Name: Rilevazione di origine alimentare batterica Pathogens da mosche individuale Filth (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Scopri un metodo PCR rapido per rilevare patogeni alimentari come Salmonella enterica, Cronobacter spp. e Listeria monocytogenes da singole mosche selvatiche. Questa tecnica supporta le indagini sulle epidemie alimentari.

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Grazie a Ben D. Tall, Yi Chen e Thomas Hammak della Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti, Centro per la Sicurezza Alimentare e la Nutrizione Applicata (CFSAN) per aver esaminato criticamente il manoscritto. Gli autori ringraziano anche Hannah Lee (programma di tirocinio di ricerca, Joint Institute for Food Safety and Applied Nutrition (JIFSAN), University of Maryland) per l'assistenza di laboratorio e David Weingaertner (FDA, CFSAN) per aver preparato la figura della panoramica schematica mostrata nel video.

1. Raccolta di mosche <ol><li> Raccogliere singoli mosche sterili utilizzando reti spazzata entomologiche. Mettere le reti in un dispositivo di raffreddamento e trasferirli al laboratorio. </li></ol> 2. Dissection of Flies <ol><li> Immobilizzare mosche asetticamente raccolti mettendoli a -20 ° C per 5-7 min. </li><li> Utilizzando una pinza sterile luogo una mosca in una provetta sterile da 2 ml contenente 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C), acqua peptonata tamponata (BPW). Mescolare il tubo delicatamente per inversione per 2 min. È essenziale che l&#39;intero corpo della mosca sia a contatto con il materiale in modo che la flora batterica presente sulla superficie del corpo (S) della mosca sarà trasferito al BPW (BPW-S). Etichettare la provetta con un numero e parte del corpo del fly (cioè 1S). NOTA: Si prega di vedere la tabella di reagenti specifici / Attrezzature per una descrizione dettagliata dei materiali e reagenti citati in questo protocollo. </li><li> Utilizzando pinze sterili rimuovere al volo da parte dei media e il trasferimento BPW-Sad un tubo vuoto e pulito 2 ml di superficie disinfettare la mosca. Incubare la provetta contenente il supporto BPW-S a 37 ° C durante l&#39;esecuzione del protocollo di disinfezione e dissezione. <ol><li> Surface-disinfettare la mosca immergendolo in 1 ml di etanolo al 70% per 1 min, seguiti da un risciacquo con acqua distillata sterile prima immergendola in 1 ml di preparato fresco 0,05% (v / v) soluzione di candeggina. Lavare 3 volte con acqua distillata sterile. Trasferire l&#39;acqua dall&#39;ultimo risciacquo ad un tubo autoclavato 2 ml. NOTA: Eliminare il liquido ogni volta utilizzando una micropipetta 1.000 ml o invertendo il tubo, assicurandosi che il volo è all&#39;interno del tubo. Mescolare delicatamente capovolgendo in ogni fase del processo di superficie di disinfezione. </li><li> Per valutare l&#39;efficacia del processo di disinfezione, trasferire 100 ml di acqua dal dell&#39;ultimo risciacquo ad una piastra TSA (TSA) e diffondere mediante un sterile ad L spreader monouso. Incubare la piastra a 37 ° C per 24 ore. Dopo incubation, registrare la presenza di eventuali colonie batteriche. NOTA: La presenza di colonie batteriche sulle piastre TSA indica un processo di superficie-disinfezione inefficiente. In questo caso, la presenza di patogeni deve essere riportato solo sulla superficie del corpo della mosca perché la contaminazione incrociata tra la superficie corporea e il canale alimentare non può essere esclusa. </li></ol></li><li> Dopo superficie disinfezione al volo, il trasferimento a un pezzo di carta assorbente per eliminare autoclavato acqua in eccesso e quindi ad un 60 millimetri piastra di Petri sterile monouso. </li><li> Porre la capsula di Petri in un ambito di dissezione e di identificare al volo per il livello di specie mediante i tasti dicotomiche per le famiglie ditteri 20,21. </li><li> Utilizzando autoclave pinze punta fine tirare delicatamente l&#39;ano e l&#39;intero canale alimentare (A) fuori al volo e asetticamente trasferisca ad un altro tubo 2 ml sterile contenente 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C), BPW con 0,5 millimetri zirconia / silicio perline (BPW-A). Label the tubo con lo stesso numero selezionato per la mosca individuale e la parte del corpo della mosca (cioè, 1A). </li><li> Mescolare il tubo contenente la BPW-A accuratamente per 5 - 10 minuti con un distruttore cellulare. Incubare a 36 ± 1 ° C durante l&#39;esecuzione del resto del protocollo. </li><li> Per buono e / o conservare il campione per lungo termine, posizionare il resto della mosca in una provetta pulita 2 ml e aggiungere 1 - 2 ml di etanolo al 95%. </li></ol> 3. Arricchimento primaria e secondaria <ol><li> Etichettare tutti i tubi di arricchimento primaria e secondaria contenenti supporti secondo il numero del campione e la parte del corpo della mosca. </li><li> Sotto una cappa sterile, trasferire 300 ml di BPW-S (di superficie) a sterili 2 ml provette contenenti i seguenti supporti: <ol><li> Per Salmonella, utilizzare 1 ml di pre-riscaldato (42 ° C) BPW. Incubare a bagnomaria ricircolo a 42,5 ° C per 22 - 24 ore. Per arricchimento secondario, trasferire 100 ml di BPW arricchito a 400 &amp; #181; l di pre-riscaldato (37 ° C) per infusione cuore cervello (BHI) brodo precedenza immesso in provette sterili di cluster. Incubare a 37 ° C per 3 ore. </li><li> Per Cronobacter, utilizzare 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) BPW con novobiocina (10 mg / l; Wallace, M., comunicazione personale). In alternativa, utilizzare 1 ml di R &amp; F Enterobacter sakazakii brodo di arricchimento con supplemento (vancomicina e cefsulodina) come arricchimento primario. Incubare a 37 ° C per 22-26 ore. Per arricchimento secondario, trasferire 100 ml di BPW arricchito con novobiocina a 400 ml di pre-riscaldato (37 ° C) BHI brodo precedentemente collocati in provette sterili a grappolo. Incubare a 37 ° C per 3 ore. </li><li> Per L. monocytogenes, utilizzare 1 ml di appena preparato RT 24 brodo di arricchimento di Listeria (24 LEB) con supplemento selettivo. Incubare a 37 ° C per 44 ± 5 ​​ore. Non è richiesto alcun arricchimento secondario per la rilevazione di L. monocytogenes. </li&gt; <li> Ripetere i punti 3.2.1 - 3.2.3 utilizzando il tubo etichettato come BPW-A. </li></ol></li></ol> 