Facial assotomia Nerve in topi: un modello per studiare motoneuroni risposta al danno

L'obiettivo generale di questa procedura è esporre il nervo facciale per studiare i danni ai nervi periferici. Il nervo facciale ha origine nel ponte del tronco encefalico ed esce dal cranio attraverso il forame stilomastoideo; successivamente, il nervo si ramifica nelle sue componenti principali.

Una volta esposto, il nervo viene auto-amputato al suo passaggio attraverso il forame stilomastoideo. Due punti di riferimento principali aiutano a localizzare il nervo facciale. Il primo è il condotto uditivo, composto da placche cartilaginee di colore bianco madreperlaceo unite da una membrana sottile.

L'altro è il ventre anteriore del muscolo digastrico, che si trova sopra il nervo e il suo punto di uscita dal forame stilomastoideo. Dopo che il nervo facciale è stato lesionato, lo scienziato può studiare diversi fattori come la morte dei motoneuroni o l'espressione genica. Il modello di lesione del nervo facciale è uno dei modelli di lesione del nervo periferico meglio caratterizzati.

I vantaggi di questa tecnica sono la sua semplicità, l'elevata riproducibilità e l'assenza di effetti sulle funzioni vitali conseguenti alla paralisi facciale. Inoltre, grazie alla notevole simmetria del sistema nervoso, il lato non lesionato può fungere da controllo interno accoppiato per i vostri esperimenti. Per mantenere l'uso di tecniche asettiche durante tutta la procedura, assicuratevi che tutti gli strumenti siano stati autoclavati e che sia disponibile un sterilizzatore a perle di vetro per sterilizzare gli strumenti tra un intervento e l'altro.

Preparare il tavolo operatorio posizionando un tampone assorbente su un tappetino riscaldante, configurando il microscopio e fissando con del nastro adesivo il cono nasale in modo che sia allineato al bordo del campo visivo. Dopo aver anestetizzato il topo, verificare che non vi siano risposte fisiche a stimoli, inclusa la compressione del dito del piede. Successivamente, trasferire il flusso di gas dalla camera di anestesia al cono nasale e applicare un unguento oftalmico.

Posizionare il mouse sul fianco sinistro sopra tamponi chirurgici con un tappetino riscaldato al di sotto. Monitorare continuamente la respirazione dell'animale e regolare il flusso di fluorurane (ISO) secondo necessità per mantenere l'anestesia. Per esporre il sito chirurgico, fissare l'orecchio destro al cono nasale con del nastro adesivo.

La vena auricolare posteriore dovrebbe essere visibile mentre attraversa l'orecchio. Successivamente, inumidire il pelo con etanolo al 70% e rasare la zona. Dopo aver rimosso il pelo, pulire la pelle con tre passaggi alternati di iodio ed etanolo al 70%, assicurandosi che la zona sia accuratamente pulita.

Procedere con l'intervento chirurgico. Assicurarsi di posizionare la bocca perfettamente di lato, in modo che la vena auricolare si disponga orizzontalmente. Questo renderà molto più facile individuare il nervo facciale.

Per determinare la posizione del primo taglio, seguire la vena auricolare posteriore dall'orecchio fino alla zona posteriore alla protuberanza auricolare. Quindi, utilizzando forbici a molla, effettuare un'incisione di quattro millimetri, due o tre millimetri posteriormente rispetto alla protuberanza, a scopo didattico. Questa incisione verrà successivamente allargata per esporre l'anatomia sottostante.

Ora effettuare una dissezione ottusa del grasso sottocutaneo e della fascia. Vasi sanguigni e muscoli possono essere facilmente danneggiati dalle forbici. In caso di sanguinamento.

Applicare pressione con un tampone sterile per almeno 30 secondi. Se si è verificata una perdita significativa di liquido, iniettare fino a mezzo millilitro di soluzione salina per via intraperitoneale con un ago da 25 o 27 gauge. Ora localizzare il nervo facciale utilizzando i punti di riferimento principali.

Il nervo accessorio spinale è superficiale rispetto al nervo facciale ed è visibile mentre decorre dalla porzione coccigea del cranio. Per innervare il muscolo trapezio, identificare il condotto uditivo cartilagineo. È di colore bianco madreperlaceo e si trova in posizione rostrale rispetto al nervo facciale.

Il nervo facciale si avvolge attorno alla porzione coddle del condotto uditivo. Quindi identificare la massa muscolare del muscolo digastrico anteriore che giace sopra e coddle al nervo facciale. Dissezionare al di sotto di questa struttura per esporre il nervo facciale.

È una struttura solida di colore bianco, aderente a uno strato di fascia sottostante. Identificare i rami principali del nervo facciale. Seguirli in direzione dorsale fino alla loro origine dal forame stilomastoideo.

