Name: A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl - Canali e trasportatori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Scopri come misurare quantitativamente l'attività di trasporto dei canali del cloruro ricostituiti in proteoliposomi utilizzando un elettrodo sensibile al cloruro. Questo metodo permette di determinare la velocità unitaria di trasporto e la geometria del complesso proteico attivo.

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione NIH GM085232 e da un Irma T. Hirschl/ Monique Weill-Caulier Scholar Award (ad A.A.).

1. Lipid Preparazione <ol><li> Aliquota lipidi quantità desiderata in un tubo di vetro trasparente. Vedi. coli estratto lipidico polare, ma la maggior parte delle composizioni lipidiche possono essere usati. Se i lipidi sono in forma di polvere, risospendere in cloroformio ad una concentrazione di 20 mg / ml. Asciugare i lipidi a RT in N 2 gas fino a quando tutto il solvente è evaporato. </li><li> Risospendere i lipidi in pentano e asciugare nuovamente un flusso costante di gas N 2 per eliminare tracce residue di cloroformio. Dry fino a che tutto il solvente è evaporato. Mentre l&#39;essiccazione, ruotare delicatamente il tubo in modo che il lipide è distribuito in una pellicola uniforme che copre la parte inferiore del tubo piuttosto che formare una densa massa sul fondo. </li><li> Aggiungere il tampone di ricostituzione contenente detersivo (KCl 300 mm, 50 acido citrico mM, 25 mm K 2 HPO 4, pH 4.5, 35 CHAPS mm) per sciogliere i lipidi. Utilizzare altri detergenti delicati per questo passo se la proteina è scarsamente tollerante CHAPS. </li><li> Resuspend i lipidi di chiarezza con un sonicatore bagnomaria. Immergere il tubo nel centro del bagno sonicatore acqua alla potenza massima breve (30 sec-1 min) con impulsi brevi (30 sec-1 min) interrompe. La soluzione dovrebbe diventare chiaro. NOTA: Il grado finale di chiarezza raggiunto dipende dalla composizione lipidica specifico utilizzato. Alcune variazioni da lotto a lotto in questa fase, anche tra lipidi nominalmente identici, è anche possibile. Haze residuo è dovuta alla dispersione della luce da grandi particelle in sospensione, che può essere rimosso mediante centrifugazione. </li><li> Incubare i lipidi risospeso a RT per 20-60 min. </li></ol> 2. Proteoliposome Formazione NOTA: Diverse strategie può essere impiegato per inserire la proteina detergente solubilizzato in liposomi. Per CLC-EC1 dialisi funziona bene ed è quindi il metodo di scelta 6,9,10. <ol><li> Aggiungere la proteina purificata alla desiderata proteina-to-lipidi (P / L) Rapporto (espressa in mg o<html> f Proteine ​​/ mg lipidi). La scelta del rapporto P / L dipende dallo scopo dell&#39;esperimento. <ol><li> Se l&#39;obiettivo è quello di valutare l&#39;attività della proteina di interesse, ricostituire ad alta P / L&#39;s per massimizzare il segnale, in quanto ogni liposoma contiene più copie della proteina. Per quantificare l&#39;attività e / o velocità di trasporto unitario della proteina, ricostituire in un regime di diluizione Poisson a bassa P / L&#39;s, in modo che ogni vescicola contiene in media 1 proteine. Vedere il punto 7 e discussione per una più approfondita analisi di quando usare ogni regime. </li></ol></li><li> Per determinare i valori ottimali P / L per i vari regimi, effettuare una titolazione completa dell&#39;attività in funzione della concentrazione proteica 8,11-13. Tuttavia, per ogni proteina per la quale il peso molecolare (MW, espresso in kDa) dell&#39;unità attiva è noto i seguenti valori P / L possono essere utilizzati come guesstimates iniziali: pg &quot;/&gt; <img alt="Equazione 2" fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq2.jpg" /></li><li> Caricare la miscela di proteine ​​e lipidi in un tubo di dialisi pre-bagnata o una cassetta. Posizionare il dispositivo di dialisi in un becher contenente 500-1,000x il volume del buffer lipidi ricostituzione (cioè, 1 tampone L per 1 ml di lipidi risospensione) sotto leggera agitazione. <ol><li> Change tampone 3-4 volte a intervalli&gt; 3 ore. Ad ogni cambio soluzione, lavare la cassetta / tubo e il bicchiere con acqua distillata e riempire il bicchiere con tampone di ricostituzione fresca. Includere 1-2 O / N intervalli per il cambio soluzione. Il numero esatto e durata delle modifiche soluzione dipende lipide esatta e detergenti utilizzati. