Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di dimostrare come le connessioni sinaptiche tra neuroni morfologicamente identificati siano caratterizzate sia funzionalmente che strutturalmente. Ciò si ottiene ottenendo fette cerebrali acute, ottimizzate per lo studio di una particolare connessione sinaptica. Il patch clampaggio viene quindi utilizzato per testare i neuroni accoppiati sinapticamente.

Per questo, viene applicato un patch a un singolo neurone post-sinaptico prospettico e viene quindi utilizzata una seconda pipetta per stimolare i neuroni circostanti al fine di stabilire l'esistenza di una connessione sinaptica. Se non si nota alcuna risposta, l'elettrodo stimolante viene spostato. Una volta trovata una connessione, il neurone presinaptico viene riabbinato in modalità all'ingrosso.

Dopo le registrazioni elettrofisiologiche di questi neuroni e i riempimenti simultanei di biotina, la fetta viene fissata, elaborata per la biotina e vengono eseguite ricostruzioni 3D assistite da computer dei neuroni. In definitiva, il nostro metodo mira ad un'analisi quantitativa correlata strutturale e funzionale dei microcircuiti neuronali. Il vantaggio principale delle registrazioni accoppiate da neuroni accoppiati sinapticamente è che possiamo eseguire un'analisi strutturale e funzionale correlata di neuroni pre e postsinaptici in microcircuiti neuronali.

Ancora più recentemente, le tecniche introdotte come la stimolazione ottica dei neuroni non sono ancora in grado di raggiungere questo obiettivo con lo stesso dettaglio. Questo metodo consente di studiare le interazioni di eccitazione e inibizione di tipi di neuroni morfologicamente identificati e come l'attività viene modulata. A dimostrare le procedure per le registrazioni degli animali domestici sarà Guan.

Lui che è un postdoc nel mio laboratorio. Dopo aver preparato le fette della regione target, lasciarle incubare durante questo periodo, tirare le pipette patch, che dovrebbero avere un gambo lungo e sottile. Dopo aver fissato una fetta di cervello con un'arpa di platino in una camera sperimentale, riempire una pipetta di registrazione con soluzione interna.

Posizionare la pipetta nel preamplificatore e applicare il patch a un presunto neurone post-sinaptico in modalità cellula intera utilizzando una pipetta di ricerca con resistenza da 8 a 10 mega ohm riempita con una soluzione interna in cui i sali di potassio sono sostituiti da sali di sodio. Applicare una leggera aspirazione alla pipetta di ricerca per applicare un cerotto a un potenziale neurone presinaptico in una cellula sciolta. Configurazione allegata.

Mantenere il potenziale della membrana sotto la guarnizione allentata tra i 30 e i 60 millivolt negativi in modalità pinza amperometrica. Quindi applicare grandi impulsi di corrente da 0,2 a due nano ampere per suscitare un potenziale d'azione nella potenziale cellula presinaptica. Osservare questo potenziale d'azione come un piccolo spicchio sulla risposta di tensione.

Impostare la frequenza di stimolazione su 0,1 hertz per evitare il deperimento della risposta postsinaptica. Se il neurone postsinaptico non risponde alla stimolazione del cerotto di neurone potenzialmente presinaptico testato, un nuovo potenziale neurone presinaptico in modalità sigillo sciolto. Testare fino a 30 neuroni potenzialmente presinaptici in questo modo.

Continuando a utilizzare lo stesso elettrodo patch di ricerca fino a quando è possibile stabilire una tenuta con una resistenza superiore a 30 mega ohm. Se la stimolazione in modalità a tenuta libera produce un EPSP o IPSP con una latenza inferiore a cinque millisecondi nel neurone postsinaptico, rimuovere la pipetta di ricerca dal neurone presinaptico utilizzando un elettrodo patch di registrazione riempito di biotina contenente una soluzione interna regolare con una resistenza da quattro a otto mega ohm. Applicare il patch al neurone presinaptico e registrare in modalità morsetto di corrente dell'intera cellula.

Suscita potenziali d'azione mediante iniezione di corrente nei neuroni presinaptici e registra la risposta postsinaptica. Archiviare i dati in un computer per una successiva analisi offline. Durante la registrazione, la biotina si diffonde nel neurone per ottenere un'adeguata colorazione.

