Valutazione funzionale di neurotossine biologiche in Culture in rete di cellule staminali derivate dal Sistema Nervoso Centrale Neuroni

Lo scopo di questa procedura è misurare con precisione l'effetto che le neurotossine clostridiali esercitano sulla trasmissione sinaptica in colture di neuroni interconnessi, ottenuti da cellule staminali embrionali di topo. Questo obiettivo viene raggiunto adattando innanzitutto le cellule staminali embrionali a una coltura in sospensione priva di cellule feeder e mantenendo le cellule adattate in uno stato pluripotente. Il secondo passaggio consiste nel differenziare le cellule staminali adattate in sospensione in neuroni o ESN, utilizzando una variante della tecnica di differenziazione in quattro fasi.

Successivamente, le ESN vengono trattate con una serie di mezzi per favorire la maturazione in neuroni connessi e attivi sinapticamente. L'ultimo passaggio consiste nel trattare le ESN con neurotossine clostridiali o altre neurotossine e misurare gli effetti sull'attività monosinaptica mediante elettrofisiologia con tecnica del patch-clamp su cellula intera. Infine, le variazioni nella produzione spontanea di attività monosinaptica vengono quantificate a partire dalle registrazioni elettrofisiologiche, normalizzate rispetto a neuroni di controllo appaiati per età e lotto, e confrontate tra diverse condizioni, come dosi, tempi o trattamenti farmacologici.

Il principale vantaggio di questa tecnica è che le ESN costituiscono il primo modello cellulare in grado di replicare le patologie funzionali responsabili delle manifestazioni cliniche del botulismo e della tetano. Abbiamo concepito per la prima volta questo metodo quando abbiamo scoperto che le ESN risultavano altamente suscettibili a tutte le neurotossine clostridiali basate sul clivaggio delle proteine SNARE e mostravano inoltre un'attività sinaptica spontanea in un comportamento di rete emergente. La procedura sarà dimostrata da Ms. Megan Lyman, tecnica del mio laboratorio. Iniziare trasferendo una coltura in sospensione adattata, priva di cellule feeder.

Trasferire gli aggregati di ESC in un tubo conico da 15 millilitri e lasciare che si sedimentino formando un pellet compatto. Una volta che gli aggregati si sono depositati, aspirare il sopranatante facendo attenzione a non disturbare il pellet cellulare. Quindi aggiungere cinque millilitri di PBS per lavare le cellule e centrifugare a 100 × g per 2,5 minuti.

Aspirare con attenzione il PBS, quindi aggiungere 500 microlitri di tripsina e capovolgere il tubo diverse volte per rimuovere delicatamente il pellet cellulare. Successivamente, collocare il tubo nel bagnomaria a 37 gradi Celsius e incubare per tre minuti. Trascorso il tempo di incubazione, riportare il tubo nell'incubatrice per colture cellulari e aggiungere 500 microlitri di mezzo ESC per diluire la tripsina.

Quindi, pipettare la sospensione di CEL da cinque a dieci volte con una pipetta P 1000 per ottenere una sospensione di singole cellule. Contare un'equivalente delle cellule utilizzando un emo, citometro e centrifugare il resto della sospensione cellulare a 200 × g per tre minuti. Dopo aver aspirato il sopernatante, sospendere le cellule a una concentrazione finale di 1 × 10⁷ cellule per millilitro con mezzo ESC.

Successivamente, trasferire 150 microlitri della sospensione in 10 millilitri di mezzo ESC in una piastra batteriologica da 10 centimetri e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Le ESC vengono abitualmente passaggiate utilizzando questo protocollo. Ogni 48 ore inizia la differenziazione delle ESC in neuroni durante un normale passaggio cellulare.

Dissociare le ESC come in precedenza, ma includere un'ulteriore piastra per la differenziazione neuronale. Trasferire 350 microlitri della sospensione cellulare in una piastra da 10 centimetri a bassa adesione contenente 25 millilitri di differentiation.Medium. Posizionare la piastra su un agitatore orbitale impostato a 30-45 RPM all'interno di un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e incubare per 48 ore.

Dopo 48 ore, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per trasferire gli aggregati cellulari in differenziamento in un tubo conico da 50 millilitri. Immediatamente dopo, aggiungere 25 millilitri di mezzo di differenziamento fresco alla piastra di Petri.

Lasciare sedimentare gli aggregati per due-cinque minuti, formando un pellet visibile profondo uno-due millimetri. Aspirare con attenzione il mezzo, ignorando le singole cellule o i piccoli aggregati ancora in sospensione, e utilizzare una pipetta P1000 per trasferire la popolazione cellulare nuovamente nella piastra di Petri. Riposizionare la piastra sullo shaker rotatorio all'interno dell'incubatore.

