Name: Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per lanalisi di linfociti infiltranti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: Impara a dissociare rapidamente tessuti umani freschi senza enzimi per analizzare linfociti infiltranti CD45+. Questo metodo meccanico preserva lo stato nativo delle cellule per citometria a flusso.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni fromthe Fondo belga per la Ricerca Scientifica (FNRS), Les Amis de l&#39;Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Piano di cancro del Belgio, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson e Fonds Barsy.

NOTA: Tutti i campioni sono stati acquisiti utilizzando un protocollo approvato dal Comitato Etico Medico dell&#39;Istituto Jules Bordet con il consenso informato scritto ottenuto da ogni paziente. 1. Preparazione del tessuto omogenato <ol><li> Sezionare tessuti asportati (tessuto maligno e normale resezione dalla sala operatoria) sono nel laboratorio di patologia da personale qualificato per il ritiro immediato. Tumore, NANT (presa la distanza maggiore dal tumore possibile) e frammenti di tessuto normale sono comunemente trattati nell&#39;ambito 1 - 3 ore di escissione chirurgica in un laboratorio BSL2 utilizzando le procedure di biosicurezza standard per tessuti umani. Un diagramma di flusso del protocollo è illustrato in Figura 1. </li><li> Pesare tutti i frammenti di tessuto (normali, NANT e tumorali) e misurare la lunghezza, la larghezza e l&#39;altezza (lunghezza x larghezza x altezza). Questo è un passo importante per la successiva normalizzazione delle sottopopolazioni di cellule, RNA estratto, etc. NOTE: La gamma di dimensione del campione è di 100 a 10.000 mm 3 senza grassi, se possibile. </li><li> Colophon il frammento tumorale su un vetrino per H &amp; E colorazione per verificare che il tessuto è in realtà parte del tumore. <ol><li> Fare questo premendo un microscopio vetrino sul frammento tumore e applicando una leggera pressione con le dita per qualche secondo. </li><li> Fissare la diapositiva con isopropanolo per 2 min seguita da una fase di lavaggio in acqua. Controcolorare il tessuto per 30 secondi con ematossilina di Mayer. </li><li> Lavare il vetrino in sei vasche di acqua. Colorare in Floxina B 2% per 15 sec. </li><li> Lavare in un bagno di acqua seguita da quattro bagni di isopropanolo e finire con un bagno di acqua. </li><li> Incubare in isopropanolo per 1 min e scarico. Chiaro in due bagni di xilene. </li><li> Montare con mezzo di montaggio a base di xilene. Esaminate per cellularità tumorale (Figura 2). NOTA: Principalmente, le cellule tumorali attaccano alla diapositiva impresso - stromale, linfoide o annuncioipose cellule rimangono raramente, lasciando spazi tra le cellule tumorali (Figura 2). </li></ol></li><li> Posizionare il frammento di tessuto in un piccolo piatto di coltura contenente 1 ml di, mezzo di cellule ematopoietiche senza siero chimica definita (di seguito denominato medio) a temperatura ambiente e tagliare a dadini in piccoli pezzi (~ 1 - 2 mm 2) con una sterile bisturi. </li><li> Trasferire tutto (frammenti di tessuto + media) per un tubo meccanico dissociatore C. </li><li> Lavare la piastra di Petri e bisturi con 2 ml di terreno con una pipetta Pasteur e aggiungere questo al tubo C (volume del mezzo per la dissociazione = 3 ml). </li><li> Utilizzare il A.01 meccanica programma dissociatore per tubi C (il programma più delicato) per rendere omogenei i frammenti di tessuto in una sospensione di cellule singole. Posizionare il tubo C nell&#39;apparato ed eseguire il programma due volte in successione (un ciclo = 25 sec). NOTA: Questa procedura omogeneizzazione è stata stabilita e convalidato per il tessuto mammario umano, altro tumo o tessuto tipi può essere necessario utilizzare un programma diverso e dovrebbe essere testato prima. </li><li> Rimuovere il tubo C dall&#39;apparato e decantare l&#39;omogenato direttamente in una cella di filtro 40 micron seduto su un tubo da 50 ml. Utilizzando la stessa pipetta Pasteur come al punto 1.6, trasferire eventuali residui di liquido nel tubo C al filtro cella. </li><li> Trasferire il liquido filtrato in un tubo da 15 ml con una punta micropipetta 1 ml. Mantenere temporaneamente il filtro delle cellule e il suo tubo da 50 ml. </li><li> Risciacquare il tubo C con ulteriori 3 ml di terreno e trasferire questo, sempre con la stessa pipetta Pasteur come al punto 1.6, al filtro cella ancora seduto sul tubo 50 ml. Spremere un importo massimo del liquido residuo intrappolato nel tessuto unhomogenized nel tubo 50 ml muovendo delicatamente attorno al filtro con una pipetta Pasteur pulita o 1 ml punta che viene successivamente gettato via per evitare di contaminare l&#39;eluato. </li><li> Posizionare il