4. Preparazione del sistema PCR-Based per l&#39;amplificazione e la rilevazione del target di origine alimentare patogeni I passaggi 4-8 utilizzare un sistema commerciale PCR cycler / detector, una postazione computer, e kit pronti per l&#39;uso per lo screening per Salmonella (Salmonella 2 kit di analisi standard), specie Cronobacter (E. sakazakii kit test standard), e Listeria monocytogenes (L. monocytogenes kit assay 24E). Test standard utilizzano PCR rilevamento end-point. Ogni kit contiene compresse PCR-ready con un colorante intercalante che emette un segnale di fluorescenza quando legame al DNA a doppia elica. Il segnale viene acquisito durante la fase di rilevamento del programma di sistema PCR, generando una curva di fusione che viene interpretato dal software come positivi o negativi. <ol><li> Preparare reagenti e attrezzature, come specificato dal ManufactuProtocollo di rer per ogni patogeno bersaglio di origine alimentare. NOTA: I protocolli per il rilevamento di Salmonella e Cronobacter richiedono una procedura di lisi un passo, mentre il protocollo per la rilevazione L. monocytogenes richiede una procedura di lisi due fasi (vedere paragrafi 5 e 6, rispettivamente). </li><li> Attivare il blocco automatico di riscaldamento selezionare il programma specifico per il patogeno bersaglio. In alternativa, se i blocchi di riscaldamento sono manuali, impostare temperature fino a 37 ° C (per Salmonella, Cronobacter spp, e L. monocytogenes.) Oppure a 55 ± 2 ° C (per L. monocytogenes parte 2 di lisi - vedere il punto 6.2) e 95 ± 3 ° C. </li><li> Assicurarsi che i blocchi di raffreddamento sono stati refrigerati O / N, altrimenti li rilassarsi a 2 - 8 ° C per almeno 2 ore. </li><li> Utilizzando il software del sistema di rilevamento basato su PCR, creare un file di rack di seguendo le istruzioni del produttore. </li><li> Etichettare e disporre di clustertubi contenente il reagente di lisi nel rack, in base al file rack. </li><li> Inizializzare lo strumento sistema di rilevamento basato su PCR. </li></ol> 5. Eseguire Lysis per il rilevamento di Salmonella e Cronobacter <ol><li> Preparare il reagente di lisi aggiungendo 150 ml di proteasi a una bottiglia 12 ml di tampone di lisi. </li><li> Trasferire 200 ml di reagente di lisi a ciascuno dei tubi di cluster precedentemente etichettati. NOTA: provette cluster contenente il reagente di lisi possono essere conservati a 2 - 8 ° C fino a 2 settimane. </li><li> Utilizzando puntali per pipette lunghi, il trasferimento di 20 ml di campioni arricchiti secondari (vedere i passi 3.2.1 e 3.2.2) per corrispondenti provette di cluster contenenti 200 ml di reagente di lisi. Utilizzare nuovi puntali per pipette per ciascun campione. NOTA: Mantenere tubi da arricchimento primaria e secondaria in frigorifero (Salmonella) o RT (Cronobacter) per ulteriori analisi conferma di campioni PCR-positive / negative. </li&gt; <li> Preparare controlli negativi con l&#39;aggiunta di 20 ml di mezzi BHI sterile tubi a grappolo contenenti 200 ml di reagente di lisi. </li><li> Preparare controlli positivi con l&#39;aggiunta di 20 ml di O / N colture batteriche (cresciute in BHI) di qualsiasi Salmonella conosciuto o ceppo Cronobacter ai tubi di cluster contenenti 200 ml di reagente di lisi. </li><li> Tubi di cluster Cap e fissare saldamente con lo strumento di tappatura. </li><li> Inserire la griglia di tubi di cluster nel blocco automatico di riscaldamento dopo la selezione del programma specifico per il patogeno bersaglio. In alternativa, incubare tubi di cluster a 37 ± 2 ° C per 20 minuti, seguita da incubazione a 95 ± 3 ° C per 10 min. Infine, trasferire i tubi di cluster per blocchi di raffreddamento (2 - 8 ° C) per 5 min. NOTA: provette cluster contenente il lisato possono essere conservati a -20 ° C fino a 2 settimane. </li></ol> 6. Eseguire Lysis per il rilevamento di L. monocytogenes <ol><li> Eseguire prima parte dilisi come segue: <ol><li> Aggiungere 1,8 ml di acqua deionizzata sterile per la bottiglia di completamente scongelati agente lisi 1. NOTA: Conservare agente 1 lisi a 2 - 8 ° C fino al momento dell&#39;uso. Dopo l&#39;apertura e la diluizione, conservare a RT (20 - 30 ° C) per un massimo di 6 mesi. </li><li> Combina agenti lisi 1 e 2 in un rapporto di 4: 1 (40 ml di diluito agente lisante 1 e 10 ml di agente 2 per ogni campione di lisi). Trasferire 50 ml di agenti lisi combinati a grappolo tubi. Utilizzare l&#39;impasto entro 4 ore. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di campione arricchito primaria (vedi punto 3.2.3) per il tubo cluster contenente 50 ml di agenti lisi combinate. </li><li> Preparare un controllo negativo con l&#39;aggiunta di 500 ml di sterile 24 LEB a 50 ml di agenti lisi combinate. </li><li> Preparare un controllo positivo con l&#39;aggiunta di 500 ml di O / N L. cultura monocytogenes coltivato in 24 LEB a 50 ml di agenti lisi combinate. </li><li> Tappare le provette a grappolo, mescolare delicatamente e luogonel blocco di riscaldamento a 37 ± 1 ° C per 30 min. NOTA: Mantenere i tubi di arricchimento primario in frigorifero per ulteriori analisi conferma di campioni PCR-positivi / negativi. </li></ol></li><li> Eseguire parte 2 di lisi come segue: <ol><li> Preparare il reagente di lisi come indicato nei punti 5.1 e 5.2. </li><li> Utilizzando punte per pipette lungo trasferimento 20 l di parte un lisato di tubi a grappolo contenenti 200 ml di reagente di lisi. Utilizzare nuovi puntali per pipette per ciascun campione. </li><li> Tubi di cluster Cap e fissare saldamente con lo strumento di tappatura. </li><li> Tubi Luogo di cluster in blocco automatico di riscaldamento la selezione del programma specifico di L. monocytogenes. In alternativa, incubare tubi di cluster a 55 ± 2 ° C per 30 minuti, seguita da incubazione a 95 ± 3 ° C per 10 min. Infine, trasferire i tubi di cluster per blocchi di raffreddamento (2 - 8 ° C) per 5 min. NOTA: provette cluster contenente il lisato possono essere conservati a -20 ° C fino a 2 settimane. </li></ol></li></ol> Compresse 7. Hydrate PCR-Ready <ol><li> Selezionare un (4 ° C), blocco di raffreddamento PCR refrigerata e posizionare un tubo cremagliera PCR sull&#39;inserto. </li><li> Posizionare corrispondente provette PCR contenenti le compresse PCR-ready (in dotazione con ogni kit) per il