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;ultimo passo, rimuovere i liposomi dalla nave di dialisi, le aliquote in tubi e flash li congelare in N liquido 2 o congelamento a -80 ° C. </li></ol> 3. Registrazione Set-up &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; NOTA: La registrazione set-up (Figura 2A) si compone di due camere (cilindri a fondo piatto, ~ 3-4 volumi ml), un Cl - (vedi sotto) elettrodo, un pH-metro con un analogo o uscita digitale elettrica, un digitalizzatore, e un computer con un appropriato software di acquisizione. <ol><li> Collegare il Cl - elettrodo al pH-metro, l&#39;uscita del misuratore di pH al digitalizzatore, che è collegata al computer. Inserire l&#39;elettrodo di riferimento in una camera e il filo ricodifica nell&#39;altro (Figura 2B). NOTA: La polarità dei fili è corretto se ΔV Cal (vedi punto 6.4 e 7.2) è positivo. </li><li> Mettere le camere su un piatto mescolare con un ancoretta in camera di registrazione (Figura 1B). Assicurarsi che la ancoretta non tocchi l&#39;elettrodo. </li><li> Collegare camere utilizzando un ponte di agar (Figura 2B) (KCl 100 mM e 2% agarosio). Conservare i ponti Agar in KCl 100 mm. </li&gt; </ol> 4. Preparazione del Cl - Elettrodo <ol><li> Prendete un vecchio e -possibly- elettrodo non funzionante pH. Rompere il rivestimento di vetro per rivelare completamente i fili d&#39;argento. </li><li> Rimuovere delicatamente il rivestimento dai fili d&#39;argento con una lama di bisturi. Pulire i fili con abbondanti quantità di H 2 O e EtOH. </li><li> Mettere in una soluzione satura di FeCl 3 (o candeggina) fino fili sono coperti con un mantello scuro uniforme di AgCl. </li></ol> 5. Preparazione di unilamellari vescicole <ol><li> La notte prima degli esperimenti, si gonfiano 1 g di Sephadex G-50 perle in 15 ml di tampone esterna (1 mM KCl, 150 mm K 2 SO 4, acido citrico 25 mM, pH 4.5) con agitando delicatamente (non mescolare) per almeno 3 ore a temperatura ambiente prima dell&#39;uso. Ogni esperimento richiede ~ 3 ml di perle gonfie. Mantenere le perle gonfie a 4 ° C per pochi giorni al massimo. </li><li> Mentre i liposomi sono scongelamento a RT, versare in ogni colonna ~ 3 ml di gonfiore G-50 perline. Lasciate asciugare per flusso di gravità a RT; questo richiede di solito 1-2 min. </li><li> Preparare vescicole unilamellari estrudendo i proteoliposomi 11 volte attraverso un mini-estrusore utilizzando un taglio 0,4 m Teflon. </li><li> Porre la colonna in un tubo a fondo tondo di plastica. Gira le colonne per rimuovere la soluzione in eccesso. Centrifugare per 20-30 secondi a 1.400 xg in una centrifuga clinica. </li><li> Scartare flow-through, colonna posto in un tubo di vetro 13 x 100 mm e aggiungere 100 ml di vescicole estrusi alla colonna. Spin colonna per 1 min a 500 xg in una centrifuga clinica. </li><li> Raccogliere ~ 200 ml di flusso continuo che verranno aggiunti alla camera di registrazione al punto 6.5. </li></ol> 6. Efflux misura <ol><li> 2 ml di KCl 100 mm di riferimento (terra) da camera e 1,8 ml del tampone esterna (1 mM KCl, 150 mm K 2 SO 4, 25 acido citrico mM, pH 4,5) per la camera di registrazione. Il leggero squilibrio osmotico tra l&#39;internoe soluzioni esterne non influisce </li><li> Avviare il programma di acquisizione. Lasciate che la linea di base equilibrare, l&#39;operazione potrebbe richiedere alcuni minuti. </li><li> Una volta che il segnale raggiunge una linea di base stabile (liposomi sono pronti e le colonne asciugare), avviare la registrazione (Figura 3A). </li><li> Aggiungere 15 ml di una soluzione 10 mM KCl per calibrare il sistema (Figura 2A). </li><li> Aggiungi