filtro cellulare a testa in giù su tegli tubo C originale e lavare con 3 ml di terreno in modo che il tessuto unhomogenized scende nel tubo C. </li><li> Re-omogeneizzare come al punto 1.7 per due cicli del programma A.01. </li><li> Versare questa seconda omogenato attraverso il filtro cellulare seduto sul tubo 50 ml, risciacquare il tubo C nuovo con 3 medio ml (passo 1.10) e trasferire con la pipetta Pasteur al filtro cellulare seduto sul tubo 50 ml nuovo spremitura massimo quantità di liquido dal tessuto connettivo residua rimasta intrappolata nel filtro cella. </li><li> A questo punto, un volume di 2,5 ml è ~ nel tubo 15 ml e ~ 9 ml nel tubo 50 ml. </li></ol> 2. Separazione del surnatante tessuti e cellule <ol><li> Centrifugare omogenati nei 15 ml e 50 ml provette per 15 min a 600 xg a temperatura ambiente. </li><li> Decantare il SN dal tubo 15 ml in una provetta pulita e memorizzare temporaneamente a 4 ° C. Questo surnatante = tumore primario, o ti NANT normaleSSUE SN (volume finale di 2,5 ml) viene successivamente chiarito e aliquotati prima di conservazione a -80 ° C per le analisi future (vedi sotto). </li><li> Eliminare il surnatante dal tubo 50 ml. </li><li> Risospendere delicatamente entrambi pellet di cellule in un volume finale di 1 ml di mezzo. Brevemente, prima delicatamente rompere il pellet cellulare in entrambi i tubi (toccando il tubo su una superficie dura). Risospendere il pellet di cellule sciolto in 50 ml con 500 ml di medio e trasferire la sospensione cellulare al tubo 15 ml per risospendere il pellet secondo. Ripetere questo passaggio una volta con il secondo 500 ml di media per il massimo recupero di cellule. </li><li> Trasferire 10 ml di sospensione cellulare per un piccolo tubo, mescolare con 10 ml di trypan blu (diluizione 1: 1) e contare il numero di cellule vitali mediante un emocitometro. NOTA: A questo punto una frazione della sospensione cellulare può essere analizzata mediante citometria di flusso per valutare la dimensione della cella, granularità ed eventualmente un numero limitato di marcatori sottopopolazione per maggiori precvalutazione ise della distribuzione cella relativa nel omogeneizzato prima vasta analisi o sperimentazioni. Tutte le analisi di citometria a flusso incorporano etichettatura CD45 per la normalizzazione delle sottopopolazioni. </li><li> Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 xg per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule del tumore, NANT, o tessuti normali sono ora pronti per essere ulteriormente purificati o analisi. Questi passaggi aggiuntivi sono migliori quando eseguite nello stesso giorno come la chirurgia. NOTA: Per l&#39;analisi di citometria di flusso, ma non di separazione delle cellule dei globuli rossi residue dovrebbero essere lisati dopo etichettatura anticorpo aggiungendo 0,4 ml di tampone di lisi dei globuli rossi per il pellet, immediatamente vortex per 1 sec e incubando un minimo di 10 min a camera temperatura (protetto dalla luce) prima dell&#39;analisi. </li></ol> 3. Precisazione del surnatante Tissue <ol><li> Centrifugare le provette da 1,5 ml con SN tessuto a 15.000 xg per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Rimuovere accuratamente tegli surnatante senza toccare o disturbare il pellet. Trasferire in una provetta pulita (o tubi) a seconda del numero e del volume di aliquote desiderati. </li><li> Conservare il supernatante a -80 ° C per un uso futuro. </li></ol> 4. Il sangue del paziente <ol><li> Raccogliere un campione di sangue da ogni paziente come un controllo mediante prelievo venoso in provette eparinizzate il giorno prima dell&#39;intervento. Centrifugare il sangue a 400 xg per 10 min a 20 ° C con il freno fuori per ottenere plasma e un buffy coat. </li><li> Rimuovere il plasma e chiarire che per centrifugazione a 10.000 xg per 15 min a 20 ° C. Aliquotare e conservare plasma a -80 ° C per un uso futuro. Diluire il buffy coat in mezzo </li><li> Separare le cellule mononucleari utilizzando standard di Ficoll-Hypaque gradiente centrifugazione prima dell&#39;analisi immediata, isolamento sottopopolazione, DNA / RNA estrazione / proteine ​​o crioconservazione. </li></ol> 5. Citometria a flusso <ol><li> Cellule etichetta secondo la produzioneistruzioni di r a 4 ° C, al riparo dalla luce. Lisare globuli rossi in sospensioni cellulari da frammenti di tessuto dopo l&#39;etichettatura di anticorpi con l&#39;aggiunta di 0,4 ml di tampone di lisi cellulare al pellet. </li><li> Vortex immediatamente per 1 sec e incubare un minimo di 10 min a temperatura ambiente, protetto dalla luce. Passare le cellule marcate in un citofluorimetro per l&#39;acquisizione dei dati senza lavaggio. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano che non esiste alcun conflitto di interessi.