Lasciare che la biotina si diffonda per almeno 15-30 minuti a seconda delle dimensioni del neurone. Per i microcircuiti neuronali con un elevato rapporto di connettività, non viene utilizzato un elettrodo di ricerca. Piuttosto, inizia applicando direttamente un patch a un neurone presinaptico in modalità cellula intera.

Quindi, utilizzando un elettrodo patch riempito con una soluzione interna regolare un potenziale neurone postsinaptico anche in modalità cellula intera, entrambe le cellule dovrebbero essere sotto il controllo del morsetto di corrente. Suscitare un potenziale d'azione nella cellula presinaptica e monitorare il potenziale neurone postsinaptico per un potenziale postsinaptico. Se il neurone non mostra una risposta alla stimolazione presinaptica, utilizzare un nuovo elettrodo per applicare nuovamente un patch a un nuovo neurone in modalità cellula intera.

Quando viene trovata una connessione, procedere con la registrazione come dimostrato in precedenza senza cambiare la pipetta patch. Dopo aver fissato e montato le fette come descritto nel protocollo di testo, esaminare i neuroni marcati con biotina al microscopio ottico. Assicurarsi che i manganelli assonali e le spine dendritiche siano chiaramente visibili.

Utilizzando un sistema di tracciamento dei neuroni commerciale, è possibile tracciare manualmente i neuroni o le coppie di neuroni accoppiati sinapticamente. Assicurati di includere anche piccoli collaterali assonali o dendritici. Utilizzare le tracce per ottenere ricostruzioni neuronali 3D, correggere le ricostruzioni neuronali per il restringimento in tutte e tre le dimensioni spaziali nella sezione appropriata del programma di tracciamento.

I fattori di correzione del restringimento per il mezzo di inclusione sono circa 1,1 per le direzioni x e y e circa 2,1 per la direzione Z. Una coppia di cellule reciprocamente accoppiate composta da uno stellato spinoso e da un rapido picco nel neurone. Nel quarto strato corticale sono stati riempiti di biotina.

Durante la registrazione, i punti verdi indicano i contatti sinaptici eccitatori putativi tra il neurone spinoso pre-sinaptico e l'interneurone post-sinaptico. I punti blu indicano i contatti sinaptici inibitori reciproci putativi. Qui sono mostrate immagini ad alta potenza dei contatti sinaptici.

I cerchi aperti verdi mostrano contatti eccitatori e i cerchi aperti blu mostrano contatti inibitori. Qui viene mostrata una ricostruzione neuro lucida di questa coppia di cellule reciprocamente connesse. L'assone interneuronale è mostrato in blu e il suo soma e dendrite sono mostrati in rosso.

L'assone dei neuroni spinosi è mostrato in verde e il suo soma e dite sono in bianco. Il riquadro mostra i compartimenti dendritici somatosi dei neuroni pre e post-sinaptici. Insieme ai presunti contatti sinaptici, i contorni dei barili sono stati identificati nelle micrografie fotografiche a campo chiaro a bassa potenza realizzate dalla fetta acuta del cervello.

Qui viene mostrata una connessione sinaptica rappresentativa con un rapporto di connettività molto basso. Un potenziale d'azione presinaptico in una cellula parametallica di sesto strato ha evocato un potenziale postsinaptico eccitatorio sinaptico monos in un neurone parametallico stellare di quarto strato. La latenza mostrata qui di oltre tre millisecondi di questa connessione translaminare è molto più lunga della latenza di circa un millisecondo osservata nelle connessioni intralaminari locali.

Due potenziali d'azione a 10 hertz suscitati nella cellula parametallica di strato sei hanno innescato potenziali post-sinaptici nel neurone parametallico stella di strato quattro mostrato qui. Si noti la facilitazione a breve termine. È importante ricordare che la condizione di taglio deve essere ottimizzata per una data connessione sinaptica e che durante la registrazione il setup deve essere assolutamente stabile e quindi la comprensione ottimale della registrazione è garantita.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come le misurazioni elettrofisiologiche e le ricostruzioni morfologiche vengono utilizzate per ottenere un quadro generale delle proprietà strutturali e funzionali dei microcircuiti neuronali nella neocorteccia.