Valutazione funzionale di neurotossine biologiche in Culture in rete di cellule staminali derivate dal Sistema Nervoso Centrale Neuroni

L'obiettivo di questa procedura è misurare con precisione l'effetto che le neurotossine clostridiali hanno sulla trasmissione sinaptica in colture in rete di neuroni derivati da cellule staminali embrionali di topo. Ciò si ottiene adattando prima le cellule staminali embrionali a una coltura in sospensione priva di cellule alimentatrici e mantenendo le cellule adattate in uno stato pluripotente. Il secondo passo consiste nel differenziare le cellule staminali adattate in sospensione in neuroni o ESN, utilizzando una variazione della tecnica di differenziazione dei quattro quattro.

Successivamente, gli ESN vengono trattati con una serie di terreni per promuovere la maturazione in neuroni in rete sinapticamente attivi. Il passaggio finale consiste nel trattare gli ESN con clostridi, neurotossine o altre neurotossine e misurare gli effetti sull'attività sinaptica dei monos utilizzando l'elettrofisiologia del patch clamp a cellula intera. In definitiva, i cambiamenti nella produzione spontanea di attività sinaptica dei mono sono quantificati da registrazioni elettrofisiologiche normalizzate all'età e ai neuroni di controllo abbinati al lotto e confrontati tra diverse condizioni come dosi, tempi o trattamenti farmacologici.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che gli ESN sono il primo modello cellulare a replicare le patologie funzionali responsabili delle manifestazioni cliniche del botulismo e del tetano. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo quando abbiamo scoperto che gli ESN erano altamente suscettibili a tutte le neurotossine clostridiali basate sulla scissione della proteina snar, e dimostravano anche un'attività sinaptica spontanea nel comportamento emergente della rete. A dimostrare la procedura sarà la signora Megan Lyman, un tecnico del mio laboratorio Iniziare trasferendo l'alimentatore in sospensione senza cellule adattata alla coltura in sospensione.

L'ESC si aggrega in un tubo conico da 15 millilitri e consente agli aggregati di depositarsi in un pellet compatto. Una volta che gli aggregati si sono depositati, aspirare il natante SUP facendo attenzione a non rompere il pellet cellulare. Quindi aggiungere cinque millilitri di PBS per lavare le celle e centrifugare a 100 volte G per 2,5 minuti.

Aspirare con cura il PBS e poi aggiungere 500 microlitri di tripsina e capovolgere il tubo più volte per rompere delicatamente il pellet cellulare. Quindi posizionare la provetta nel bagnomaria a 37 gradi Celsius e incubare per tre minuti. Trascorso il tempo di incubazione, rimettere la provetta nella cappa di coltura tissutale e aggiungere 500 microlitri di terreno ESC per diluire la tripsina.

Quindi itrare la sospensione CEL da cinque a 10 volte con la pipetta P 1000 per ottenere una sospensione a cella singola. Contare un eloqua delle cellule utilizzando un emometro, un citometro e centrifugare il resto della sospensione cellulare a 200 volte G per tre minuti. Dopo aver aspirato il supinato, sospendiamo le cellule a una concentrazione finale di un centesimo, le sette cellule per millilitro con terreno ESC.

Successivamente trasferire, 150 microlitri della sospensione in 10 millilitri di terreno ESC in un piatto batterico di 10 centimetri e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Gli ESC vengono regolarmente fatti passare utilizzando questo protocollo. Ogni 48 ore inizia la differenziazione delle ESC in neuroni durante un passaggio cellulare di routine.

Dissociare le ESC come prima, ma includere una piastra aggiuntiva per la differenziazione neuronale. Trasferire 350 microlitri della sospensione cellulare in un piatto a basso attacco di 10 centimetri contenente 25 millilitri di differenziazione. Medio. Posizionare la piastra su un agitatore orbitale impostato a 30-45 giri/min all'interno di un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica e incubare per 48 ore.

Dopo 48 ore, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per trasferire gli aggregati di cellule differenzianti in una provetta conica da 50 millilitri. Subito dopo aggiungere 25 millilitri di differenziazione fresca. Medio alla capsula di Petri.

Lasciare che gli aggregati si depositino per due o cinque minuti, producendo un pellet visibile profondo uno o due millimetri. Aspirare con cura il terreno, ignorando le singole cellule o i piccoli aggregati ancora in sospensione, e utilizzare una pipetta P 1000 per trasferire nuovamente la tavolozza cellulare nella piastra di Petri. Rimettere la piastra nello shaker rotante nell'incubatrice.