Questo studio descrive un metodo ottimizzato per la rapida preparazione di normali e maligne omogenati di tessuto mammario senza digestione enzimatica per la successiva separazione delle cellule, l&#39;estrazione, la crioconservazione e / o l&#39;analisi fenotipica di CD45 + sottopopolazioni. L&#39;obiettivo di questo approccio sperimentale è quello di produrre immagini della TIL che riflettono strettamente il loro stato in vivo e confrontarle con tessuti normali con la manipolazione minima dei tessu...

Il microambiente tumorale è composto da vari tipi di cellule con numerosi studi che dimostrano che ognuno di essi svolge un ruolo distinto e importante nella tumorigenesi1,2. Questi includono, ma non sono limitati a, cellule immunitarie infiltranti, cellule stromali, cellule endoteliali e cellule tumorali3. Studi ex vivo sui linfociti infiltranti il tumore (TIL; Le cellule CD45+ o leucociti, che sono prevalentemente linfociti nei tumori al seno) da campioni di tessuto umano fresco sono rese difficili dalla loro bassa frequenza, dalle piccole dimensioni dei campioni spesso disponibili per la ricerca e dalla potenziale perdita di vitalità durante l'estrazione. Poiché le cellule immunitarie che infiltrano i tumori sono solitamente presenti come passeggeri piuttosto che come residenti permanenti, in generale sono più facili da rilasciare dalla matrice tissutale.
Dissociare il tessuto tumorale mantenendo l'integrità cellulare è tecnicamente impegnativo ed è stato tradizionalmente eseguito utilizzando una combinazione di passaggi meccanici ed enzimatici per preparare sospensioni a singola cellula4-8. Questo approccio comporta lunghi periodi di incubazione ed è associato a una significativa riduzione della vitalità cellulare, nonché alla perdita dei recettori della superficie cellulare per scissione enzimatica. Gli studi di citofluorimetria di alta qualità che caratterizzano la TIL nel microambiente tumorale, così come le purificazioni pulite delle sottopopolazioni CD45+ mediante citometria a flusso o perle rivestite di anticorpi, sono più difficili da ottenere dal tessuto tumorale digerito con enzimi. Inoltre, il surnatante (SN) dell'omogenato tumorale risultante non è suscettibile di ulteriori analisi, compresa la quantificazione delle proteine secrete (citochine, chemochine, immunoglobuline o antigeni tumorali) o il trattamento sperimentale di cellule normali, a causa del potenziale di degradazione delle proteine nei digestati enzimatici.
Nella nostra ricerca di un metodo per preparare omogeneizzati a singola cellula da tessuti mammari [inclusi tessuti mammari tumorali, non tumorali non adiacenti (NANT) e normali (da riduzioni mammarie)] senza digestione enzimatica, abbiamo testato una varietà di tecniche di omogeneizzazione meccanica. Gli omogenati preparati utilizzando un dissociatore meccanico hanno aumentato la vitalità cellulare (2 volte) e il recupero cellulare totale (2 volte), preservando l'espressione del recettore di superficie. La digestione enzimatica del materiale insolubile rimanente non ha recuperato ulteriori cellule CD45+, suggerendo che sono state tutte rilasciate nell'omogeneizzato iniziale. Pertanto, questo approccio rapido e semplice consente una valutazione sia qualitativa che quantitativa delle sottopopolazioni CD45+ presenti in vari tessuti umani normali e maligni. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è che il SN dell'omogenato iniziale (SN del tessuto primario) può essere raccolto e conservato per ulteriori analisi o sperimentazioni.

