Name: Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Impara la caratterizzazione elettrofisiologica e morfologica dei microcircuiti neuronali in fette acute di cervello utilizzando registrazioni accoppiate di patch-clamp. Questo metodo consente di correlare proprietà strutturali e funzionali dei neuroni.

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Vorremmo ringraziare tutti i membri del Gruppo 'Funzione dei Microcircuiti Neuronali' presso l'Istituto di Neuroscienze e Medicina, INM-2, Centro di Ricerca Jülich e il Gruppo 'Funzione dei Microcircuiti Cortici' presso il Dipartimento di Psichiatria, Psicoterapia e Psicosomatica, Facoltà di Medicina, JARA, RWTH Università di Aquisgrana per le fruttuose discussioni. Questo lavoro è stato supportato dal gruppo di ricerca DFG sulla funzione della corteccia a botte (BaCoFun).

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Registrazioni accoppiati da eccitatorio sinapticamente accoppiati e / o neuroni inibitori sono un approccio molto versatile per lo studio dei microcircuiti neuronali. Non solo questo approccio permette di stimare la connettività sinaptica tra tipi di neuroni, ma permette anche la determinazione delle caratteristiche funzionali della connessione e la morfologia dei neuroni pre- e postsinaptici. Inoltre, agonisti e / o antagonisti possono essere facilmente applicati ai neuroni in fettine. Questo permette di studiare gli e...

Microcircuiti neuronali tra due neuroni sinapticamente accoppiati sono gli elementi costitutivi di reti su larga scala nel cervello e sono le unità fondamentali di elaborazione delle informazioni sinaptica. Un prerequisito per la caratterizzazione di tali microcircuiti neuronali è conoscere la morfologia e le proprietà funzionali di entrambi i neuroni Partner di pre-e post-sinaptici, il tipo di connessione sinaptica (s) e la sua struttura e meccanismo funzionale. Tuttavia, in molti studi di connessioni sinaptiche almeno uno dei neuroni in un microcircuito non è ben caratterizzata. Ciò risulta dai protocolli di stimolazione relativamente non specifici, spesso utilizzate in studi di connettività sinaptica. Pertanto, le proprietà strutturali e funzionali del neurone presinaptico sono o non identificati affatto o solo in misura piuttosto piccola (cioè, l&#39;espressione di proteine ​​marker ecc). Registrazioni appaiati in combinazione con colorazione intracellulare mediante marcatori such come biocitina, neurobiotin o coloranti fluorescenti sono più adatti per lo studio di piccoli microcircuiti neurali. Questa tecnica permette di indagare molti parametri strutturali e funzionali di una connessione sinaptica morfologicamente identificato allo stesso tempo. I cosiddetti «unitario» connessioni monosinaptici tra due neuroni sono stati studiati in entrambe le regioni cerebrali corticali e subcorticali 1-10 su preparazioni fetta acuta. Inizialmente, microelettrodi taglienti sono stati utilizzati in questi esperimenti; successivamente, la registrazione patch clamp è stato impiegato per ottenere registrazioni di segnali sinaptici con un livello di rumore inferiore ed una risoluzione temporale migliorata. Un importante progresso tecnico è stato l&#39;uso di contrasto interferenziale infrarossi (IR-DIC) ottiche 11-14, una tecnica microscopica che ha migliorato notevolmente la visibilità e l&#39;identificazione dei neuroni nella fetta cervello in modo che è diventato possibile to ottenere registrazioni individuate visivamente connessioni sinaptiche 15-17. In generale, le registrazioni coppie sono fatte in fettine acute; solo pochissime pubblicazioni sono disponibili registrazioni segnalazione di neuroni sinapticamente collegati in vivo 18-20. Il vantaggio più importante di registrazioni accoppiati è il fatto che una caratterizzazione funzionale può essere combinato con una analisi morfologica sia la luce e elettroni livello microscopico (vedi ad es., 7,16,21). Dopo l&#39;elaborazione istochimico, la morfologia dendritica e assonale della coppia neurone sinapticamente collegato è tracciata. Successivamente, è possibile quantificare caratteristiche morfologiche quali lunghezza, densità spaziale, orientamento, ramificazione ecc Questi parametri possono quindi fornire una base per una classificazione obiettivo di una connessione sinaptica specifica. Inoltre, contrariamente alla maggior parte altre tecniche utilizzate per lo studio connecti neuronaliVity, abbinato registrazioni consentono anche l&#39;individuazione dei contatti sinaptici per connessioni sinaptiche unitari. Questo può essere fatto direttamente utilizzando una combinazione di luce e di microscopia elettronica 16,21-27 o utilizzando Imaging di calcio 28,29 di spine dendritiche. Tuttavia, con quest&#39;ultimo approccio unico eccitatoria ma non connessioni inibitorie possono essere studiate in quanto richiede flusso di calcio attraverso i canali recettori postsinaptici. Oltre ad un&#39;analisi dettagliata della trasmissione sinaptica ad un microcircuito accoppiato registrazioni neuronali definite anche permettere lo studio di regole di plasticità sinaptica 30,31 o - in combinazione con l&#39;applicazione agonista / antagonista - la modulazione della trasmissione sinaptica da neurotrasmettitori come acetilcolina 32 e adenosina 33.