liposomi. Un piccolo salto potrebbe essere visibile a causa della rimozione incompleta di Cl esterni - dalle proteoliposomi (Figura 3A). Aspetta la linea di base si stabilizza. </li><li> Aggiungere Valinomicina (1 ml a 1 mg / ml in EtOH) per avviare efflusso (Figura 3A). </li><li> Lasciate che l&#39;efflusso suo corso tempo fino a che altipiani (Figura 3A). </li><li> Aggiungere 40 ml di 1,5 M β-octylglucoside (β-OG) preparato nel buffer esterna per sciogliere tutti liposomi (Figura 3A). Terminare la registrazione. </li></ol> 7. Dati AANALISI <ol><li> Esportare il file di traccia da in formato ASCII o testo e importarlo nel programma di analisi di scelta. </li><li> Misurare la tensione nei seguenti punti (Figura 3A): All&#39;inizio della registrazione (V 0); Dopo aggiunta dell&#39;impulso di taratura (V cal); Dopo l&#39;aggiunta dei liposomi (V lipo); Alla fine del efflusso (V fin); Dopo l&#39;aggiunta di detergente (V tot); Baseline le tensioni in modo che V 0 = 0. </li><li> Utilizzare l&#39;equazione di Nernst-Plank per determinare il valore sperimentale <img alt="Equazione 3" fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq3.jpg" /> misurando <img alt="Equazione 4" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq4.jpg" /> Dove Vol Cal è il volume dell&#39;impulso di taratura in ml, 1.800 è il volume della camera all&#39;inizio dell&#39;esperimento espressa1; l, [Cl] cal / a sono il Cl - concentrazioni di impulso di calibrazione e del cuscinetto esterno in mM e ΔV cal è il salto in mV misurata dopo l&#39;impulso di taratura. NOTA: Questa determinazione empirica di α tre scopi: garantisce che il sistema risponde correttamente, offre una misura della coerenza della risposta dello strumento tra esperimenti e controllare che errori sono stati fatti nella fabbricazione soluzione. </li><li> Calcolare le concentrazioni Cl dopo ogni passaggio come segue: <img alt="Equazione 5" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq5.jpg" /> <img alt="Equazione 6" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq6.jpg" /> <img alt="Equazione 7" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq7.jpg" /> Il fattore 3/400 proviene dalla diluizione dell&#39;impulso di taratura 15 microlitri nel volume finale di 2000 ml. </li><li> Calculmangiato i cambiamenti [Cl] ad ogni passo, ΔCl lipo / def / tot. </li><li> Convertire V (t) in Cl (t) con <img alt="Equazione 8" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq8.jpg" /> Direttamente determinare i valori [Cl] nei punti critici e confrontarle con i valori calcolati come controllo interno. </li><li> Normalizzare la traccia in modo che la lipo Cl rel = 0 e Cl rel tot = 1 <img alt="Equazione 9" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq9.jpg" /></li><li> Montare corso tempo di efflusso la seguente equazione: <img alt="Equazione 10" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq10.jpg" /> Quando L è il tasso di Cl - perdita che è sperimentalmente determinata misurando Cl - efflusso da liposomi privi di proteine ​​preparati nelle stesse condizioni e τ è la costante di tempo del processo. </li><li> Calcolare v, la velocità iniziale: Dove ΔCl pinna è espresso in millimolare e V è il volume della camera in microlitri. </li><li> Calcolare il tasso di trasporto / conduttanza <img alt="Equazione 12" fo:content-width="3.5in" src="/files/ftp_upload/52369/52369eq12.jpg" /> Dove P è il P / L, MW è il peso molecolare del complesso attivo espresso in kDa </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Abbiamo descritto un protocollo dettagliato per misurare Cl - il trasporto mediato da canali anione selettivo purificati o trasportatori ricostituiti in liposomi. L&#39;esempio è stato utilizzato il procariote H + / Cl - Scambiatore CLC-EC1. Tuttavia, il metodo può essere facilmente adattato per studiare canali gated da ligandi 12,13,15, 11,12 tensione, o sportive diversa selettività anionico 15,16 sostituendo l&#39;Ag: Elettrodo AgCl con uno adatto ione in esame. E...