<table><tbody><tr><td>GentleMacs Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>BD Medimachine è in qualche modo equivalente</td></tr><tr><td>Centrifuga 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>o altra centrifuga da tavolo standard</td></tr><tr><td>Centrifuga 5417 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>o altra microcentrifuga standard</td></tr><tr><td>Esco Classe II A2 Biosafety Cabinet</td><td>ESCO globale</td><td></td><td>o altra cappa</td></tr> <tr><td>BSL2 standardMicroscopio invertito</td><td>Nikon eclipse TS100</td><td></td><td>o altro microscopio compatibile per un emacitometro</td></tr><tr><td>B&uuml; Camera di</td><td>Marienfield</td><td>640210</td><td>o altro ematocitometro standard</td></tr><tr><td>Citometro a flusso Navios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>o altro citometro a flusso (8-10 colori consigliati)</td></tr><tr><td>GentleMacs C-Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-344</td><td>BD Medimachine utilizza Filcon</td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>Sarstedt</td><td>72.710</td><td>o altri materiali plastici non pirogeni</td></tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>Swann-Morton</td><td>0510</td><td>o bisturi sterile monouso standard</td></tr><tr><td>BD Cell Strainer 40 & micro; m</td><td>Becton Dickinson</td><td>734-0002</td><td>o altra plastica apirogena</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 50 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352070</td><td>o altra plastica apirogena</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube 15 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352097</td><td>o altra plastica apirogena</td></tr><tr><td>BD FACS Tube 5 ml</td><td>Becton Dickinson</td><td>352008</td><td>o altra plastica apirogena</td></tr><tr><td>Sterile Pasteur Pipetta 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td>o altra plastica apirogena</td></tr><tr><td>Tubo per microfuga 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>7805-00</td><td>o altra plastica apirogena</td></tr><tr><td>X-Vivo 20</td><td>Lonza</td><td>BE04-448Q</td><td>terreno privo di siero consigliato</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>fisiologico standard PBS</td></tr><tr><td>Blu di tripano</td><td>VWR</td><td>17942E</td><td>o altra macchia vitale</td></tr><tr><td>VersaLyse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A09777</td><td>per esperimenti di citometria a flusso</td></tr><tr><td>Fattibilità fissabile Colorante eFluor 780</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14</td><td>per esperimenti di citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD3 FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>345763</td><td>per esperimenti di citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD3 Vio Blue</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-363</td><td>per esperimenti</td></tr> <tr><td>di citometria a flussoanti-CD4 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>345769</td><td>per esperimenti di citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD4 APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-232</td><td>per esperimenti di citometria</td></tr><tr><td>a flusso anti-CD8 ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>737659</td><td>per esperimenti di citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD8 PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>345774</td><td>per esperimenti di citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD19 APC-Vio770</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-643</td><td>per esperimenti di citometria a flusso</td></tr><tr><td>anti-CD45 VioGreen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-906</td><td>per esperimenti di citometria a flusso</td></tr></tbody></table>

un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l&#39;analisi di linfociti infiltranti

