Metodi per valutare citotossicità e immunosoppressione di combustibile di tabacco preparati prodotti

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare gli effetti della preparazione di prodotti del tabacco sulla secrezione di citochine e sull'uccisione delle cellule bersaglio da parte delle BMC P. Ciò si ottiene trattando prima le BMC P in coltura con la condizione di fumo intero, terreno o nicotina, quindi viene eseguita la colorazione intracellulare delle BMC p trattate per determinare la loro produzione di citochine. In alternativa, le cellule K 5 62 marcate con CFSE sono in co-coltura con cellule effettrici PBMC trattate con mezzo condizionato a fumo intero e la vitalità delle cellule K 5 62 è qualificata da sette colorazioni A a d.

In definitiva, gli effetti dei preparati di prodotti del tabacco combustibili sui BMC P di entrambi i test sono misurati mediante citometria a flusso. I principali vantaggi delle nostre tecniche o dei metodi esistenti, come il saggio di rilascio del cromo o lo spot ALI, sono che i nostri metodi sono ad alta produttività, non radioattivi e possiamo misurare la funzionalità della cella. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sugli effetti biologici dei preparati a base di prodotti del tabacco.

Può anche essere applicato alla valutazione di altri composti che influenzano le funzioni mediate dal recettore tolike e STIC delle cellule effettrici PBMC Prima di iniziare la procedura di colorazione. Diluire l'intero fumo, il mezzo e la nicotina alle concentrazioni indicate. In RPMI mezzo completo per un volume totale di 100 microlitri per pozzetto in una piastra da 96 pozzetti.

Quindi aggiungere 100 microlitri di P BMC, sospesi in terreno completo a una concentrazione di una volta 10 alle sei cellule per pozzetto per un volume totale di 200 microlitri per pozzetto. Quindi, copri la piastra e incubala a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Dopo tre ore, lavare le cellule e aspirare il surnatante.

Quindi coprire nuovamente la piastra e vorticare per dissociare i pellet. Lavare le celle altre due volte, una volta in un tampone di corsa ghiacciato e una volta in un terreno completo dopo il secondo lavaggio. Trattarli con 200 microlitri per pozzetto di terreno completo integrato con tappo di Golgi e LPS per sei ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Quindi lavare le celle con un tampone di corsa ghiacciato e trattarle con 100 microlitri di cyto fix per pozzetto a quattro gradi Celsius dopo 20 minuti, lavare le celle tre volte con un lavaggio permanente ghiacciato. Quindi aggiungere 45 microlitri di cito permanente a ciascun pozzetto seguiti da cinque microlitri di ciascuno degli anticorpi elencati. Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le cellule tre volte e fissarle in 200 microlitri di ghiaccio freddo, 2% di para formaldeide.

Quindi trasferire le cellule in provette da 12 x 75 millimetri e analizzare i campioni su un citometro a flusso. Dopo aver preparato una piastra di prodotto del tabacco trattato con pbmc come appena dimostrato, lavare una coltura di cellule K 5 62, raccolte all'80% di fluenza di co in 10 millilitri di DPBS. Resus. Sospendi il pellet in cinque millilitri di DPBS e conta le cellule.

Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di lavoro CFSE appena preparata a una o due volte 10 alla settima K 5 62 cellule in un millilitro di terreno completo e disperdere la macchia cellulare mediante vortex. Incubare le cellule a temperatura ambiente dopo esattamente due minuti, aggiungere 200 microlitri di FBS e agitare nuovamente le cellule, incubandole per altri due minuti. Dopo la seconda incubazione, lavare le cellule in 10 millilitri di terreno completo, quindi risospendere il pellet in altri 10 millilitri di terreno completo e contare le cellule.

Centrifugare ora i BMC trattati con tabacco e decantare il surnatante. Quindi riposizionare il coperchio, risospendere le celle mediante vortex e lavarle in 200 microlitri di terreno completo per pozzetto. Per avviare il test di uccisione, aggiungere le cellule K 5 62 marcate con CFSE al pbmc in un rapporto di uno a 15 e incubare la co-coltura a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Dopo cinque ore, centrifugare le cellule e scartare il surnatante. Sospendere i pellet mediante vortice e quindi lavare le celle con 200 microlitri di tampone di funzionamento per pozzetto, quindi aggiungere 95 microlitri di tampone di corsa, seguiti da cinque microlitri di sette A a d per un volume totale di 100 microlitri per pozzetto. Infine, incubare le cellule al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.

Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone di corsa a ciascun pozzetto e trasferire l'intero volume nelle provette fax corrispondenti appropriate per determinare la percentuale di sette celle D e CFSE positive. Mediante analisi citofluorimetrica, si osserva un aumento dose-dipendente della morte cellulare con mezzo condizionato a fumo intero a 24 ore con quasi l'80% delle cellule morte a quattro microgrammi per millilitro di unità di nicotina equina. Tuttavia, il trattamento dei BMC p per sole tre ore non risulta in una tossicità significativa anche a cinque microgrammi per millilitro di unità di nicotina equina di mezzo condizionato a fumo intero a 24 ore.

Un grado comparabile di morte cellulare non si nota prima del trattamento con 3000 microgrammi per millilitro di nicotina dopo tre ore, il trattamento con nicotina non causa la morte cellulare misurabile prima del trattamento con concentrazione di 2000 microgrammi per millilitro con condizione di fumo intero, mezzo e nicotina, seguito dalla stimolazione del recettore quattro TLR da parte di LPS provoca una diminuzione dose-dipendente delle citochine secrete. Sebbene il grado di soppressione vari tra le singole citochine. Inoltre, quando le cellule vengono trattate con LPS e tappo di Golgi per sole sei ore, si osserva una diminuzione del numero di cellule citochine intracellulari positive dopo l'esposizione al mezzo di fumo intero, anche alle concentrazioni di unità di nicotina equina più basse rispetto all'esposizione alla nicotina.

Infatti, i risultati di questo test di uccisione illustrano che l'esposizione a 1,56 microgrammi per millilitro di terreno in condizioni di fumo intero riduce significativamente la capacità di uccisione della popolazione di PBMC effettrice rispetto al controllo e alle concentrazioni di dose più basse. Mentre il trattamento con nicotina ad alte o basse concentrazioni non interferisce con la capacità di uccisione della popolazione PBMC effettrice durante il tentativo di queste procedure. È importante essere precisi con la marcatura CFSE, così come con le diluizioni degli anticorpi, il tempo di marcatura e le temperature di incubazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare le tecniche di marcatura degli anticorpi nella citometria a flusso per determinare gli effetti dei preparati di prodotti del tabacco o di altri trattamenti sulle cellule mononucleate del sangue periferico.