Negli ultimi due decenni la capacità di iperespressione e purificare proteine ​​di trasporto di membrana è drammaticamente aumentato: i canali ionici, trasportatori primari e secondari sono ormai di routine purificati da sistemi di espressione eterologhi e fonti naturali. Nuovi approcci per monitorare l&#39;espressione, di migliorare e facilitare l&#39;estrazione e migliorare la stabilità di queste proteine ​​sono in continua evoluzione 1-5. Queste innovazioni tecnologiche sono state fondamentali per innescare l&#39;esplosione di livello atomico informazioni sulla struttura delle proteine ​​di membrana che, a sua volta, migliorato la nostra comprensione delle basi strutturali della loro funzione. Al contrario, la nostra capacità di sondare le proprietà funzionali delle proteine ​​purificate non aumenta alla stessa velocità, in modo che in alcuni casi alta risoluzione informazione strutturale è accompagnato da dati qualitativi funzionali, limitando così la possibilità di verificare quantitativamente predizioni basati sulla struttura. Quindi, la SVILUPPOt di saggi funzionali quantitativi e generalizzabili è un passo fondamentale verso la delucidazione delle basi meccanicistiche della funzione delle proteine ​​di membrana. Qui si descrive un saggio di efflusso che può essere usato per determinare quantitativamente importanti proprietà funzionali purificati e ricostituiti Cl - canali e trasportatori. I principi alla base del dosaggio può essere generalizzati ad una varietà di sistemi di trasporto, nonché proteine ​​non-ionici trasporto. I liposomi vengono ricostituiti con purificati Cl - canale / trasportatori in presenza di un grande Cl - gradiente (Figura 1A, B). Cl - efflusso viene avviata mediante l&#39;aggiunta di uno ionoforo per consentire flusso contro-ione, nel nostro caso il K + ionoforo valinomicina, che shunt la tensione stabilita dal Cl - gradiente e impostare il potenziale di membrana iniziale al potenziale di equilibrio di K + 6,7. Senza tegli ionoforo significative netto Cl - verifica efflusso, in quanto è impedita dalla generazione di un potenziale transmembrana. I dati sono quantitativamente descritto da due parametri misurabili (Figura 1C): τ la costante di tempo di Cl - efflusso, e f 0, la frazione di liposomi contenenti una proteina attiva. Da τ e f 0 unitario Cl - velocità di trasporto, la frazione di proteine ​​attive e la massa molecolare del complesso attivo possono essere derivate 8. La tecnica è illustrata qui utilizzando proteoliposomi ricostituiti con CLC-EC1, un ben caratterizzato CLC-type H + / Cl - scambiatore di struttura e funzione nota. Questo saggio è facilmente generalizzabile a canali o trasportatori con selettività ionica differente o la cui attività dipende dalla presenza di tensione e / o leganti. Inoltre, questo test può essere utilizzato per determinare se piccole molecole influenzano direttamente la proteina ricostituito,per quantificare gli effetti di questi composti e come composizione membrana o reagenti ipolipemizzanti influiscono sulla funzione dei canali ricostituiti e trasportatori.

