Modellazione il ciclo di vita Ebola Virus Sotto livello di biosicurezza 2 condizioni con particelle virus-simili contenenti Tetracistronic Minigenomes

L'obiettivo generale del seguente esperimento è modellare il ciclo vitale del virus Ebola altamente patogeno in condizioni di livello di biosicurezza due. Questo risultato si ottiene producendo particelle simili a virus, che hanno la stessa composizione proteica delle particelle del virus Ebola, ma trasportano un mini genoma al posto del genoma virale. Un mini genoma è una versione ridotta del genoma virale in cui i geni virali sono stati rimossi e sostituiti con un gene reporter come la luciferasi.

È importante notare che il genoma miniaturizzato utilizzato per questo esperimento conserva ancora un certo numero di geni virali, che codificano per le proteine virali VP40, GP-uno due e VP24. Le particelle simili a virus vengono prodotte esprimendo un genoma miniaturizzato in cellule 293T chiamate cellule produttrici, insieme alle proteine virali np, VP35, VP30 e L, che insieme sono anche definite proteine RNP.

Il mini genoma viene quindi replicato e trascritto in mRNA dalle proteine virali. Gli mRNA codificano per il reporter luciferasi e per le proteine virali aggiuntive VP40, GP-uno due e VP24. Queste tre proteine insieme portano alla produzione di particelle simili a virus, chiamate particelle virali simili a virus competenti per la trascrizione e la replicazione, o TRVLP, poiché i nucleocapsidi in esse contenuti sono in grado di effettuare la replicazione e la trascrizione del genoma. Poiché le TLP portano la glicoproteina del virus Ebola GP-uno due, sono in grado di infettare le cellule bersaglio.

Queste cellule bersaglio sono state pre-trasfettate con un plasmide di espressione per np, VP35, VP30 e L. Insieme, queste proteine del complesso RNP riconoscono il mini genoma che è stato introdotto nelle cellule bersaglio all'interno dei TRVLP. Il mini genoma viene quindi replicato e trascritto, portando all'attività del reporter e alla produzione di nuovi TRVLP, che possono nuovamente essere utilizzati per infettare nuove cellule bersaglio.

È importante notare che il genoma miniaturizzato non contiene l'informazione genetica necessaria per la sua replicazione. Pertanto, i TRVLP non possono infettare in modo produttivo cellule che non esprimono le quattro proteine RNP. Ciò rende il sistema sicuro da utilizzare in condizioni di livello di sicurezza biologica due.

Il principale vantaggio di questo metodo è che consente di modellare l'intero ciclo vitale del virus, inclusa la replicazione del genoma, l'espressione dei prodotti genici virali, la produzione di particelle virali e l'infezione delle cellule bersaglio attraverso diversi cicli di iniezione di fattori, in condizioni di livello di biosicurezza due. Ciò significa che questo lavoro può essere svolto senza un laboratorio a contenimento massimo, che altrimenti sarebbe necessario per lavorare con virus Ebola vivi. Questo metodo può essere combinato con altre tecniche, come l'abbattimento mediato da RNA di fattori cellulari o la sovraespressione di tali fattori, per studiarne il ruolo nella biologia virale. Inoltre, possiamo introdurre mutazioni nei geni virali per studiare il ruolo di questi geni virali e dei loro prodotti nella biologia del virus.

Dividere le cellule rimuovendo il mezzo da cellule 293T confluenti all'80-90%, lavandole due volte con PBS e aggiungendo due millilitri di tripsina alle cellule. Attendere finché le cellule non assumono una forma arrotondata.

Quindi staccarle battendo leggermente il matraccio e aggiungendo otto mL di mezzo con FBS al 10% alle cellule. Contare le cellule utilizzando un contatore cellulare automatico, quindi diluire le cellule fino a due volte 10 alla quinta cellule per millilitro e seminare due mL in ogni pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Reintrodurre le cellule in un incubatore umidificato a 37 gradi con 5%CO2. Dopo 24 ore trasfettare le cellule con i plasmidi necessari per la produzione di TRVLPs. In una cappa a sicurezza biologica, pipettare il DNA in un tubo utilizzando punte con filtro. Come controllo negativo, in un pozzetto si deve omettere il plasmide che codifica per la polimerasi virale L; invece, può essere trasfettato un plasmide che codifica per GFP per visualizzare l'efficacia della trasfezione. Quindi aggiungere 100 microlitri di OptiMEM per pozzetto al DNA. Vortexare il tubo e centrifugarlo brevemente.

Successivamente, aggiungere 7,5 microlitri del reagente di trasfezione transIT LT-one al DNA diluito. Vortexare delicatamente il tubo e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo 15 minuti, mescolare delicatamente la miscela di trasfezione aspirando e dispensando con una pipetta, quindi aggiungere 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti, goccia a goccia.