<table><tbody><tr><td>Amplificatore</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 USB Triple</td><td>con 2 - 3 preamplificatori</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>con 2 porte per fotocamera, un obiettivo 4X e un obiettivo ad immersione in acqua 40X</td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>TILL Photonics</td><td>VX55</td><td>Telecamera CCD a infrarossi</td></tr><tr><td>Workstation</td><td>Luigs & Neumann</td><td>Infrapatch 240</td><td>con tavolino x-y motorizzato e asse di messa a fuoco motorizzato per il microscopio</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>Luigs & Neumann</td><td>SM-5</td><td>x-y-z manipolatori per 2 - 3 preamplificatori gabbia</td></tr><tr><td>di Faraday</td><td>Luigs & Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tavolo antivibrante</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm International</td><td>HM650V</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>HEKA</td><td>Sutter P-97</td><td></td></tr><tr><td>Sistema</td><td>Neurolucida Microbrightfield</td><td></td><td>con i software Neurolucida e Neuroexplorer</td></tr></tbody></table>

elettrofisiologici e morfologica caratterizzazione neuronali microcircuiti in acute fette cervello utilizzando accoppiati di patch-clamp recordings

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

La combinazione di permutazione registrazioni clamp da due (o più) neuroni sinapticamente accoppiati (registrazioni appaiati) in fettine cerebrali acute con simultanea riempimento biocitina intracellulare consente un&#39;analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Con questo metodo è possibile identificare e caratterizzare sia neuroni postsinaptici pre e dalla loro morfologia e modello di risposta elettrofisiologica. Registrazioni accoppiati consentono studiare gli schemi di connettività tra questi neuroni e le proprietà di entrambi trasmissione sinaptica chimica ed elettrica. Qui diamo una descrizione step-by-step le procedure necessarie per ottenere registrazioni affidabili abbinati insieme ad un recupero ottimale della morfologia neurone. Descriveremo come coppie di neuroni collegati tramite sinapsi chimici o giunzioni sono identificati nei preparati fetta cervello. Vi illustrerà come i neuroni vengono ricostruiti per ottenere la loro morfologia 3D del Dendritic e dominio assonale e come contatti sinaptici sono identificati e localizzati. Discuteremo anche le avvertenze e le limitazioni della tecnica di registrazione associato, in particolare quelli associati con troncamenti dendritiche e assonale durante la preparazione di fettine di cervello, perché questi influenzano fortemente le stime di connettività. Tuttavia, a causa della versatilità dell&#39;approccio di registrazione accoppiato rimarrà uno strumento prezioso nel caratterizzare diversi aspetti della trasmissione sinaptica a microcircuiti neuronali identificati nel cervello.

Registrazioni associati sono il metodo di scelta per una caratterizzazione approfondita delle connessioni sinaptiche uniformi o bidirezionali morfologicamente identificati così come giunzione gap collegamenti (elettrici) (Figura 1). Un esempio di una registrazione accoppiato in strato 4 della corteccia somatosensoriale barilotto è mostrato nella Figura 1A. Sia eccitatorio unidirezionale e connessioni sinaptiche inibitorie possono essere caratterizzati (Figura 1B, C). In...