<table><tbody><tr><td>Liposomicatore, Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>&nbsp; Avanti Polar Lipids Inc.</td><td>610200</td><td></td></tr><tr><td>IEC Centra CL2 Thermo</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orion Research Model 701A Misuratore</td><td></td><td></td> digitale di pH-mV <td>Questi possono essere trovati su Ebay.</td></tr><tr>Sonda <td></td><td></td><td>di pH non funzionante</td><td>Qualsiasi sonda per pHmetro con fili d'argento funzionerà. Il rivestimento in vetro/plastica deve essere rimosso e i fili puliti.</td></tr><tr><td>DI-710 Data Logger</td><td>Strumenti DATAQ Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di acquisizione WinDAQ</td><td>Strumenti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DATAQ Colonne in plastica monouso Pierce, flusso per gravità, 2ml</td><td>Pierce (Thermo Scientific)</td><td>29922</td><td></td></tr><tr><td>Provette di coltura KIMAX, monouso, vetro borosilicato</td><td>Kimble Chase</td><td>73500-13100</td><td></td></tr><tr><td>Set di estrusori con supporto/blocco</td> <td>riscaldanteAvanti Polar Lipids Inc.</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a proteoliposome-based efflux assay per determinare le proprietà singola molecola di cl<sup&gt; -</sup&gt; canali e trasportatori

