Preparazione cellule aderenti per X-ray Fluorescence Imaging da Chemical Fixation

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere un'immagine della distribuzione dei metalli in una popolazione cellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando finestre sterili in nitruro di silicio, quindi coltivando le cellule su tali finestre. Successivamente, le cellule vengono fissate, risciacquate in un buffer compatibile ed essiccate.

L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire le immagini delle cellule alla linea di fascio. In definitiva, la microscopia da fluorescenza a raggi X viene utilizzata per mostrare la distribuzione dei metalli all'interno della cellula. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà poiché le finestre sono molto fragili.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la coltivazione delle cellule sulle finestre con aggregazione cellulare minima, così come le fasi di risciacquo, risultano complesse in quanto le cellule non aderiscono bene ai substrati fluorescenti a raggi X. Il primo passaggio consiste nell'isolare la finestra. Inizialmente, utilizzando uno stereomicroscopio, assicurarsi che una coppia di pinzette fini a punta inversa sia perfettamente allineata e pulita.

Successivamente, aprire leggermente la capsula contenente la finestra. Premere un'estremità contenente la finestra ruotando l'altra estremità. Non premere direttamente sulla finestra.

Quindi afferrare con attenzione il telaio con le pinzette, comprimendo delicatamente la capsula vicino all'estremità aperta. Applicare pressione per allargare la capsula nel punto in cui devono uscire i bordi della finestrella ed estrarre la finestrella. Preparare ora del nastro adesivo.

Posizionare un pezzo di nastro adesivo su un vetrino pulito e tagliare una striscia lunga un quarto di pollice dal lato lungo del vetrino. Quindi posizionare un vetrino con il nastro sul lato corto e rimuovere la sezione di nastro con le pinzette. Applicare il nastro sul bordo della finestra esercitando una pressione sufficiente per farlo aderire, avendo cura di non coprire l'apertura della finestra con il nastro.

Utilizzando le pinzette, posizionare la finestra nella parte inferiore di una piastra per colture e premere con fermezza il nastro adesivo sulla piastra. Ripetere quindi il procedimento per fissare con il nastro adesivo l'altro lato della finestra. La piastra deve ora essere sterilizzata con raggi UV per un'ora.

Questo protocollo richiede che le cellule vengano coltivate fino a una confluenza del 50-70% in piastre contenenti la finestra allegata. Eventuali colorazioni vitali applicate e le cellule devono essere analizzate mediante imaging prima di procedere con la fissazione. Rimuovere il mezzo mediante aspirazione delicata, inclinando la piastra di un angolo di 45 gradi.

Quindi risciacquare delicatamente la piastra con DPBS. Sostituire immediatamente il liquido rimosso aggiungendo con delicatezza del P-F-A-P-B-S fresco al 4% ad un angolo di 45 gradi e lungo il lato della piastra. Ridurre lentamente l'angolo in modo che la soluzione fissativa ricopra completamente le finestre.

Lasciare il fissativo sulle cellule per 20 minuti dopo la fissazione. Rimuovere il liquido mediante aspirazione delicata. Utilizzando la stessa tecnica delicata utilizzata in precedenza, sostituire delicatamente il liquido con le pipette.

Soluzione di saccarosio. La tecnica per rimuovere e sostituire il liquido è fondamentale perché le cellule aderiscono male ai substrati. È proprio in questo passaggio che molti principianti hanno avuto insuccesso nei loro esperimenti.

Sostituire quindi delicatamente la soluzione di saccarosio per rimuovere qualsiasi fissante residuo. A questo punto, rimuovere la finestra staccando il nastro con una pinzetta. Se le finestre si staccano dal nastro, far galleggiare la finestra in superficie aggiungendo soluzione ed estrarla con pinzette invertite.

Ora, senza toccare la finestra, asciugare accuratamente qualsiasi soluzione dal bordo. Inoltre, asciugare l'area incavata utilizzando una piega arrotondata di carta da filtro. L'obiettivo è ridurre al minimo la cristallizzazione di sale o tampone sulla finestra.

Infine, posizionare con attenzione la finestra sulla griglia appoggiata su un bordo contro la cresta del tappetino. La finestra dovrebbe toccare il minimo possibile del tappetino. Una volta che il campione è asciutto, verificare la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico.

Dopo aver confermato che le cellule sono presenti sulle finestre, imballare le finestre per il trasporto alla linea di fascio del sincrotrone. Fissare delicatamente le finestre su due lati a un vetrino utilizzando del nastro adesivo. Quindi fissare il vetrino a una piastra di Petri di plastica e chiudere la piastra con del nastro adesivo.

Fino a questo punto, i passaggi possono essere eseguiti in qualsiasi laboratorio tipico; i passaggi seguenti è invece preferibile svolgerli presso una linea di luce di sincrotrone. L'apertura della finestra inizia rimuovendo delicatamente il nastro con delle pinzette. Successivamente, la finestra viene trasferita in un supporto di alluminio fornito dai collaboratori della linea di luce presso il sincrotrone.

Fissare la finestra con un sottile strato uniforme di vernice per unghie lungo il suo bordo. Inserire ora il supporto in alluminio in un attacco cinematico. Fissare l'attacco a un supporto collegato alla piattaforma motorizzata situata all'interno della camera del campione e allineata al fascio del microscopio a raggi X.

Dopo essere usciti dall'area dello strumento del microscopio a raggi X della linea guidata, configurare la scansione utilizzando il software specifico della linea guidata. Scegliere l'area appropriata del campione da scansionare osservando la posizione del fascio di raggi X sul campione. Utilizzando una telecamera dotata di croce reticolare video e precedentemente allineata con una telecamera scintillatore a valle, ulteriori dettagli sono forniti nel protocollo testuale.

Utilizzando queste tecniche nelle immagini a raggi X di un campione, è possibile osservare una variazione negli elementi presenti, indicando che la fissazione preserva questi aspetti delle cellule, come nel caso di questa cellula umana HSY five Y. Tuttavia, se durante l'essiccazione rimane presente del buffer, si forma una cristallizzazione estesa che provoca danni strutturali alle cellule e interferisce con l'acquisizione degli spettri fluorescenti a raggi X. Questo fenomeno è visibile in una cellula RET B 1 0 3 mal processata.

Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare cellule aderenti mediante fissazione chimica per l'immagine di fluorescenza a raggi X. Non dimenticare che lavorare con formaldeide e materiali biologici può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale (PPE) e il rispetto delle linee guida istituzionali durante l'esecuzione di questa procedura.