Questo metodo facilita studi sulla crescita dei vasi collaterali.

Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

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