Dopo altre 48 ore, ripetere la procedura di sostituzione del supporto. Questa volta a 30 millilitri di terreno di differenziazione integrato con sei micromolari di acido trans retinoico. Il pellet formato sarà ora profondo da due a quattro millimetri dopo l'incubazione delle cellule.

Come in precedenza, ripetere per l'ultima volta la procedura di sostituzione del terreno con l'integrazione di acido retinoico. Il pellet sarà profondo da quattro a otto millimetri a questo punto il giorno successivo. Preparare le superfici di placcatura come indicato nella parte scritta del protocollo il pomeriggio del giorno della placcatura, o cinque millilitri ciascuno di terreno di tripsina MPC pre-rivestito e inibitore della tryina di soia allo 0,1% a 37 gradi Celsius.

Quindi utilizzare una pipetta da 25 millilitri per trasferire gli aggregati differenzianti dalla piastra di coltura a una provetta conica da 50 millilitri. Lasciare riposare gli aggregati per tre-cinque minuti, quindi aspirare con cura il fluido senza disturbare il pellet. Successivamente, lavare il pellet con 5-10 millilitri di PBS e dopo che gli aggregati si sono depositati.

Aspirare il PBS e ripetere il lavaggio. Dopo il secondo lavaggio PBS. Aggiungere cinque millilitri di mezzo di coltura MPC al pellet e incubarlo a 37 gradi Celsius per cinque minuti.

Muovendo delicatamente il tubo due o tre volte durante l'incubazione. Quindi, aggiungi cinque millilitri di inibitore della tripsina di soia allo 0,1% alle cellule e mescola rapidamente invertendolo. Quindi tritrare delicatamente le cellule da 10 a 15 volte con una pipetta da 10 millilitri fino a produrre una sospensione cellulare relativamente omogenea.

Filtrare lentamente la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 o 70 micron posizionato sopra un tubo conico da 50 millilitri. Quindi, una volta che tutta la sospensione è stata filtrata a un millilitro di N due, media al filtro per lavare le cellule rimanenti attraverso il filtro. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri e centrifugare per sei minuti a 200 volte G.Dopo aver aspirato il terreno senza disturbare il pellet, triturare in due millilitri di N due terreni, quindi aggiungere N due terreni per un volume totale di 10 millilitri.

Centrifugare per cinque minuti a 200 volte. G.Aspirare il supporto e ripetere nuovamente il processo di lavaggio del pellet. Resus sospendendo il pellet in 10 millilitri di N due medium.

Rimuovere un'aliquota delle cellule e contare con un emocitometro, quindi ripetere la centrifugazione Reese. Sospendi le cellule in N due mezzi ad una concentrazione finale di una volta 10 per le sette cellule per millilitro e piastrina ad una densità da 150.000 a 200.000 cellule per centimetro quadrato. Indic viene preparato a DIV meno uno e posto nell'incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius.

Mantenere gli ESN secondo le istruzioni nel protocollo scritto. Innanzitutto, diluire la neurotossina botulinica sierotipo A a 100 volte la concentrazione finale desiderata in coltura ESN, media e calda a 37 gradi Celsius. Quindi aggiungere un volume appropriato di tossina alle colture DIV 21 più ESN.

Gonfia il piatto di coltura e torna all'incubatrice all'ora desiderata. Aspirare a punta il terreno di coltura ESN e lavare due volte con tampone di registrazione extracellulare o ERB. Quindi aggiungere quattro millilitri di ERB integrato con cinque tetrodatossina micromolare per bloccare i potenziali d'azione e 10 micromolari bi colina per antagonizzare l'attività del recettore gabaa.

Quindi, trasferire la parabola sul rig di elettrofisiologia. Non è richiesta né la perfusione né il controllo della temperatura per l'inibizione misurata della trasmissione sinaptica o del saggio della nebbia. Dopo aver utilizzato un estrattore per micropipette per estrarre pipette di silicato bo con resistenza da cinque a 10 mega ohm, riempire una pipetta con un tampone di registrazione intracellulare.

Quindi immergere delicatamente la pipetta nel reagente al silicone. Fissare la pipetta di registrazione sul supporto dell'elettrodo e collegare una siringa piena d'aria al tubo che viene inserito nel supporto dell'elettrodo. Fornire una pressione positiva costante attraverso la siringa mentre si abbassa la pipetta di registrazione nell'ERB.

