Isolamento e iniezione endovenosa di Murine derivate dal midollo osseo monociti

Ciao, mi chiamo Helen Kuster e lavoro presso il gruppo di ricerca cardiovascolare del Dr.Harold e professore presso l'Auto Vica University in MacBook. Siamo interessati alla caratterizzazione dell'isolamento di monociti marini al fine di utilizzarli per veicoli nella crescita di vasi collaterali. I seguenti passaggi principali sono necessari per la coltivazione di monociti derivati dal midollo osseo, prima anestesia murina e lussazione cervicale, seconda estrazione e risciacquo del femore.

Terzo filtraggio del midollo osseo. Quarta alle fasi di lavaggio con quinta media, coltivazione delle cellule su piastre di attacco ultrabasse. Sesta citometria a flusso.

Al fine di estrarre i monociti dal midollo osseo, il topo sarà anestetizzato utilizzando fluoro ISO e soppresso mediante lussazione cervicale. Il topo sarà fissato ed entrambi gli arti inferiori saranno separati con un bisturi steroideo. Sia il femore che la tibia sono stati raccolti e lavati con etanolo al 96% di ethan per un minimo di 90 secondi.

Dopodiché, tutti i passaggi devono essere rigorosamente sterili per evitare contaminazioni. I muscoli o i tendini verranno rimossi dall'osso. Femore e tibia vengono risciacquati più volte con PBS caldo.

Per il prelievo del midollo osseo, le estremità prossimale e distale di ciascun osso vengono tagliate con un paio di forbici sottili. Per sciacquare l'osso, abbiamo bisogno di un ago steroideo da 28 G, una siringa da un millilitro e tra 10 e 15 millilitri di terreno per osso. Successivamente il midollo osseo viene filtrato attraverso una S di 70 micrometri tenendo l'osso con una pinza fine.

Sciacquare le ossa una per una fino a quando non diventano illuse. Per ridurre al minimo lo stress cellulare, applicare con cautela pressione sul timbro della siringa. Sciacquare il setaccio con PBS.

Successivamente, le celle vengono centrifugate a 250 G per 10 minuti a temperatura ambiente. E i reus sono sospesi con il mezzo? Dopo questo passaggio, ripetere nuovamente il passaggio.

Per i monociti derivati dal midollo osseo nativo, utilizziamo M 199 con l'1% di penicillina e streptomicina e il 10% di siero per la tosse fetale. Inoltre, il primo giorno aggiungiamo 20 nanogrammi per millilitro di INE MCSF. Otto nanogrammi per millilitro di interfer gamma vengono aggiunti l'ultimo giorno di coltura al terreno.

Se si desidera una sovraregolazione MHC due, le cellule vengono seminate in piastre di attacco ultra-basse con pozzetti spessi per prevenire l'adesione permanente sul fondo. Usiamo una concentrazione di una volta da 10 a sei cellule per millilitro con un massimo di sei millilitri per pozzetto. Il periodo di coltivazione è di cinque giorni a una temperatura di 37 gradi e 5% di anidride carbonica.

Le cellule vengono controllate quotidianamente dopo cinque giorni, tra il 60 e l'80% delle cellule sono monociti. Mi chiamo Martin Bachner e sono uno studente di medicina qui alla Auto Fungi University presso il Dipartimento di Cardiologia, Anologia e Cronologia. E quando si fa l'iniezione endovenosa, è importante fare molta pratica prima di farlo perché altrimenti non si sarà in grado di applicare i monociti in modo adeguato.

Gli esperimenti hanno dimostrato che i monociti sono più efficaci nel migliorare l'agenesia dell'arte se applicati per via sistemica. Un modo comune di applicazione sistemica del farmaco è un'iniezione di WA nella coda. Nel nostro caso, iniettiamo 2,5 milioni di monociti, che vengono risospesi e cloruro di sodio.

Ci sono quattro vasi nella coda delle arterie del topo sul lato ventrale e dorsale e due cali sul lato laterale. Quindi, per l'iniezione WA, dobbiamo girare la coda di circa 90 gradi. Per una procedura più semplice, il mouse deve essere riscaldato utilizzando un termoforo per circa 10 minuti.