patogeno bersaglio di origine alimentare nel supporto, in base al file rack. </li><li> Utilizzando lo strumento decapping, rimuovere con attenzione i tappi di PCR-tubi. Eliminare i tappi e verificare che ogni tubo contiene una compressa. </li><li> Trasferire 50 ml (per Salmonella e Cronobacter) o 30 ml (per L. monocytogenes) del lisato di provette PCR specifici. Utilizzare nuovi tappi ottici e fissare saldamente sulle provette PCR utilizzando lo strumento di tappatura. NOTA: Dopo aver aggiunto il lisato di PCR-ready tablet, i campioni devono rimanere fresco a 2-8 ° C fino a quando caricato nel sistema di rilevazione basato su PCR. I tubi PCR possono essere centrifugati a 2500 xg per alcuni secondi per assicurare che il volume totale è nel fondo tegli tubo. </li><li> Caricare le provette PCR nello strumento sistema cycler / rilevamento PCR aprendo il cassetto dello strumento. </li><li> Inserire la griglia di tubi PCR nei pozzetti nel cassetto e controllare che i tubi sono posizionati correttamente. </li><li> Chiudere il cassetto e avviare il programma, come descritto dal protocollo del produttore. NOTA: Lo strumento basato su PCR ha preimpostato parametri ciclistici per ogni agente patogeno di origine alimentare. </li><li> Verificare che la barra di stato ciclismo PCR visualizza una barra blu che indica che la parte di amplificazione del programma è in esecuzione. NOTA: per PCR standard, il tempo di elaborazione del programma completo (amplificazione e rivelazione) dura circa 3-3,5 ore per completare. </li></ol> 8. Verifica dei risultati <ol><li> Al termine dell&#39;elaborazione, seguire le istruzioni sullo schermo dello strumento sistema basato su PCR per rimuovere campioni e risultati del riesame. </li><li> Se il patogeno bersaglio origine alimentare è presente nel campione (sia lasuperficie o il canale alimentare del volo) il pozzo è di colore rosso con un segno &#39;più&#39; (positivo). Se l&#39;agente patogeno è assente, il pozzo è verde con un segno &#39;meno&#39; (negativo). </li><li> Se il bene è di colore giallo con la barra trasversale rossa al centro, indica un errore di segnale. </li></ol> 9. Isolamento di Bacterial Pathogens da risultati PCR-positivi <ol><li> Selezionare i tubi dal primario (per L. monocytogenes) o secondaria (per Salmonella e Cronobacter) arricchimento di quei campioni che erano PCR-positivi. Inoltre, selezionare casualmente 3 - 5% dei campioni che erano PCR-negativi e procedere come segue: </li><li> Per Salmonella: <ol><li> Aggiungere 100 ml di media arricchimento secondario a 10 ml di Rappaport-Vassiliadis (RV) medium e 1 ml di Tetrathionate (TT) brodo. Incubare le provette a 42,5 ° C in un bagno d&#39;acqua di ricircolo per 22 - 24 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, striscia un&#39;ansata 3 mm (10 ml) di ciascuno, un RVd supporto TT su solfito di bismuto (BS) agar, xilosio lisina desossicolato (XLD) agar, e Hektoen enterica (HE) agar. Incubare le piastre a 35 ± 1 ° C per 22 - 24 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, esaminare le piastre per la presenza di colonie tipiche di Salmonella su ogni supporto. Se non colonie isolate possono essere ottenuti dopo diversi passaggi sub-coltura, considerare il campione come negativo e riferire come un falso positivo per il sistema basato su PCR. NOTA: Per colonie tipiche di Salmonella su supporti specifici vedono 22. Selezionare cinque presunte colonie tipiche di Salmonella e subcoltura su BS, XLD, o HE fino ad ottenere colture pure di isolati / singole colonie. </li><li> Selezionare una colonia pura e identificare Salmonella presuntiva utilizzando test commerciali biochimici, come la carta di VITEK 2 identificazione o API sistema di identificazione biochimica, seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Per Cronobacter: &lt;ol&gt; <li> Streak un&#39;ansata 3 mm (10 ml), dei mezzi di comunicazione di arricchimento secondario su due lastre di terreni di coltura cromogeni come R &amp; F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) medio placcatura cromogeno, e / o chromID sakazakii Agar. Incubare le piastre a 35 ° C per 22 - 24 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, esaminare le piastre per la presenza di colonie Cronobacter tipiche (blu-nero al blu-grigio). Selezionare 5 colonie Cronobacter presunte e sottocultura su R &amp; F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) medio placcatura cromogeno, chromID sakazakii Agar, o TSA fino colture pure di isolati / singole colonie sono ottenuti. NOTA: Se non colonie isolate possono essere ottenuti dopo vari passaggi sub-coltura, considerare il campione come negativo e riferire come un falso positivo per il sistema di rilevamento basato su PCR. </li><li> Selezionare una colonia pura e identificare Cronobacter presuntiva utilizzando commer biochimicaTest ciali come la carta VITEK 2 identificazione o API 20E sistema di identificazione biochimica, seguendo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Per L. monocytogenes: <ol><li> Streak un&#39;ansata 3 mm (10 ml), dei mezzi di comunicazione di arricchimento primario su due lastre di Brilliance Listeria agar (BLA). Incubare le piastre a 36 ± 1 ° C per 22-26 ore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, esaminare le piastre per la presenza di presunta L. monocytogenes (blu-verde) colonie. Selezionate 5 presuntiva L. monocytogenes colonie e loro sottocultura su BLA fino ad ottenere colture pure di isolati / singole colonie. Re-incubare le piastre negative a 36 ± 1 ° C per un ulteriore 22-26 ore. </li><li> Selezionare una colonia pura e identificare presuntiva L. monocytogenes utilizzando test biochimici commerciali come la carta VITEK 2 identificazione o API Listeria sistema di identificazione biochimica, seguendo i del costruttoreSTRUZIONI. </li></ol></li><li> Patogeni di origine alimentare presunti isolati da insetti devono essere ulteriormente confermate e sierotipizzati in un laboratorio di riferimento. </li></ol>

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L'uso di strumentazione specificata non è un'approvazione da parte della Food and Drug Administration degli Stati Uniti. Gli autori certificano che non vi è alcun conflitto di interessi con alcuna organizzazione finanziaria in merito al materiale discusso in questo articolo.

