A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl ^- Canali e trasportatori

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare quantitativamente l'attività di trasporto dei canali o trasportatori del cloruro ricostituiti. Ciò si ottiene ricostituendo prima il trasportatore purificato puro in liposomi a bassa densità in modo che ogni liposoma contenga zero o una copia del complesso attivo dopo aver rimosso gli ioni cloruro esterni in modo che vi sia un gradiente ionico diretto verso l'esterno, i liposomi vengono aggiunti alla camera di registrazione dove la concentrazione di cloruro viene monitorata utilizzando un elettrodo sensibile al cloruro. Il successivo flusso di cloruro dai liposomi viene avviato con l'aggiunta di Val Mycin, uno ionoforo di potassio, che sfrutta il potenziale di membrana.

Una volta che il segnale raggiunge lo stato stazionario, l'esperimento viene terminato con l'aggiunta di detergente per sciogliere i liposomi. In definitiva, misurando la velocità di efflusso di cloruro dai liposomi di protea, ricostituiti con un canale o trasportatore purificato, è possibile determinare quantitativamente la velocità di trasporto unitario e la stechiometria del complesso proteico attivo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri approcci esistenti, come le misure di flusso basate sulla fluorescenza, è che con questa tecnica è possibile determinare quantitativamente i parametri chiave del trasportatore ricostituito, come il tasso di turnover unitario e la geometria del complesso.

Oltre a fornire misure quantitative di questi parametri chiave, questo metodo può essere utilizzato per determinare rapidamente e con precisione l'effetto di piccole molecole di mutazione e monitorare le subunità nella proteina di trasferimento ricostituita. La configurazione di registrazione è composta da due camere, un elettrodo di cloruro, un pHmetro con uscita elettrica analogica o digitale, un digitalizzatore e un computer con apposito software di acquisizione. Collegare l'elettrodo di cloruro al pHmetro, quindi collegare l'uscita del pHmetro al digitalizzatore, che è collegato al computer.

Posizionare l'elettrodo di riferimento in una camera e il filo di ricodifica nell'altra. Quindi posizionare le camere su una piastra di agitazione con la barra di agitazione nella camera di registrazione. Assicurarsi che l'ancoretta non tocchi l'elettrodo.

Collegare le camere utilizzando un ponte di agar la notte prima degli esperimenti: gonfiare un grammo di perle di cidex G 50 in 15 millilitri di tampone esterno con agitazione delicata per almeno tre ore a temperatura ambiente prima dell'uso. Ogni esperimento richiede circa tre millilitri di perle gonfie mentre i liposomi si scongelano a temperatura ambiente. Versare circa tre millilitri di perline gonfie da 50 g in ogni colonna.

Lasciateli asciugare per gravità. Flusso a temperatura ambiente. Questo di solito richiede uno o due minuti.

Quindi, preparare le vescicole ulari estrudendo i liposomi di protea 11 volte attraverso un mini estrusore utilizzando un taglio di teflon da 0,4 micron. Quindi posizionare la colonna in una centrifuga di plastica a fondo tondo per 20-30 secondi a 1400 G in una centrifuga clinica per rimuovere la soluzione in eccesso. Dopodiché, proteggendo il flusso, posizionare la colonna in un tubo di vetro di 13 x 100 millimetri e aggiungere 100 microlitri di vescicole estruse alla colonna.

Far girare la colonna per un minuto a 500 G.In una centrifuga clinica, raccogliere circa 200 microlitri del flusso attraverso il quale verrà aggiunto alla camera di registrazione. Per eseguire la misurazione dell'efflusso, posizionare due millilitri di cloruro di potassio da 100 millimolari nella camera di riferimento e 1,8 millilitri di tampone esterno nella camera di registrazione. Avvia il programma di acquisizione.

Lascia che la linea di base si equilibri. L'operazione potrebbe richiedere alcuni minuti. Una volta che il segnale raggiunge una linea di base stabile, avviare la registrazione.

Aggiungere 15 microlitri di una soluzione di cloruro di potassio molare marrone chiaro per calibrare il sistema. Quindi aggiungi i liposomi. Un piccolo salto potrebbe essere visibile a causa della rimozione incompleta del cloruro esterno dai liposomi della protea.

Attendere che la linea di base si stabilizzi. Quindi, aggiungi CIN per avviare flx. Lascia che l'FLX esegua il suo corso temporale fino a quando non si stabilizza.

A questo punto, aggiungere 40 microlitri di 1,5 molari beta Octa glucocide preparato nel tampone esterno per sciogliere tutti i liposomi. Quindi attendi da 10 a 15 secondi. Terminare la registrazione e procedere all'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.

Quando i liposomi contenenti un alto contenuto di cloruro interno vengono immersi in un basso contenuto di cloruro producendo un gradiente di cloruro di 300 volte, non si osserva alcun flusso netto di ioni. Questo perché i liposomi privi di proteine hanno una bassa permeabilità intrinseca agli ioni. Non si osserva FLX macroscopica dai liposomi prot ricostituiti con il trasportatore di cloruro accoppiato a protoni, C-L-C-E-C.

Poiché la piccola quantità di cloruro che esce dal vesco accumula una carica positiva netta nel liposoma, l'aggiunta di CIN consente agli ioni potassio di muoversi attraverso la membrana, alleviando il potenziale elettrico e avviando il cloruro flx. La reazione viene terminata e la quantità totale di ioni cloruro contenuti nelle vescicole viene misurata per determinare le proprietà delle singole proteine ricostituite. I dati grezzi dell'andamento temporale dell'efflusso vengono prima convertiti da millivolt a una concentrazione di cloruro e quindi normalizzati, l'andamento temporale viene quindi adattato.

È stato determinato che la costante di tempo dell'efflusso è di 41 secondi e la frazione di liposomi contenente zero copie attive di C-L-C-E-C è il punto 31, indicando che circa un terzo dei liposomi contiene zero proteine attive da questi valori e misurando il contenuto di cloruro di vescicole contenenti almeno una copia di C-L-C-E-C uno, è possibile determinare una velocità di trasporto unitaria di C-L-C-E-C pari a circa 2.500 ioni cloruro al secondo. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come determinare la necessità di fatturato di un trasportatore. Questi esperimenti possono essere eseguiti in 10-15 minuti se eseguiti con attenzione.

È fondamentale valutare attentamente la qualità dei liposomi poiché le perdite influiscono negativamente sulle stime del tasso di turnover.