Dopo ulteriori 48 ore, ripetere la procedura di cambio del mezzo. Questa volta aggiungere 30 millilitri di mezzo di differenziamento integrato con sei micromolari di acido retinoico tutto trans. Il pellet formato sarà ora profondo da due a quattro millimetri dopo l'incubazione delle cellule.

Come in precedenza, ripetere la procedura di cambio del mezzo con integrazione di acido retinoico per l'ultima volta. Il pellet avrà una profondità di quattro-otto millimetri a questo punto il giorno seguente. Preparare le superfici di semina come indicato nella parte scritta del protocollo nel pomeriggio del giorno della semina, oppure preparare cinque millilitri ciascuno di mezzo MPC con tripsina pre-ricoperto e inibitore della tripsina della soia allo 0,1% a 37 gradi Celsius.

Quindi utilizzare una pipetta da 25 millilitri per trasferire gli aggregati in differenziazione dalla piastra di coltura a un tubo conico da 50 millilitri. Lasciare sedimentare gli aggregati per tre-cinque minuti, quindi aspirare con attenzione il mezzo senza disturbare il pellet. Successivamente, lavare il pellet con cinque-dieci millilitri di PBS, dopo che gli aggregati si sono sedimentati.

Aspirare il PBS e ripetere il lavaggio. Dopo il secondo lavaggio con PBS, aggiungere cinque millilitri di mezzo di differenziazione MPC al pellet e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Battere leggermente il tubo da due a tre volte durante l'incubazione. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di inibitore della tripsina della soia allo 0,1% alle cellule e mescolare rapidamente capovolgendo il tubo. Quindi, triturare delicatamente le cellule da 10 a 15 volte con una pipetta da 10 millilitri fino a ottenere una sospensione cellulare relativamente omogenea.

Filtrare lentamente la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 o 70 micron posizionato sopra un tubo conico da 50 millilitri. Una volta completato il filtraggio di tutta la sospensione, aggiungere un millilitro di mezzo N2 sul filtro per lavare le cellule rimanenti attraverso il setaccio. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri e centrifugare per sei minuti a 200 × g. Dopo aver aspirato il mezzo senza disturbare il pellet, risospendere in due millilitri di mezzo N2, quindi aggiungere mezzo N2 fino a un volume totale di 10 millilitri.

Centrifugare per cinque minuti a 200 ×g. Aspirare il mezzo e ripetere nuovamente il lavaggio del pellet. Risospendere il pellet in 10 millilitri di mezzo N2.

Prelevare un'aliquote delle cellule e contare con un emocitometro, quindi ripetere la centrifugazione Reese. Sospendere le cellule nel mezzo N due a una concentrazione finale di uno per 10 alla sette cellule per millilitro e seminare a una densità di 150.000 - 200.000 cellule per centimetro quadrato. Indic viene preparato al DIV meno uno e posto nell'incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius.

Mantenere i NEF seguendo le istruzioni riportate nel protocollo scritto. Per prima cosa, diluire la neurotossina botulinica del sierotipo A fino a 100 volte la concentrazione finale desiderata nel mezzo di coltura dei NEF e riscaldare a 37 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere un volume appropriato di tossina alle colture di NEF a DIV 21.

Riempire la piastra colturale e riposizionarla nell'incubatore al momento desiderato. Aspirare il mezzo di coltura ESN e lavare due volte con buffer per registrazione extracellulare o ERB. Quindi aggiungere quattro millilitri di ERB integrato con cinque micromolar di tetrodotossina per bloccare i potenziali d'azione e 10 micromolar di bicucullina per antagonizzare l'attività dei recettori gabaa.

Successivamente, trasferire la piastra al sistema di elettrofisiologia. Non è richiesta né perfusione né controllo della temperatura per la misurazione dell'inibizione della trasmissione sinaptica o per il saggio mist. Dopo aver utilizzato un estrattore per micropipette per tirare pipette in borosilicato con una resistenza compresa tra cinque e dieci megaohm, riempire retrogradamente una pipetta con il buffer per la registrazione intracellulare.

Quindi immergere delicatamente la pipetta nel reagente siliconico. Fissare la pipetta di registrazione sul porta-elettrodo e collegare una siringa piena d'aria a un tubo che si immette nel porta-elettrodo. Applicare una pressione positiva costante attraverso la siringa mentre si abbassa la pipetta di registrazione nell'ERB.