Studi precedenti che hanno rilevato gli agenti patogeni di origine alimentare dagli insetti selvatici hanno utilizzato una grande varietà di protocolli che potrebbero non includere le informazioni necessarie per valutare con precisione i rischi alimentari legati alla presenza di una mosca in alimenti o ambienti legati all&#39;alimentazione 13,15, 23,24. Qui, abbiamo dimostrato che l&#39;utilizzo di questo protocollo standardizzato, è possibile rilevare e isolare Cronobacter spp., S. enterica, e L. monocytogenes dalla superficie del corpo e del canale alimentare dei singoli mosche catturati in natura. Poiché gli insetti possono trasportare un numero ridotto di patogeno bersaglio di origine alimentare e un numero elevato di altri microbiota indigeno 25,26, questo protocollo richiede arricchimento primario (e talvolta secondaria) dei campioni in terreni di coltura specifici per aumentare la sensibilità di rilevamento del patogeno bersaglio di origine alimentare . I risultati del sistema di rilevazione basato sulla PCR sono stati ottenuti entro circa 30 ore (per il detection di Cronobacter spp. e S. enterica) e 48 ore (per il rilevamento di L. monocytogenes) dopo l&#39;elaborazione iniziale dei campioni. Così, questo protocollo è affidabile e rapido ed abbastanza sensibile per lo screening una mosca per la presenza di patogeni. Conferma dei risultati PCR-positivi e l&#39;isolamento di batteri vitali è parte della procedura standard di molti laboratori. Inoltre, a fini epidemiologici, colture batteriche pure da campioni PCR-positivi sono tenuti a confermare ulteriormente e il sierotipo del patogeno di origine alimentare utilizzando biochimici, immunologici, o metodi genetici. Anche se non sono state osservate falsi positivi quando rileva S. enterica e L. monocytogenes dalle parti del corpo dei singoli mosche catturati, con questo protocollo, abbiamo trovato fino ad un tasso del 50% di falsi positivi per Cronobacter spp. Ciò suggerisce che il sistema di rilevazione basato sulla PCR per il genere CronobactER possono attraversare-reagire con altre Enterobacteriaceae presente tra il molto complesso microbiota portato dalle mosche. Pertanto, l&#39;isolamento e la purificazione di colonie puri del Cronobacter genere da campioni PCR-positivi richiedono placcatura più selettivo rispetto agli altri patogeni valutati. Questo protocollo è stato soprattutto standardizzato per lo screening individuale mosche-selvatici catturati per la presenza di Cronobacter spp., S. enterica, e L. monocytogenes utilizzando un sistema di rilevamento basato su PCR commerciale. Tuttavia, questo protocollo è stato anche facilmente adattato per schermare singole parti del corpo di mosche per la presenza di altri patogeni quali enteroemorragica E. coli O157: H7 (utilizzando E. coli O157: H7 MP kit di dosaggio standard o E. coli O157: H7 kit di analisi in tempo reale) e la E. shiga-tossigenici coli (STEC) gruppo (utilizzando la suite di STEC in tempo reale), sensibilità ottenendo&gt; 80% (Annulla pubblicazionedati ndr). Inoltre, questo protocollo può potenzialmente essere adattata per rilevare patogeni di origine alimentare da altri insetti che sono noti vettori di malattie (scarafaggi e formiche), ma più ricerca in questo campo è necessario. Origine alimentare indagini malattia focolai sono molto dinamici e comprendono un processo multi-step che può variare a seconda della situazione specifica e l&#39;ambiente locale indagato 12,27. Queste indagini sono importanti perché forniscono immediata protezione della salute pubblica prevenendo malattie future. Inoltre, queste indagini possono chiarire nuovi meccanismi con cui i microrganismi di origine alimentare sono diffuse, e sollevare questioni importanti che portano a nuove aree di ricerca 28. Tecniche investigative nonché protocolli standardizzati, rapidi, e sensibili sono necessari per la rilevazione di agenti patogeni di origine alimentare dai singoli insetti. Questo protocollo standardizzato apre la possibilità di raccogliere in modo asettico insetti come mosche, which può vettore del batterio patogeno di origine alimentare, come parte di un programma di campionamento ambientale. Le informazioni epidemiologiche che si possono ottenere da questo sarebbe di impiego nella costruzione di un quadro preciso dei meccanismi di trasmissione di agenti patogeni di origine alimentare dagli insetti (cioè, la durata del tempo di esposizione: una mosca atterrando contro mosche atterraggio, defecare, e rigurgitare). Infine, anche se il sistema di rilevamento basato su PCR commerciale qui descritto è pratico da usare e semplifica amplificazione PCR e visualizzazione di un amplicone-livello di genere, è affatto l&#39;unico sistema appropriato. Il lisato da campioni arricchiti potrebbe in alternativa essere usato per individuare la presenza di agenti patogeni di origine alimentare utilizzando pubblicamente disponibili coppie di primer specifici per specie. Tuttavia, la sensibilità di rilevazione deve essere dimostrata prima del loro utilizzo.

Insetti svolgono un ruolo importante nella trasmissione di malattie legate perché possono diffondersi patogeni alle superfici e utensili 1 alimenti o contatto con gli alimenti. Tra gli insetti, mosche, scarafaggi, formiche e mostrano comportamenti che favoriscono la diffusione di agenti patogeni di origine alimentare. Questi comportamenti sono una associazione con la materia in decomposizione, rifiuti e feci, (edifici entrano) endophily, e synanthropy (convivente con gli esseri umani) 2. .. Patogeni come Salmonella spp, Listeria monocytogenes, Campylobacter spp, Escherichia coli O157: H7, e membri del genere Cronobacter (ex Enterobacter sakazakii) sono stati segnalati per essere trasmessa da insetti 3-5. Sporcizia sinantropici vola sviluppa meccanicamente batteri di origine alimentare trasferendo patogeni dalle loro superfici corporee contaminate. Tuttavia, la presenza di patogeni nel canale alimentare di linea può essere fino a tre voltesuperiore a quella osservata sulle superfici del corpo (il corpo, testa, gambe e ali) 5. Patogeni possono rimanere nel canale alimentare della mosca per una maggiore lunghezza di tempo che sulla superficie del corpo 6,7 e in alcuni casi, sono in grado di moltiplicarsi, colonizzando digerente 4,8,9 tratto della mosca. Questo aumenta il potenziale vettore di mosche perché possono diffondere ulteriormente patogeni di origine alimentare attraverso la defecazione e rigurgito 10,11. Oggi, ci sono migliorati i sistemi di sorveglianza in grado di rilevare le epidemie di origine alimentare malattie più rapidamente. Durante l&#39;esecuzione di indagini sui focolai di origine alimentare, funzionari della sanità pubblica cercano il cibo che può essere la fonte (s) o veicolo (s) di infezione. Gli investigatori possono anche eseguire una valutazione ambientale della struttura (o servizi) coinvolti per scoprire come il cibo è stato contaminato e possono raccogliere campioni nell&#39;ambito delle indagini 12. Despite la vasta letteratura scientifica riguardante insetti come vettori di agenti patogeni di origine alimentare, che collega gli insetti come vettori del patogeno causando un focolaio di infezione particolare malattia è stato impegnativo. Questo è principalmente perché gli insetti non vengono asettico raccolti come parte di programmi di campionamento ambientale durante indagini sui focolai di origine alimentare. Per includere gli insetti, in