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Gli ultimi 15 anni sono stati caratterizzati da un'esplosione della capacità di sovraesprimere e purificare le proteine di membrana dagli organismi procarioti così come dagli eucarioti. Questo aumento è stato in gran parte guidato dal successo della spinta per ottenere informazioni strutturali sulle proteine di membrana. Tuttavia, la capacità di interrogare funzionalmente queste proteine non è progredita allo stesso ritmo ed è spesso limitata a saggi qualitativi di valore quantitativo limitato, limitando così le intuizioni meccanicistiche che possono fornire. Viene descritto un saggio per studiare quantitativamente l'attività di trasporto di canali o trasportatori di Cl- ricostituiti. Il test si basa sulla misura del tasso di efflusso di Cl- dai proteoliposomi in seguito all'aggiunta dello ionoforo K+ valinomicina per deviare il potenziale di membrana. Un elettrodo sensibile agli ioni viene utilizzato per seguire l'andamento temporale dell'efflusso ionico dai proteoliposomi ricostituiti con la proteina desiderata. Il metodo è particolarmente adatto per gli studi meccanicistici, in quanto consente la determinazione quantitativa delle proprietà chiave della proteina ricostituita, come la sua velocità di trasporto unitaria, la frazione di proteina attiva e la massa molecolare dell'unità funzionale. Il test può essere utilizzato anche per determinare l'effetto di composti di piccole molecole che inibiscono o attivano direttamente la proteina ricostituita, nonché per testare gli effetti modulatori della composizione della membrana o dei reagenti che modificano i lipidi. Ove possibile, il confronto diretto tra i risultati ottenuti con questa metodica è risultato in buona concordanza con quelli ottenuti con approcci elettrofisiologici. La tecnica è illustrata utilizzando CLC-ec1, uno scambiatore H+/Cl- di tipo CLC, come sistema modello. Il saggio di efflusso può essere utilizzato per studiare qualsiasi canale/trasportatore conduttore di Cl e, con modifiche minime, può essere adattato per studiare qualsiasi proteina che trasporta ioni.