Dopo aver aggiunto i complessi di trasfezione alle cellule, agitare delicatamente la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro. Non ruotare la piastra poiché ciò causerebbe una trasfezione non uniforme. Successivamente, reinserire le cellule nell'incubatore. A 24 ore dalla trasfezione, rimuovere il sopranatante dalle cellule. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo con 5%FBS alle cellule e reinserirle nell'incubatore.

24 ore dopo la trasfezione delle cellule produttrici, suddividere le cellule 293T come descritto in precedenza. 24 ore dopo la suddivisione, trasfettarle con i plasmidi che codificano per le proteine RNP del virus Ebola, nonché per Tim-one, che funge da fattore di adesione per i virus Ebola. 72 ore dopo la trasfezione delle cellule produttrici e 24 ore dopo la trasfezione delle cellule bersaglio, raccogliere il sopranatante dalle cellule produttrici e trasferirlo con una pipetta in un tubo da 15 millilitri.

Dopo aver raccolto il sopranatante, rimuovere qualsiasi liquido residuo e aggiungere 250 microlitri di buffer di lisi chemiluminescente sulle cellule, quindi incubarle per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, determinare l'attività della luciferasi come descritto al passaggio tre di questo video. Nel frattempo, centrifugare il sopranatante delle cellule produttrici per cinque minuti a 800 ×g e a temperatura ambiente.

Quindi rimuovere il mezzo dalle cellule bersaglio e aggiungere tre millilitri di supernatante chiarificato proveniente dalle cellule P-zero alle cellule bersaglio. Eseguire questa operazione una pozzetta alla volta. Al termine, reinserire le cellule bersaglio nell'incubatore. 24 ore dopo l'infezione.

Rimuovere il soprannatante dalle cellule bersaglio. Quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo con 5%FBS alle cellule e reinserirle nell'incubatore. Per determinare l'attività del reporter nelle cellule produttrici o nelle cellule bersaglio, queste cellule vengono raccolte 72 ore dopo la trasfezione nel caso delle cellule produttrici e 72 ore dopo l'infezione nel caso delle cellule bersaglio.

A tal fine, rimuovere il sopranatante dalle cellule e aggiungere 250 microlitri di buffer di lisi glow alle cellule, quindi incubarle per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. Se desiderato, il sopranatante può essere utilizzato per infettare un nuovo lotto di cellule bersaglio. In questo caso, raccogliere il sopranatante e infettare le cellule bersaglio come descritto al passaggio due di questo video.

Nel frattempo, scongelare 40 microlitri per pozzetto di tampone per saggio della luciferasi e aggiungere un centesimo di volume di substrato per luciferasi al tampone. Vortexare il reagente finale per luciferasi e assicurarsi che abbia raggiunto la temperatura ambiente prima di procedere. Quindi pipettare 40 microlitri di reagente in una piastra bianca opaca a 96 pozzetti. Per evitare problemi di crosstalk, si consiglia di lasciare un pozzetto vuoto tra i pozzetti del campione. Al termine dell'incubazione di 10 minuti, lavare le cellule nel tampone di lisi mediante pipettatura e trasferire il lisato cellulare in una provetta. Centrifugare i lisati per tre minuti a 10.000 ×g e a temperatura ambiente. Successivamente, pipettare 40 microlitri dei lisati nella piastra a 96 pozzetti contenente il reagente per luciferasi. Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente. Trascorsi i 10 minuti, misurare l'attività della luciferasi utilizzando un luminometro. Il tempo di integrazione per la misurazione della luminescenza dovrebbe essere di un secondo. Con un luminometro per micropiastre Modulus, i segnali di luminescenza tipici per il controllo positivo dovrebbero aggirarsi tra 1 × 10⁶ e 1 × 10⁷, mentre il segnale per il controllo negativo dovrebbe essere almeno due-tre ordini di grandezza inferiore. Nei passaggi successivi, l'attività del reporter nei controlli positivi dovrebbe rimanere stabile, mentre l'attività del reporter nei controlli negativi dovrebbe ridursi a livelli di fondo.

Dopo aver guardato questo video, dovresti essere in grado di produrre particelle virali simili al virus Ebola dotate di capacità di replicazione e trascrizione, utilizzarle per infettare cellule bersaglio e misurare l'attività del reporter nelle cellule produttrici e in quelle bersaglio.

È importante notare che questo metodo può essere combinato con altre tecniche, come l'abbattimento mediato da RNA di fattori cellulari, per studiare il ruolo di questi fattori nella biologia virale. Inoltre, è possibile introdurre mutazioni nei componenti virali utilizzati in questo metodo al fine di studiare il ruolo di tali componenti nel ciclo vitale del virus Ebola. Ulteriori dettagli sperimentali e reagenti specifici sono disponibili nel manoscritto associato a questo video.