particolare quelli che presentano comportamenti che favoriscono la diffusione di agenti patogeni di origine alimentare, nell&#39;ambito di una procedura di campionamento ambientale, un protocollo standardizzato, veloce, sensibile e affidabile per rilevare patogeni di origine alimentare da un singolo insetto deve essere a posto. Tecniche di placcatura tradizionali per l&#39;individuazione di agenti patogeni di origine alimentare da insetti sono laboriosi e dipendono la crescita competitiva dei batteri bersaglio in terreni di coltura diverse per superare la rapida crescita del microbiota commensale innata dell&#39;insetto. La maggior parte degli studi che hanno associato gli insetti con bapatogeni cterial hanno aumentato la sensibilità del metodo, raggruppando insieme più insetti piuttosto che identifica la presenza di patogeni su una base per individuo. Così, questi studi non hanno differenziare la parte del corpo dell&#39;insetto dove sono stati trovati i 13-18 patogeni. La capacità di identificare se patogeni di origine alimentare si trovano sulla superficie del corpo o nel canale alimentare di un individuo insetto è importante in quanto ciò potrebbe avere implicazioni epidemiologiche e può portare a diverse strategie di mitigazione. Come vettori meccanici, mosche quella terra sul cibo per breve tempo possono trasferire i bassi livelli di batteri dal loro superficie corporea, mentre quelle mosche che rigurgitano e defecare sul cibo aumentare la probabilità di patogeni trasferimento a livelli potenzialmente più elevati di infezione. Di conseguenza, è importante stimare la prevalenza di un agente patogeno alimentare per un individuo insetti e differenziare la parte del corpo di insetto che dove il p batterica<html> athogen si trova. Anche se l&#39;uso di metodi di coltura indipendente per rilevare patogeni sono sempre in fase di attuazione, non sono stati utilizzati commercialmente per rilevare patogeni da un unico insetto. Attualmente, ci sono convalidate protocolli molecolari che sono disponibili in commercio per la rapida individuazione di agenti patogeni di origine alimentare dagli alimenti che vengono utilizzati dall&#39;industria e agenzie di regolamentazione. Questi metodi includono sistemi basati sul DNA per il rilevamento di agenti patogeni in una varietà di campioni alimentari. Sebbene i protocolli molecolari sono più veloci rispetto ai metodi tradizionali di placcatura, arricchimento del campione è ancora necessaria per ottenere il livello di sensibilità di 10 2 unità formanti colonie (CFU) del batterio patogeno necessaria reazione a catena della polimerasi (PCR) Metodi basati 19. Inoltre, è necessario l&#39;isolamento di colonie batteriche pure da campioni PCR-positivi per confermare l&#39;agente patogeno con metodi adeguati. content &quot;&gt; Lo scopo di questo protocollo è di standardizzare un sistema basato su PCR disponibile in commercio usato per rilevare patogeni dai campioni alimentari e ambientali per la rilevazione di batteri alimentari dalla superficie del corpo e del canale alimentare di una mosca e per isolare ulteriormente quelli patogeni dalla sensibilità samples.The del protocollo qui descritto è stato prima tarati con mosche domestiche adulti laboratorio allevati (Musca domestica) che sono stati sperimentalmente alimentati con diluizioni seriali di ogni patogeno batterico. Il protocollo standardizzato è stato successivamente utilizzato per rilevare 100 catturati vola per la presenza di agenti patogeni di origine alimentare dalle loro superfici del corpo e / o canali alimentari. Questo protocollo standardizzato consentirà laboratori di sanità pubblica per rilevare minacce per la salute derivanti da insetti, consentendo la possibilità di raccoglierle come parte del programma di campionamento ambientale durante l&#39;esecuzione di origine alimentare indagini sui focolai.

<table><tbody><tr><td>Agar solfito di bismuto (BS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>R452402</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Brodo per infusione di cuore cerebrale (BHI)</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>299070</td><td>*Preriscaldato a 37 gradi C. Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Brilliance Listeria agar (BLA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM1080B</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Acqua peptonica tamponata (BPW)</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>212367</td><td>*Preriscaldata a 37 gradi; C o 42&deg;C. Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Brilliance Cronobacter agar (Druggan-Forsythe-Iversen formulation/DFI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM1055B</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>chromID Sakazakii Agar</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>43741</td><td>*Chiama per informazioni: 800.682.2666</td></tr><tr><td>R & F Enterobacter sakazakii (Cronobacter) Terreno di placcatura cromogenico</td><td>R & F Laboratori</td><td>Vari</td><td>*Chiama per informazioni: +1.630.969.530</td></tr><tr><td>R & F Enterobacter sakazakiii Brodo di arricchimento e integratore</td><td>R & F Laboratories</td><td>Varie</td><td>*Chiama per informazioni: +1.630.969.530</td></tr><tr><td>Hektoen enteric (HE) agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXCM0419B</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>24 Brodo di arricchimento Listeria (24LEB)Oxoid</td><td></td> <td>CM1107</td><td>*Preparato al momento a temperatura ambiente. Più fornitori.</td></tr><tr><td>Integratore per arricchimento selettivo di Listeria</td><td>Oxoid</td><td>SR0243</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Novobiocin</td><td>Fisher Scientific</td><td>OXSR0181E</td><td>*Fornitori multipli. Conservare a 2-8 gradi C</td></tr><tr><td>Vancomicina cloridrato idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>861987</td><td>Conservare a 2-8 gradi C</td></tr><tr><td>Cefsulodin sale sodico idrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8145</td><td>Conservare a 2-8 gradi C</td></tr><tr><td>Rappaport-Vassiliadis (RV) medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>CM0669B</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Brodo di tetrationato (TT)</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>249120</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Trypticase soy agar (TSA)</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>236930</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Xilosio lisina desossicolato (XLD) agar</td><td>Becton, Dickson and Company</td><td>221284</td><td>*Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>API Sistema di identificazione biochimica bioM</td><td>&eacute; rieux</td><td>Vari*</td><td>Chiama per informazioni: +1.800.682.2666</td></tr><tr><td>VITEK 2: Sicurezza del prodotto</td><td>bioM&eacute; rieux</td><td>Vari</td><td>*Chiama per informazioni: +1.800.682.2667</td></tr><tr><td>BAX System Q7</td><td>DuPont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BAX E. sakazakii Kit di test standard</td><td>DuPont</td><td>D11801836</td><td></td></tr><tr><td>BAX L. monocytogenes 24E kit di test</td><td>DuPont</td><td>D13608125</td><td></td></tr><tr><td>BAX Salmonella 2 Kit di test standard</td><td>DuPont</td><td>D14368501</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di tappatura</td><td>DuPont</td><td></td><td></td>D11677028</tr><tr><td>Strumento di detappatura</td><td>DuPont</td><td>D11134095</td><td></td></tr><tr><td>PCR rack/supporto</td><td>DuPont</td><td>D12701663</td><td></td></tr><tr><td>Pinza peso piuma, punta larga</td><td>BioQuip</td><td>4750</td><td>Sterilizzare prima dell'uso. Più fornitori.