Le registrazioni di patch-clamp e il riempimento simultaneo di biocitina intracellulare di neuroni accoppiati sinapticamente in fette cerebrali acute consentono un'analisi correlata delle loro proprietà strutturali e funzionali. Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere le fasi tecniche essenziali della registrazione elettrofisiologica da microcircuiti neuronali e la loro successiva analisi morfologica.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di dimostrare come le connessioni sinaptiche tra neuroni morfologicamente identificati siano caratterizzate sia funzionalmente che strutturalmente. Ciò si ottiene ottenendo fette cerebrali acute, ottimizzate per lo studio di una particolare connessione sinaptica. Il patch clampaggio viene quindi utilizzato per testare i neuroni accoppiati sinapticamente.Per questo, viene applicato un patch a un singolo neurone post-sinaptico prospettico e viene quindi utilizzata una seconda pipetta per stimolare i neuroni circostanti al fine di stabilire l'esistenza di una connessione sinaptica. Se non si nota alcuna risposta, l'elettrodo stimolante viene spostato. Una volta trovata una connessione, il neurone presinaptico viene riabbinato in modalità all'ingrosso.Dopo le registrazioni elettrofisiologiche di questi neuroni e i riempimenti simultanei di biotina, la fetta viene fissata, elaborata per la biotina e vengono eseguite ricostruzioni 3D assistite da computer dei neuroni. In definitiva, il nostro metodo mira ad un'analisi quantitativa correlata strutturale e funzionale dei microcircuiti neuronali. Il vantaggio principale delle registrazi

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Un approccio multi-angolare per indagare cambiamenti funzionali al circuito ippocampale è spiegato. Tecniche elettrofisiologiche sono descritte con il protocollo infortunio, test comportamentali e metodo di dissezione regionale. La combinazione di queste tecniche possono essere applicate in modo simile ad altre regioni del cervello e domande scientifiche.

Indagini su Alterazioni della funzione del circuito ippocampale seguito lieve trauma cranico

La preparazione di fettine cerebrali acute di ippocampo isolato, così come le registrazioni elettrofisiologiche simultanee di astrociti e neuroni...

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Questo video mostra la procedura per mappare le connessioni sinaptiche fissando una fetta di cervello, posizionando pipette per ottenere configurazioni di cellule intere e stimolando i neuroni presinaptici a registrare le risposte postsinaptiche, chiarendo così la connettività neuronale.

Registrazione accoppiata con patch clamp delle connessioni neuronali in fette cerebrali acute

Reti corticali sono controllati da un piccolo, ma diverso insieme di interneuroni inibitori. Indagine funzionale degli interneuroni richiede quindi la registrazione mirata e l'identificazione rigorosa. Qui descritto è un approccio combinato che coinvolge le registrazioni whole-cell da coppie singole o sinapticamente-accoppiati di neuroni con etichettatura intracellulare, post-hoc analisi morfologica e immunocitochimica.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

I protocolli a circuito chiuso stanno diventando sempre più diffusi nell'elettrofisiologia moderna. Presentiamo un modo semplice, versatile ed economico per eseguire protocolli elettrofisiologici complessi in neuroni piramidali corticali in vitro, utilizzando un computer desktop e una scheda di acquisizione digitale.

Real-time Elettrofisiologia: utilizzando protocolli a circuito chiuso per sonda neuronali Dynamics and Beyond

Questo protocollo viene illustrata l'implementazione di un ottimizzato N-metilico-D-glucamine (NMDG) protezione recupero metodo di preparazione di fetta di cervello. Una formulazione di singolo supporto viene utilizzata per ottenere in modo affidabile fette di cervello sano da animali di tutte le età e per diverse applicazioni sperimentali.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

Questo protocollo descrive passaggi procedurali di base per l'esecuzione di cellule intere registrazioni patch-clamp. Questa tecnica consente di studiare il comportamento elettrico dei neuroni, e quando eseguito in sezioni di cervello, permette di valutare diverse funzioni neuronali da neuroni che sono ancora integrati in circuiti cerebrali relativamente ben conservati.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

La tecnica del patch clamp fetta è un metodo efficace per analizzare i cambiamenti indotti dall'apprendimento nella proprietà intrinseche e plasticità delle sinapsi eccitatorie o inibitorie.

Sezione tecnica del Patch Clamp per l'analisi di plasticità indotta su apprendimento

Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall'immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro .

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Qui, descriviamo i passi essenziali per le registrazioni di cellule intere patch-clamp fatta da neuroni di sostanza gelatinosa (SG) nella fetta di midollo spinale in vitro . Questo metodo consente la proprietà intrinseca della membrana, la trasmissione sinaptica e la caratterizzazione morfologica dei neuroni di SG per essere studiato.

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Impara la caratterizzazione elettrofisiologica e morfologica dei microcircuiti neuronali in fette acute di cervello utilizzando registrazioni accoppiate di patch-clamp. Questo metodo consente di correlare proprietà strutturali e funzionali dei neuroni.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings (Video) | JoVE Journal

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

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