Descriviamo un protocollo dettagliato e robusto per misurare Cl - il trasporto mediato da purificato CLC-EC1, un procariotico CLC-tipo H + / Cl - scambiatore, ricostituito in liposomi. Una rappresentazione schematica dell&#39;esperimento è mostrato in Figura 3 proteoliposomi ricostituiti con purificato CLC-CE1 e con alta Cl interna -. Sono immersi in una soluzione bagno contenente bassa Cl -. In queste condizioni net Cl - efflusso è imped...

I proteoliposomi vengono utilizzati per studiare canali purificati e trasportatori ricostituiti in un ambiente biochimico ben definito. Viene illustrata una procedura sperimentale per misurare l'efflusso mediato da queste proteine. Vengono descritti i passaggi per preparare i proteoliposomi, eseguire le registrazioni e analizzare i dati per determinare quantitativamente le proprietà funzionali della proteina ricostituita.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare quantitativamente l'attività di trasporto di canali o trasportatori del cloruro ricostituiti. Questo viene ottenuto innanzitutto ricostituendo il trasportatore purificato in liposomi a bassa densità, in modo che ogni liposoma contenga zero o una copia del complesso attivo. Dopo la rimozione degli ioni cloruro esterni, in modo da generare un gradiente ionico diretto all'esterno, i liposomi vengono aggiunti alla camera di registrazione, dove la concentrazione di cloruro viene monitorata mediante un elettrodo sensibile al cloruro. Successivamente, il flusso di cloruro dai liposomi viene avviato aggiungendo Val-Mycin, un ionoforo per lo ione potassio, che dissipa il potenziale di membrana.Una volta che il segnale raggiunge uno stato stazionario, l'esperimento viene terminato aggiungendo un detergente per sciogliere i liposomi. In definitiva, misurando la velocità di efflusso del cloruro da liposomi proteici, reidratati con un canale o un trasportatore purificato, è possibile determinare quantitativamente la velocità di trasporto unitaria e la stechiometria del complesso proteico attivo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri approcci esistenti, come le misurazioni del flusso basate sulla fluorescenza, è che con questo metodo è possibile determinare quantitativamente parametri chiave del trasportatore reidratato, come la velocità unitaria di turnover e la geometria del complesso.Oltre a fornire misure quantitative di questi parametri chiave, questo metodo può essere utilizzato per determinare rapidamente e con precisione l'effetto di mutazioni, molecole di piccole dimensioni e monitorare le subunità nella proteina di trasferimento ricostruita. L'allestimento per la registrazione è costituito da due camere, un elettrodo per cloruro, un pHmetro con uscita elettrica analogica o digitale, un digitalizzatore e un computer dotato di un software di acquisizione appropriato. Collegare l'elettrodo per cloruro al pHmetro, quindi collegare l'uscita del pHmetro al digitalizzatore, che è connesso al computer.Posizionare l'elettrodo di riferimento in una camera e il filo di registrazione nell'altra. Successivamente, posizionare le camere su una piastra agitatrice con la barretta magnetica nella camera di registrazione. Assicurarsi che la barretta magnetica non tocchi l'elettrodo.Collegare le camere utilizzando un ponte di agar la notte prima degli esperimenti. Far gonfiare un grammo di perline Cidex G 50 in 15 millilitri di tampone esterno con agitazione delicata per almeno tre ore a temperatura ambiente prima dell'uso. Ogni esperimento richiede circa tre millilitri di perline gonfie mentre i liposomi vengono scongelati a temperatura ambiente. Versare circa tre millilitri di perline G 50 gonfie in ciascuna colonna.Lasciarli asciugare per gravità. Far scorrere a temperatura ambiente. Questo richiede di solito da uno a due minuti.Successivamente, preparare le vescicole ulari estrudendo i liposomi proteici 11 volte attraverso un estrusore miniaturizzato utilizzando un filtro in teflon da 0,4 micron. Quindi, posizionare la colonna in un tubo di plastica con fondo rotondo e centrifugare per 20-30 secondi a 1400 G in una centrifuga clinica per rimuovere la soluzione in eccesso. Successivamente, proteggendo il flusso in uscita, posizionare la colonna in un tubo di vetro da 13 × 100 millimetri e aggiungere 100 microlitri delle vescicole estruse sulla colonna.Centrifugare la colonna per un minuto a 500 G. In una centrifuga clinica, raccogliere circa 200 microlitri del flusso passante, che verrà aggiunto alla camera di registrazione. Per eseguire la misurazione dell'efflusso, posizionare due millilitri di cloruro di potassio 100 millimolare nella camera di riferimento e 1,8 millilitri del tampone esterno nella camera di registrazione. Avviare il programma di acquisizione.Lasciare stabilizzare la linea di base. Questo può richiedere alcuni minuti. Una volta che il segnale raggiunge una linea di base stabile, iniziare la registrazione.Aggiungere 15 microlitri di una soluzione molare di cloruro di potassio per tarare il sistema. Quindi aggiungere i liposomi. Un piccolo salto potrebbe essere visibile a causa della rimozione incompleta del cloruro esterno dai liposomi proteici.Attendere finché la linea di base non si stabilizza. Successivamente, aggiungere CIN per avviare flx. Lasciare che FLX proceda per il suo corso temporale fino a quando non raggiunge un plateau.A questo punto, aggiungere 40 microlitri di beta Octa glucocide 1,5 M preparato nel buffer esterno per sciogliere tutti i liposomi. Attendere quindi da 10 a 15 secondi. Terminare la registrazione e procedere all'analisi dei dati come descritto nel protocollo testuale.Quando liposomi contenenti un'elevata concentrazione interna di cloruro vengono immersi in un ambiente a bassa concentrazione di cloruro, generando un gradiente di cloruro di 300 volte, non si osserva alcun flusso ionico netto. Questo perché i liposomi privi di proteine presentano una bassa permeabilità intrinseca agli ioni. Non si osserva alcun FLX macroscopico da liposomi prot recostituiti con il trasportatore di cloruro accoppiato a protoni, C-L-C-E-C uno.Poiché la piccola quantità di cloruro che esce dal vescicolo genera una carica netta positiva all'interno del liposoma, l'aggiunta di CIN permette agli ioni potassio di attraversare la membrana, alleviando il potenziale elettrico e avviando il flusso di cloruro. La reazione viene interrotta e la quantità totale di ioni cloruro contenuti nelle vescicole viene misurata per determinare le proprietà delle singole proteine recostituite. I dati grezzi del tracciato temporale dell'efflusso vengono inizialmente convertiti da millivolt a concentrazione di cloruro e successivamente normalizzati; quindi il tracciato temporale viene interpolato.È stato determinato che la costante di tempo dell'efflusso è di 41 secondi e la frazione di liposomi contenenti zero copie attive di C-L-C-E-C uno è pari a 0,31, indicando che circa un terzo dei liposomi contiene zero proteine attive. A partire da questi valori e misurando il contenuto di cloruro delle vescicole contenenti almeno una copia di C-L-C-E-C uno, è possibile determinare una velocità unitaria di trasporto di C-L-C-E-C uno pari a circa 2.500 ioni cloruro al secondo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare il tasso di turnover di un trasportatore. Questi esperimenti possono essere eseguiti in 10-15 minuti se effettuati con attenzione.È fondamentale valutare attentamente la qualità dei liposomi, poiché le perdite influiscono negativamente sulle stime della velocità di turnover.