</td></tr><tr><td>Pinza a punta fine e punta dritta</td><td>BioQuip</td><td>4731</td><td>Sterilizzare prima dell'uso. Più fornitori.</td></tr><tr><td>Perle di zirconia/silice, 0,5 mm</td><td>Bio Spec Products, Inc.</td><td>11079105z</td><td>Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Piastre di Petri - 60X15mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Anse di inoculazione monouso, 10&micro; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Spandiconcime a L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-665-230</td><td>Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga, 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>Varie</td><td>Sterilizzare prima dell'uso quando necessario. È preferibile un coperchio sicuro. Più fornitori.</td></tr><tr><td>Provette a grappolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-500-13</td><td></td></tr><tr><td>Provette a grappolo tappi</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-500-23</td><td></td></tr><tr><td>Ipoclorito di sodio (candeggina liquida)</td><td></td><td></td><td>*Diluire allo 0,05% con acqua. Più fornitori.</td></tr><tr>Acqua <td></td><td></td><td>deionizzata sterile</td><td>Fornitori multipli.</td></tr><tr>Acqua <td></td><td></td><td>distillata sterile</td><td>Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Alcool etilico 190 proof</td><td></td><td></td><td>*Diluire al 70% con acqua quando necessario. Più fornitori.</td></tr><tr><td>Disgregatore cellulare Genie, 120V - per microprovette da 1,5 ml e 2,0 ml</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>SI-D238</td><td>Fornitori multipli.</td></tr><tr><td>Blocco</td><td></td><td></td> riscaldante <td>Più fornitori.</td></tr><tr><td>Blocco</td><td></td><td></td> di raffreddamento <td>Più fornitori.</td></tr><tr>Bagno <td></td><td></td><td>d'acqua a ricircolo</td><td>Più fornitori.</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td></td><td></td><td>Più fornitori.</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td></td><td></td><td>Più fornitori.</td></tr><tr><td>Incubatore</td><td></td><td></td><td>Fornitori multipli.</td></tr></tbody></table>

rilevazione di origine alimentare batterica pathogens da mosche individuale filth

Detection of Foodborne Bacterial Pathogens from Individual Filth Flies

C'è un consenso unanime sul fatto che gli insetti siano importanti vettori di agenti patogeni di origine alimentare. Tuttavia, collegare gli insetti come vettori dell'agente patogeno che causa un particolare focolaio di malattie di origine alimentare è stato difficile. Ciò è dovuto al fatto che gli insetti non vengono raccolti in modo asettico nell'ambito di un programma di campionamento ambientale durante le indagini sui focolai di origine alimentare e perché non esiste un metodo standardizzato per rilevare i batteri di origine alimentare dai singoli insetti. Per fare un passo avanti verso la risoluzione di questo problema, abbiamo adattato un protocollo da un sistema basato su PCR disponibile in commercio che rileva gli agenti patogeni di origine alimentare da campioni alimentari e ambientali, per rilevare gli agenti patogeni di origine alimentare dalle singole mosche. Utilizzando questo protocollo standardizzato, abbiamo esaminato 100 mosche catturate in natura per la presenza di Cronobacter spp., Salmonella enterica e Listeria monocytogenes e abbiamo dimostrato che era possibile rilevare e isolare ulteriormente questi agenti patogeni dalla superficie corporea e dal canale alimentare di una singola mosca. Il 22% dei canali alimentari e l'8% delle superfici corporee provenienti da mosche selvatiche raccolte erano positivi per almeno uno dei tre agenti patogeni di origine alimentare. La prevalenza di Cronobacter spp. su entrambe le parti del corpo dei moscerini era statisticamente più alta (19%) rispetto alla prevalenza di S. enterica (7%) e L. monocytogenes (4%). Non sono stati osservati falsi positivi durante il rilevamento di S. enterica e L. monocytogenes utilizzando questo sistema basato sulla PCR perché da tutti i risultati positivi alla PCR sono state ottenute colture batteriche pure. Tuttavia, le colonie pure di Cronobacter non sono state ottenute da circa il 50% dei campioni positivi alla PCR, suggerendo che il sistema di rilevamento basato sulla PCR per questo patogeno reagisce in modo incrociato con altre Enterobacteriaceae presenti tra il microbiota altamente complesso trasportato dalle mosche selvatiche. Il protocollo standardizzato qui presentato consentirà ai laboratori di rilevare agenti patogeni batterici di origine alimentare da insetti raccolti asetticamente, fornendo così ai funzionari della sanità pubblica un'altra linea di prove per scoprire come il cibo è stato contaminato durante l'esecuzione di indagini su focolai di origine alimentare.

Questo protocollo è stato tarato su un insieme di casa mosche laboratorio allevati che sono stati alimentati sperimentalmente per 24 ore con alimenti liquidi fly (2% di latte in polvere) contenente diluizioni seriali (10 Febbraio-10 agosto CFU / ml) di C. sakazakii, S. enterica, L. monocytogenes, o C. jejuni (n = 21 per ciascun batterio patogeno). Mezzi di arricchimento così come i tempi e temperature di incubazione sono stati adeguati per ogni agente patogeno di origine alimentare fino a quando il sistema basato su PCR è stato in grado di rilevare i livelli più bassi di batteri (10 2 CFU / ml) dalla superficie del corpo e del canale alimentare di un solo sperimentalmente alimentato volare. Utilizzando i mezzi e le condizioni di arricchimento descritte nella sezione del protocollo, il sistema basato su PCR rilevato C. sakazakii, S. enterica, e L. monocytogenes dalla superficie corporea del 100% di mosche alimentati con inoculi batterici&gt; 10 3 UFC / ml (Figura 1A). Quando le mosche sono stati alimentati con 102 CFU / ml, la percentuale di rilevamento di C. sakazakii, S. enterica, e L. monocytogenes dalla loro superficie corporea è stata del 100%, 66%, e 33%, rispettivamente (Figura 1A). Il sistema basato su PCR anche rilevato questi tre agenti patogeni di origine alimentare dal canale alimentare di mosche alimentati con tutte le concentrazioni batteriche in percentuali ≥33% (Figura 1B). Tuttavia, la rilevazione di C. jejuni stata raggiunta solo quando le mosche laboratorio allevati stati sperimentalmente alimentati con cibo liquido contenente l&#39;inoculo batterico più alto (10 8 UFC / ml). Quindi, C. jejuni è stato escluso dal gruppo di agenti patogeni di origine alimentare che potrebbe essere testato da individuo sporcizia sinantropica mosche con questo sistema di rilevazione basato sulla PCR in. Con questo protocollo standardizzato, siamo stati in grado di determinare la prevalenza di Cronobacter spp., S. enterica, e L. monocytogenes dalla superficie del corpo e / o the canale alimentare di 100 mosche selvatici che erano individualmente e asetticamente catturati dalla zona cassonetto di dieci ristoranti urbani situati nell&#39;area metropolitana di Washington, DC 5 mosche sporcizia raccolti sono stati rappresentativi di almeno sei specie, tra cui M. domestica (47%), Lucilia cuprina (33%), L. sericata (14%), Cochliomyia