Dopo aver posizionato delicatamente la pipetta di registrazione sul SOR del neurone da registrare, osservare la pressione positiva rompendo il sigillo sulla siringa. Ricollegare la siringa ed applicare una pressione negativa sostenuta mediante una leggera inspirazione per formare un sigillo dell'ordine del giga ohm.

Una volta formato il sigillo giga-ohm, ridurre la tensione di mantenimento a meno 70 millivolt. Quindi applicare con attenzione brevi impulsi di pressione negativa utilizzando la siringa per passare alla configurazione della cellula intera. Monitorare gli impulsi di capacità per 30 secondi per confermare che la registrazione sia stabile.

Annullare i picchi di capacità nel software HEA e passare alla modalità di blocco della corrente per monitorare e registrare il potenziale di membrana a riposo senza correzione per i potenziali di giunzione liquida. Il potenziale di membrana a riposo potrebbe essere compreso tra meno 67 e meno 82 millivolt. Regolare il guadagno a due millivolt per picoampere.

Passare alla modalità voltage clamp ed effettuare una registrazione continua a meno 70 millivolt per tre-cinque minuti per rilevare le correnti postsinaptiche eccitatorie miniature. Analizzare tre-cinque minuti di dati registrati per rilevare le correnti postsinaptiche miniature (mEPSC) utilizzando le impostazioni predefinite per le correnti postsinaptiche eccitatorie mediati dai recettori AMPA nel software Mini Analysis, raccogliere e salvare le informazioni sugli eventi rilevati. Dopo aver raccolto le frequenze delle mEPSC per otto-dodici campioni di controllo e otto-dodici campioni trattati con neurotossina botulinica per ciascuna condizione di esposizione.

Analizzare la frequenza rispetto a controlli appaiati per età e lotto, quindi determinare la significatività statistica della percentuale di inibizione dell'attività sinaptica utilizzando appropriati test statistici dal div 7 al div 49, le ESN esprimono compartimenti neurotrofici e formano punti sinaptici. Interfacce dendritiche Taxo. Le ESN subiscono inibizione dell'attività sinaptica quando esposte ai sierotipi della neurotossina botulinica A TG e alla tossina tetanica.

Questi tracciati rappresentativi provenienti da ESN sono stati raccolti 20 ore dopo l'aggiunta in bagno dei sierotipi della neurotossina botulinica, A TG tetano, neurotossina o veicolo. Ciascuna neurotossina ha ridotto l'attività sinaptica di oltre il 95% rispetto ai controlli. Le quattro immagini seguenti mostrano la sensibilità dell'uso della mist per misurare l'attività monosinaptica in ESN trattati con sierotipo della neurotossina botulinica A.

Questa prima immagine mostra tracce rappresentative di misurazioni mancate dell'attività sinaptica 20 ore dopo l'aggiunta in bagno della neurotossina botulinica del sierotipo A. I tratti del clamp di tensione hanno mostrato una riduzione della frequenza dei P-E-P-S-C a seguito dell'esposizione alla neurotossina botulinica del sierotipo A. Questa immagine mostra la quantificazione della frequenza dei P-E-P-S-C e conferma una diminuzione dipendente dalla dose della frequenza dei P-E-P-S-C. La concentrazione mediana inibitoria è stata determinata mediante adattamento ai minimi quadrati di una regressione non lineare utilizzando una pendenza variabile a quattro parametri. Si noti che il limite di rilevamento mediante mist in SNS è di almeno 0,005 picoMolare.

Questo grafico a barre mostra la quantificazione mediante citometria del taglio di SNAP 25 misurato tramite western blot. Si noti la ridotta sensibilità del taglio delle proteine snare come lettura dell'intossicazione. In confronto a mist, un singolo asterisco indica un valore P inferiore a 0,05.

Un triplo asterisco indica un valore P inferiore a 0,001. Questi risultati dimostrano che popolazioni di neuroni derivati da cellule staminali organizzate in rete offrono un modello cellulare fisiologicamente rilevante dell'avvelenamento da neurotossine clostridiali. L'uso del SNS dovrebbe ridurre in modo significativo la sofferenza e la mortalità animale, fungendo da alternativa adeguata al saggio di letalità nel topo, con il vantaggio aggiuntivo di una maggiore velocità, specificità e sensibilità.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della neurotossicologia, consentendo l'impiego di tecniche di screening a media resa basate sull'attività delle reti neuronali per facilitare lo screening terapeutico e il rilevamento di tossine per le neurotossine clostridiali.