Utilizzare pinzette fini per tenere aperta la zona mentre si utilizza la punta delle forbici a molla per dissezionare lungo il percorso dei nervi facciali. Il forame mastoideo osseo per Raymond può essere percepito con le pinzette. A questo punto, identificare il tronco del nervo facciale per schiacciare il nervo.

Comprimetelo con pinzette fini per 30 secondi applicando una pressione costante. Questo reciderà tutti gli assoni. Quindi ripetete la compressione a un angolo perpendicolare per altri 30 secondi.

Mantenere una pressione costante tra un esperimento e l'altro. Ora che i punti di riferimento anatomici rilevanti sono stati identificati, illustrerò una tecnica chirurgica più precisa. Utilizzando un'incisione più piccola, seguire la vena auricolare posteriore dall'orecchio fino alla zona posteriore alla protuberanza auricolare, ed effettuare un'incisione di quattro millimetri, due o tre millimetri posteriormente rispetto alla protuberanza.

Ora, dissezionare in modo impreciso attraverso il grasso sottocutaneo e la fascia utilizzando i tre punti di riferimento: il nervo accessorio spinale, il condotto uditivo e il ventre anteriore del muscolo digastrico. Esponi il nervo facciale. Seguire il nervo facciale in direzione del foro stilomastoideo per raggiungere il tronco del nervo, quindi trassecarlo, stabilizzarlo delicatamente con pinzette fini e tagliarlo con le forbici.

Evitare di applicare una trazione eccessiva sul nervo, altrimenti potrebbe strapparsi dal tronco encefalico. Successivamente, allontanare i monconi o rimuovere un segmento del nervo assicurandosi che non possa avvenire alcuna riconnessione. Infine, ispezionare attentamente il nervo e confermare che sia completamente reciso.

Dopo l'esame rettale, riposizionare tutti i tessuti adiposi e muscolari nelle loro posizioni approssimative. Quindi chiudere la ferita con punti di sutura a clip da 7,5 millimetri o con colla di cianoacrilato. Se necessario, somministrare analgesici in questo momento, spegnere l'anestesia e restituire il topo in una gabbia vuota senza lettiera.

Mentre l'animale si riprende, esaminarlo in cerca di segni di paralisi facciale, i baffi sono paralizzati. Se sono orientati all'indietro verso la guancia, il naso apparirà deviato e l'occhio non lampeggerà in risposta a un soffio d'aria. Ora, se l'animale è femmina, alloggiarla con un'altra femmina.

Tuttavia, se il maschio è tenuto isolato, continuare ad applicare un unguento talamico una volta al giorno fino al ripristino della funzione di ammiccamento per prevenire complicazioni corneali. Nel frattempo, monitorare il topo alla ricerca di segni di infezione o altre complicazioni finché la sede chirurgica non è completamente guarita. Esiste una notevole variabilità nella perdita di motoneuroni dopo l'esodonzia, in base all'età e al background genetico dei topi; negli animali di tipo selvatico sottoposti a sezione del nervo facciale all'età di otto settimane.

Circa l'86% dei neuroni motori sopravvive a 28 giorni. Postessi otomia. È stata osservata una perdita cellulare significativamente maggiore nel modello murino SOD1 di sclerosi laterale amiotrofica, così come nel laser capture del topo knockout del gene dell'attivazione della ricombinazione privo di immunodeficienza.

La microdissezione è stata utilizzata per isolare il materiale dal nucleo motorio facciale. L'intero nucleo motorio facciale poteva essere raccolto. In alternativa, i sotto-nuclei potevano essere prelevati separatamente.

La tecnica presenta un'elevata precisione. I neuroni motori possono essere catturati singolarmente e la restante pillola neurologica può essere raccolta per successive analisi. È stata utilizzata la PCR quantitativa per esaminare l'espressione genica nei campioni sottonucleari del sottonucleo mediale ventrale, indicato dalla linea tratteggiata, e del sottonucleo laterale ventrale, indicato dalla linea continua; è stata misurata l'espressione di quattro geni associati alla risposta di rigenerazione nervosa.

Sono state riscontrate alcune differenze tra le sottonuclei di questi. L'espressione di Gap 43 ha mostrato la differenza maggiore tra le sottonuclei. Una volta padroneggiata questa tecnica, l'intervento chirurgico può essere completato in soli pochi minuti.

È importante ricordare di posizionare correttamente l'animale, eseguire l'incisione nel punto giusto e utilizzare i punti di riferimento anatomici per individuare il nervo facciale. È facile perdersi nella regione della testa e del collo; pertanto, se si perde l'orientamento, individuare semplicemente il condotto uditivo cartilagineo e seguirlo posteriormente per trovare il nervo facciale.