macellaria (2%), Sarcophaga haemorrhoidalis (2%), e Ophyra Leucostoma (1%). Una mosca è stato identificato solo a livello familiare (Anthomyiidae; 1%). Il protocollo superficie disinfezione è stata efficace ad evitare la contaminazione incrociata tra le parti del corpo della mosca, perché non è stata osservata crescita batterica su piastre TSA per l&#39;acqua dall&#39;ultimo disinfezione risciacquo di ogni singolo volo. Così, una distinzione può essere fatta tra batteri alimentari presenti sulle parti del corpo di ciascun volo. Senza falsi positivi sono stati rilevati da campioni di superficie corporea e il canale alimentare diindividuali linea quando si utilizza questo spot sistema basato su PCR per il rilevamento di S. enterica e L. monocytogenes, e la conferma dei patogeni vitali su piastre di agar era in accordo con i risultati PCR-positivi. Tuttavia, non è stato possibile isolare colture pure di Cronobacter spp. da tutti i campioni PCR-positivi. Quindi, il rilevamento di questo patogeno dal PCR-based sistema ha mostrato falsi positivi dalla superficie del corpo (50%, 9/18) e il canale alimentare (48%, 16/33) di singoli mosche catturati. Campioni PCR-negativi selezionati in modo casuale che sono stati placcati su supporti specifici, hanno confermato l&#39;assenza di agenti patogeni di origine alimentare. Pertanto, senza falsi negativi sono stati rilevati da qualsiasi dei campioni quando si usa questo sistema basato PCR-commerciale per rilevare Cronobacter spp., S. enterica, o L. monocytogenes. Solo i campioni PCR-positivi in ​​cui l&#39;agente patogeno è stato isolato e confermato sono stati considerati positivie incluso per l&#39;analisi statistica. La presenza globale degli agenti patogeni di origine alimentare nel canale alimentare di mosche Filth catturati era significativamente più alta che sulla superficie del corpo (χ 2 = 6,8772, df = 1, p = 0,0087). 22% dei canali alimentari e 8% delle superfici del corpo di mosche selvatici raccolti erano positive per almeno uno dei tre patogeni (Figura 2). In generale, la prevalenza di Cronobacter spp. né sulla superficie del corpo o canali alimentari di mosche raccolti era statisticamente superiore (19%; p test esatto di Fisher = 0,0165) rispetto alla prevalenza di S. enterica (7%) e L. monocytogenes (4%). Tuttavia, non sono state osservate differenze statisticamente significative durante l&#39;esecuzione di confronti a coppie tra le parti del corpo di linea per ogni batterio patogeno (Figura 3; p test esatto di Fisher = 0,1464, p = 0,1184, e p = 0,6212 per Cronobacterspp., S. enterica, e L. monocytogenes, rispettivamente). Nessuna delle mosche erano positivi per tutti e tre gli agenti patogeni valutati. Tuttavia, tre delle mosche (due L. cuprina e uno sericata L.) portato Salmonella spp. e L. monocytogenes sulla superficie o nel canale alimentare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52372/52372fig1.jpg" /> Figura 1. Livelli di rilevazione di Cronobacter sakazakii, Salmonella enterica, Listeria monocytogenes e Campylobacter jejuni da (A) la superficie del corpo e (B) il canale alimentare dei singoli casa mosche in laboratorio allevati alimentato con cibo liquido contenente inoculi batteriche (n = 21 per ciascun batterio patogeno, n = 3 per ogni concentrazione batterica). <img alt="Figura 2"src = &quot;/ files / ftp_upload / 52372 / 52372fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Percentuale di superfici del corpo e canali alimentari dei singoli mosche trovato positivo per uno dei patogeni bersaglio di origine alimentare. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52372/52372fig3.jpg" /> Figura 3. Prevalenza di Cronobacter spp., Salmonella enterica e Listeria monocytogenes dalla superficie del corpo e del canale alimentare di sinantropici mosche catturati. I valori di p riportati sono da confronti a coppie tra la superficie del corpo e del canale alimentare per ogni batterio patogeno (test esatto di Fisher, valore p &lt;0.05 indica significatività statistica). Copyright © American Society for Microbiology, Journal of Applied and Environmental Microbiology 78 (22): 7891-902, 2012. doi: 10,1128 / AEM.02195-12.

Un protocollo basato sulla PCR è stato adattato per rilevare Cronobacter spp., Salmonella enterica e Listeria monocytogenes dalle superfici corporee e dai canali alimentari di singole mosche catturate in natura. L'obiettivo di questo protocollo è quello di rilevare e isolare i patogeni batterici da singoli insetti raccolti nell'ambito di un programma di campionamento ambientale durante le indagini sui focolai di origine alimentare.

Rilevazione di origine alimentare batterica Pathogens da mosche individuale Filth

There is unanimous consensus that insects are important vectors of foodborne pathogens. However, linking insects as vectors of the pathogen causing a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è ricercare la presenza di patogeni batterici trasmissibili con gli alimenti sulla superficie corporea e nel canale intestinale di singole mosche, utilizzando un sistema di rilevamento basato su PCR disponibile in commercio. Questo viene ottenuto innanzitutto raccogliendo mosche selvatiche dalle aree dei rifiuti di ristoranti. Singole mosche vengono immerse in un brodo nutriente per raccogliere la microflora presente sulla superficie corporea.Quindi il canale elementare viene estratto, collocato in un altro tubo contenente brodo nutriente e frammentato per liberare i batteri presenti all'interno del tessuto. Il passo successivo consiste nel trasferire i campioni in brodi specifici per patogeni e di arricchimento per la crescita batterica, aumentando così la concentrazione dei batteri al di sopra dei limiti di rilevamento del saggio. Successivamente, i campioni arricchiti vengono lisiati e aggiunti a provette per PCR contenenti tavolette pronte all'uso per il rilevamento, basato sulla PCR, dei patogeni bersaglio.L'ultimo passaggio consiste nell'isolare colonie batteriche pure dai campioni risultati positivi alla PCR, piantando il brodo di arricchimento su terreni selettivi e differenziali. In definitiva, la combinazione di rilevamento basato sulla PCR e isolamento di colonie pure viene utilizzata per valutare la prevalenza di *Kob backer*, *Salmonella* e *Listeria monocytogenes* nei canali elementari e sulle superfici corporee di singole mosche selvatiche. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la piastratura tradizionale, è che è rapida, affidabile e sufficientemente sensibile da consentire lo screening della superficie corporea e del canale elementare di una singola mosca per la presenza di patogeni batterici.