Dopo aver fatto atterrare delicatamente la pipetta di registrazione sul SOR del neurone da registrare. Vedere la pressione positiva rompendo il sigillo sulla siringa. Ricollegare la siringa e applicare una pressione negativa sostenuta attraverso una delicata inspirazione per formare una tenuta giga ohm.

Una volta formata la guarnizione gigaoma, diminuire la tensione di mantenimento a meno 70 millivolt. Quindi applicare con cautela brevi impulsi di pressione negativa utilizzando la siringa per entrare nella configurazione dell'intera cellula. Monitorare i picchi di capacità per 30 secondi per verificare che la patch sia stabile.

Annulla i picchi di capacità nel software HEA e passa alla modalità pinza amperometrica per monitorare e registrare il potenziale di membrana a riposo senza regolazione per i potenziali di giunzione liquida. Il potenziale di membrana a riposo potrebbe essere compreso tra meno 67 e meno 82 millivolt. Regolare il guadagno a due millivolt per pico amp.

Passa alla modalità voltage clamp ed esegui una registrazione continua a meno 70 millivolt per tre o cinque minuti per rilevare correnti eccitatorie post-sinaptiche in miniatura. Analizza da tre a cinque minuti di dati registrati per rilevare le PSC utilizzando le impostazioni predefinite per le EPC del recettore AMPA nella mini analisi, raccogli e salva le informazioni sugli eventi rilevati. Dopo aver raccolto le frequenze M-E-P-S-C per 8-12 controlli e da 8 a 12 campioni trattati con neurotossina botulinica per ogni condizione di esposizione.

Analizza la frequenza rispetto ai controlli abbinati per età e lotto, quindi determina la significatività statistica della percentuale di inibizione dell'attività sinaptica utilizzando test statistici appropriati dalla div sette alla div 49, gli ESN esprimono compartimenti neurotropici e formano la puntura sinaptica. Interfacce dendritiche taxo. Gli ESN subiscono l'inibizione dell'attività sinaptica quando esposti ai sierotipi di neurotossina botulinica a TG e alla tossina tetanica.

Queste tracce rappresentative da ESN sono state raccolte 20 ore dopo l'edizione del bagno dei sierotipi di neurotossina botulinica, tetano A TG, neurotossina o veicolo. Ogni neurotossina ha ridotto l'attività sinaptica di oltre il 95% rispetto ai controlli. Le quattro immagini seguenti mostrano la sensibilità dell'uso della nebbia per misurare l'attività sinaptica monos nel sierotipo di neurotossina botulinica, ESN trattati con A.

Questa prima immagine mostra tracce rappresentative da mancate misurazioni dell'attività sinaptica 20 ore dopo l'edizione del bagno della neurotossina botulinica sierotipo A.I segmenti di tracce del voltage clamp hanno mostrato una diminuzione della frequenza M-E-P-S-C dopo l'esposizione al sierotipo A della neurotossina botulinica.Questa immagine mostra la quantificazione della frequenza M-E-P-S-C e conferma una diminuzione dose-dipendente della frequenza M-E-P-S-C. La concentrazione inibitoria mediana è stata determinata con l'adattamento dei minimi quadrati di una regressione non lineare utilizzando una pendenza variabile a quattro parametri. Si noti che il limite di rilevamento da parte della nebbia in SNS è di almeno 0,005 picamolare.

Questo grafico a barre mostra la quantificazione citometrica della scissione di SNAP 25 misurata mediante western blot. Si noti la ridotta sensibilità della scissione delle proteine dell'ansa come lettura dell'intossicazione. Rispetto alla nebbia, un singolo asterisco indica un valore P inferiore a 0,05.

Un triplo asterisco indica un valore P inferiore a 0,001. Questi risultati dimostrano che le popolazioni in rete di neuroni derivati da cellule staminali offrono un modello cellulare fisiologicamente rilevante di avvelenamento da neurotossina da clostridi. Si prevede che l'uso di SNS ridurrà significativamente il disagio e la morte degli animali, fungendo da sostituto adatto per il test di letalità del topo, con l'ulteriore vantaggio di una migliore specificità e sensibilità della velocità.

Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo della neurotossicologia per impiegare tecniche di screening a rendimento moderato basate sull'attività della rete neuronale per facilitare lo screening terapeutico e il rilevamento delle tossine per le neurotossine clostridiali.