Gli animali dovrebbero essere osservati riscaldandosi. Questo è importante per riconoscere i segni di surriscaldamento. Inoltre, abbiamo bisogno di questo agente infettivo e di un ago da 30 geni posizionato su una siringa da insulina da un millilitro.

Fissa con cura l'animale in un sistema di contenzione, che rende molto più facile l'iniezione nella coda. Assicurarsi che il topo abbia abbastanza spazio per respirare prima di caricare la soluzione nella siringa. Vortex, la soluzione di monociti per assicurarsi che tutti i monociti possano essere iniettati.

Disinfetta il sito di iniezione per evitare l'infezione, prendi la coda tra il tonfo e l'indice. Nel punto più distale, l'ago viene inserito ad angolo piatto. Se viene inserito nella vena, è molto facile iniettare la soluzione di monociti.

Se c'è una vescica, è un segno di un'iniezione sbagliata. Dovresti fermarti immediatamente e provare di più. Prossimale, cerca sempre di iniettare lentamente e non più di cinque microlitri per grammo.

Se l'iniezione ha avuto successo, fermare l'emorragia nel sito di iniezione applicando una leggera pressione per circa un minuto. Al termine della procedura, aprire il divaricatore e posizionare il topo nella sua gabbia per caratterizzare i monociti. Usiamo gli effetti con una combinazione di antigeni, vale a dire CD 11 B, F four 80, CD 115 e GL one.

L'espressione di questi antigeni è correlata a uno stadio di sviluppo per l'analisi dei monociti. Abbiamo fatto i fatti il giorno 0, 3, 5 e sette, la purezza dei monociti aumenta fino al 90% il quinto giorno. Per ottenere tale purezza, è importante esaurire fortemente il macrofago terrino.

Le cellule non terrine vengono esaurite utilizzando un tampone di lavaggio privo di EDTA. Per esaurire le cellule della terrina, stiamo usando EDTA contenente lavaggio, tampone e p petting delicato. Questo diagramma mostra i principali tipi di cellule per la loro coltura a un'estremità.

I diversi tipi di cellule mostrati sono un linfocita, due monociti, tre granulociti, aumentando la purezza dei monociti dopo il quinto giorno. E cultura. Si noti che la composizione cellulare mutevole durante la coltura della popolazione cellulare include un monocita e due macrofagi.

Figura due, cronologia dell'espressione di CD 115 durante la differenziazione. Si noti che oltre il 95% di tutte le cellule sono positive al CD 115 dopo cinque giorni di differenziazione, indicando che la stragrande maggioranza delle cellule sono monociti o macrofagi. La classificazione può essere basata sulle dimensioni e sulla granularità delle cellule, ma i marcatori cellulari specifici sono più affidabili.

Figura tre, aumento dell'espressione della maturità dei macrofagi monociti. Il marcatore F quattro 80, quinto giorno, nota la comparsa di una popolazione con espressione intermedia F quattro 80, che è coerente con il fenotipo dei monociti. Settimo giorno, notare lo spostamento a destra dell'espressione F 4 80 coerente con la maturazione dei macrofagi.

L'isolamento dei monociti è importante ed è essenziale per molti studi in vitro e in vivo. Queste cellule sono un bersaglio interessante, ad esempio, in relazione a malattie come l'arteriopatia periferica o la malattia coronarica, che sono correlate all'ischemia. Il midollo osseo da FEMA e tibia di topi da biopsia viene raccolto lavando le ossa con una sospensione di cellule medie calde, viene integrato con MCSF e coltivato su superfici di attacco ultra basse per evitare l'adesione, la differenziazione innescata dall'adesione Le proprietà dei monociti e la differenziazione dei monociti vengono controllate in tempi diversi e fatti con marcatori come CD 11 b, CD 115 e FO 80 vengono utilizzati per fenotipizzare le cellule.

Se si desidera la somministrazione sistemica di farmaci, l'iniezione endovenosa è un modo semplice ed efficace per farlo. Abbiamo descritto il metodo per isolare grandi quantità di monociti MI dal midollo osseo in modo semplice ed economico. Con questo nuovo metodo, siamo in grado di generare circa 11 milioni di monociti per topo.