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nell'indagine su focolai di malattie trasmesse dagli alimenti, come i meccanismi di trasmissione tramite insetti e le fonti dei patogeni. Le implicazioni di questa tecnica vanno oltre la diagnosi di patogeni alimentari da campioni alimentari e ambientali, e includono ora la capacità di rilevare tali patogeni batterici da singoli insetti come le mosche. Per iniziare, posizionare le mosche raccolte in modo asettico in un congelatore a meno 20 gradi Celsius per cinque o sette minuti per immobilizzarle.Quindi posizionare una mosca in un tubo sterile da due millilitri contenente un millilitro di acqua peptonata tampone riscaldata in precedenza, nota come BPW. Utilizzando pinze sterili, mescolare delicatamente il contenuto del tubo mediante inversione per due minuti, assicurandosi che l'intero corpo della mosca entri in contatto con il mezzo. Questo passaggio trasferisce la microbiota presente sulla superficie della mosca nel BPW.Successivamente, trasferire la mosca in un nuovo tubo da due millilitri utilizzando pinzette sterili. Disinfettare la mosca immergendola in etanolo al 70% e mescolare delicatamente per un minuto, quindi rimuovere l'etanolo. Risciacquare la mosca con acqua distillata sterile; dopo il risciacquo, aggiungere al tubo una soluzione di ipoclorito di sodio al 0,05% appena preparata.Mescolare delicatamente per un minuto, quindi rimuovere la candeggina. Risciacquare la mosca tre volte con acqua distillata sterile per confermare la sterilizzazione. Trasferire l'acqua dell'ultimo risciacquo in una provetta sterile da due millilitri e verificare la presenza di batteri contaminanti come descritto nel protocollo testuale.Successivamente, posizionare la mosca su un tovagliolo di carta per autoclave per rimuovere l'acqua in eccesso. Una volta asciutta, trasferire la mosca in una piastra di Petri sterile monouso da 60 millimetri e posizionare la piastra sotto un microscopio stereoscopico. Estrarre con cura l'ano e l'intero canale intestinale dalla mosca utilizzando pinzette sterili con punta fine.Successivamente in condizioni asettiche, trasferire il canale elementare in un altro tubo da due millilitri contenente un millilitro di BPW preriscaldato e sfere di zirconia-silice da 0,5 millimetri. Utilizzare un disgregatore cellulare per agitare il tubo contenente il canale elementare per cinque-dieci minuti al fine di rilasciare i batteri presenti all'interno del tessuto.Posizionare il resto della mosca in un tubo pulito da due millilitri contenente etanolo al 95% per la conservazione a lungo termine a meno 20 gradi Celsius. Per l'arricchimento batterico primario, distribuire il BPW contenente la microflora proveniente dalla superficie o dal canale intestinale in tre tubi da due millilitri con il mezzo preriscaldato appropriato, quindi incubare i tubi alla temperatura e per il tempo indicati, necessari per ciascun patogeno, per l'arricchimento secondario di salmonella e kob backer. Trasferire 100 microlitri della coltura arricchita in tubi sterili a grappolo contenenti 400 microlitri di brodo di infusione cerebrale e cardiaca preriscaldato.Incubare i tubi in un blocco riscaldante a 37 gradi Celsius per tre ore. Per preparare la lisi cellulare, aggiungere 150 microlitri della proteasi fornita nel kit a una bottiglia da 12 millilitri di tampone di lisi e mescolare. Trasferire 200 microlitri del reagente di lisi in ciascuno dei tubi cluster etichettati. Successivamente, trasferire 20 microlitri dei campioni secondari arricchiti nei corrispondenti tubi cluster utilizzando punte di pipetta lunghe per i controlli negativi.Aggiungere 20 microlitri di mezzo sterile come controllo positivo. Aggiungere 20 microlitri da colture batteriche notturne di ceppi noti di salmonella o kob backer. Dopo aver aggiunto tutti i campioni, fissare i tappi sui tubi del cluster utilizzando lo strumento per la chiusura.Successivamente, lisare le cellule posizionando il supporto dei tubi cluster sul blocco riscaldante automatico ed eseguire il programma specifico per il patogeno bersaglio per iniziare il rilevamento basato sulla PCR. Prima, raffreddare un supporto per provette PCR su un blocco refrigerante. Quindi, inserire le provette PCR corrispondenti contenenti le pastiglie pronte per la PCR per il patogeno alimentare bersaglio nel supporto.Rimuovere con attenzione i tappi dalle provette PCR utilizzando lo strumento per l'apertura e scartarli. Verificare che ogni provetta contenga una compressa. Successivamente, trasferire 50 microlitri di lisato nelle provette PCR appropriate.Fissare nuovi tappi ottici sui tubi PCR utilizzando lo strumento per la chiusura. Dopo aver assemblato le reazioni, caricare i tubi PCR nel sistema di rilevamento del termociclatore. Quindi eseguire il programma e visualizzare i risultati come descritto nel protocollo del produttore.Per isolare colonie batteriche pure, selezionare i tubi di arricchimento primario dei campioni risultati positivi alla PCR. Per Salmonella, aggiungere 100 microlitri della coltura di arricchimento a 10 millilitri di mezzo Rappaport Vasilis e a un millilitro di brodo tetra anate. Incubare i tubi a 42,5 gradi Celsius per 22-24 ore; dopo l'incubazione, effettuare un'inoculazione con un'ansa da tre millimetri piena di ciascun mezzo su agar bismuto solfito, XLD, agar e agar enterico.Quindi posizionare le piastre in un incubatore a 35 gradi Celsius. Dopo 22-24 ore di crescita, esaminare le piastre alla ricerca di colonie tipiche di salmonella su ciascun mezzo; stendere una colonia positiva su un mezzo selettivo e isolare colonie singole. Dopo l'incubazione.Utilizzare una colonia pura per confermare l'identità di salmonella presunta mediante un test biochimico commerciale, come il test API 20 E per lo streaking KOB backer. Trasferire con un’ansa un’abbondante quantità dal tubo di arricchimento primario su due piastre di terreno cromogeno, ad esempio terreno cromogeno RNF enterobacter Sakaki eye. Incubare le piastre a 35 gradi Celsius per 22-24 ore, quindi esaminarle alla ricerca di colonie blu, nere o grigio-blu per lo streaking di listeria monocytogenes.Un'ansa piena dal tubo di arricchimento su due piastre di agar Brilliance. Incubare le piastre a 35 gradi Celsius per 22-26 ore, quindi esaminarle alla ricerca di colonie di colore blu-verde. Questo protocollo standardizzato è stato testato su 100 moscerini selvatici catturati nell'area dei cassonetti di 10 ristoranti urbani.Qui è mostrata la percentuale di moscerini confermati positivi per i patogeni bersaglio. Il 22% dei canali elementari e l'8% delle superfici corporee erano positivi per almeno uno dei tre patogeni trasmissibili attraverso gli alimenti valutati.La presenza complessiva di batteri trasmissibili con gli alimenti nel canale elementare delle mosche era significativamente più elevata rispetto alla superficie corporea. La prevalenza delle specie di Kob Bacillus sulle superfici corporee e nei canali elementari delle mosche era statisticamente superiore rispetto alla prevalenza di Salmonella, Tarica e Listeria monocytogenes. Tuttavia, non sono state osservate differenze statistiche effettuando confronti a coppie tra le superfici corporee e i canali elementari delle mosche per ciascun patogeno batterico dopo il suo sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ad altri professionisti nel campo delle indagini su focolai di malattie trasmesse dagli alimenti, permettendo di analizzare singoli esemplari di mosche per rilevare la presenza di patogeni batterici e raccogliere ulteriori informazioni sui meccanismi attraverso cui i microrganismi trasmissibili con gli alimenti si diffondono. Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare che la conferma dei risultati positivi alla PCR fa parte della procedura operativa standard di molti laboratori e, ai fini normativi, si raccomanda di isolare la coltura per la conferma successivamente a questa procedura. Altri metodi, come yp, l'impronta genetica del DNA o il sequenziamento dell'intero genoma, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande, come ad esempio il ceppo del patogeno batterico trasmesso dagli alimenti trasportato dalla mosca.

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