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Introduciamo un digiuno a base di test a fluorescenza che controlla il tasso di estinzione di fluorescenza come una misura di attività del canale gramicidina. I canali gramicidina sono utilizzati come trasduttori di forza molecolare per monitorare i cambiamenti nelle proprietà del doppio strato lipidico, come rilevato da proteine ​​doppio strato spanning.

Gramicidina a base di fluorescenza di analisi, per determinare piccole molecole Potenziale Modifica delle proprietà del doppio strato lipidico

Questa dettagli del protocollo un metodo per la misura quantitativa della traslocazione peptidica in grandi vescicole lipidiche unilamellari. Questo metodo fornisce anche informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e può essere utilizzato per identificare i peptidi che in modo efficiente e spontaneamente croce doppi strati lipidici.

Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

Vi presentiamo un protocollo per lo studio in vitro delle pompe di efflusso da Pseudomonas aeruginosa. Questo protocollo consente la generazione di un robusto, reversibile e regolabile gradiente protonico all'interno della membrana del liposoma e quindi dovrebbe essere adattabile a qualsiasi proteina di membrana eccitato dalla forza protomotive.

In vitro Indagine della MexAB Efflux pompa da Pseudomonas aeruginosa

Descritto qui è una procedura rapida ed efficace per la ricostituzione funzionale di purificato wild-type e proteina CFTR mutata che preserva l'attività per questo canale del cloro, che è difettoso in fibrosi cistica. Efflusso ioduro da proteoliposomi ricostituiti mediati da CFTR permette studi di attività di canale e gli effetti di piccole molecole.

Ricostituzione funzionale e attività Canale Misure di purificata di tipo selvatico e mutante CFTR proteine

Il protocollo presentato descrive l'analisi del trasporto mediato da proteine di membrana a livello di singolo trasportatore utilizzando doppi strati lipidici privi di solventi che attraversano i pori. Ciò si ottiene grazie alla creazione di chip array di nanopori prodotti in serie, combinati con l'acquisizione e l'analisi dei dati altamente parallele, consentendo la futura creazione di screening degli effettori delle proteine di membrana.

Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Descriviamo un test basato sulla fluorescenza per misurare lo scrambling dei fosfolipidi in grandi liposomi unilamellari ricostituiti con opsina.

Un test fluorescenza a base di fosfolipidi Scramblase Activity

Questo protocollo descrive le tecniche utilizzate per determinare le strutture di canale ionico di cRIO-microscopia elettronica, compreso un sistema di baculovirus usato per esprimere in modo efficiente geni in cellule di mammiferi con minimo sforzo e tossicità, estrazione della proteina, purificazione, e controllo di qualità, preparazione del campione griglia e screening, nonché raccolta dati ed elaborazione.

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Qui, presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo molecolare della traslocazione di protoni attraverso le membrane del lipido di liposomi singoli, utilizzando citocromo bo3  come esempio. Combinando elettrochimica e microscopia a fluorescenza, le variazioni del pH in lumen del singole vescicole, contenenti singole o multiple enzima, possono essere rilevati e analizzati singolarmente.

Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

I nanocorpi sono strumenti importanti in biologia strutturale e rappresentano un grande potenziale per lo sviluppo di terapie. Tuttavia, la selezione di nanocorpi con proprietà inibitorie può essere impegnativa. Qui dimostriamo l'uso dell'elettrofisiologia basata sulla membrana supportata da solidi (SSM) per la classificazione di nanocorpi inibitori e non inibitori che prendono di mira i trasportatori di membrana elettrogenici.

Selezione di nanocorpi inibitori mirati al trasportatore mediante elettrofisiologia basata su membrana supportata da solidi (SSM)

Presentiamo un metodo economico per valutare la permeabilità della membrana liposomiale con sensibilità e risoluzione superiori rispetto alle tecniche convenzionali. Utilizzando una nuova reazione di sostituzione del ligando incapsulato, questa tecnica rileva i cambiamenti indotti dalla fosfolipasi A2 nelle membrane del modello. Facilmente integrabile con le analisi standard, questo approccio accessibile migliora la risoluzione per lo studio della biofisica delle membrane e delle interazioni...

Un saggio di permeabilità della membrana liposomica per studiare gli effetti dei gruppi fosfatidilinositolo fosfato sull'azione membranotropica del veleno PLA2

Scopri come misurare quantitativamente l'attività di trasporto dei canali del cloruro ricostituiti in proteoliposomi utilizzando un elettrodo sensibile al cloruro. Questo metodo permette di determinare la velocità unitaria di trasporto e la geometria del complesso proteico attivo.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl

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