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

La capacità delle cellule maligne di eludere il sistema immunitario, caratterizzata dalla fuga del tumore da entrambe le risposte immunitarie innate e adattative, è ormai accettato come un importante segno distintivo di cancro. La nostra ricerca sul cancro al seno si concentra sul ruolo attivo che tumorali infiltranti linfociti svolgono nella progressione tumorale e outcome dei pazienti. Verso questo obiettivo, abbiamo sviluppato una metodologia per la rapida isolamento delle cellule linfoidi intatte dai tessuti normali e anormali nel tentativo di valutarli in prossimità al loro stato originario. Omogenati preparati utilizzando un dissociatore spettacolo meccanico sia aumentata la vitalità delle cellule e di recupero, mantenendo l&#39;espressione del recettore di superficie rispetto tessuti enzima-digerite. Inoltre, la digestione enzimatica del materiale insolubile restante non ha recuperato CD45 + cellule supplementari indicano che le misurazioni quantitative e qualitative nella omogeneizzato primario probabile riflettano effettivamente sottopopolazioni infiltrano nel Fragm tessutient. Le cellule linfoidi in questi omogenati possono essere facilmente caratterizzata usando immunologica (fenotipo, proliferazione, etc.) o molecolare (DNA, RNA e / o proteine) approcci. Cellule CD45 + possono essere utilizzati anche per la purificazione sottopopolazione, l&#39;espansione in vitro o crioconservazione. Un ulteriore vantaggio di questo approccio è che il supernatante tessuto primaria da omogenati può essere utilizzato per caratterizzare e confrontare citochine, chemochine, immunoglobuline e antigeni presenti in tessuti normali e maligni. Questa funzione di protocollo estremamente bene per i tessuti mammari umani e dovrebbero essere applicate a una vasta gamma di tessuti normali e anormali.

La digestione enzimatica di frammenti di tessuto sia con soluzioni disponibili in commercio dissociazione tessuto o varie miscele di laboratorio di collagenasi, DNasi e / o inibitori ialuronidasi, unirà un&#39;ampia varietà di recettori presenti sulla superficie delle cellule. I nostri studi, inizialmente concentrati sulle cellule CD4 + T infiltranti i tumori al seno, sono stati rapidamente presentati con un grave problema tecnico dovuto alla scissione dei recettori CD4 superficie utilizzando enzimatici stand...

Questo protocollo descrive la rapida dissociazione non enzimatica di frammenti di tessuto umano fresco per la valutazione qualitativa e quantitativa delle cellule CD45+ (linfociti/leucociti) presenti in vari tessuti umani normali e maligni. Inoltre, il surnatante ottenuto dall'omogenato del tessuto primario può essere raccolto e conservato per ulteriori analisi o sperimentazioni.

Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l&#39;analisi di linfociti infiltranti

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

L'obiettivo generale di questa procedura è omogeneizzare rapidamente frammenti di tessuto umano in una sospensione di singole cellule senza digestione enzimatica, al fine di effettuare analisi qualitative e quantitative e l'isolamento di specifiche sottopopolazioni di linfociti. Questo risultato si ottiene innanzitutto utilizzando un bisturi sterile per tritare i frammenti di tessuto in piccoli pezzi. Successivamente, la poltiglia di tessuto viene trasferita in un tubo dissociatore meccanico, dove i frammenti vengono ulteriormente omogeneizzati in una sospensione di singole cellule.Le cellule vengono quindi raccolte mediante centrifugazione per l'analisi successiva. In definitiva, la citometria in flusso può essere utilizzata per analizzare i linfociti infiltranti, sottopopolazioni asiatiche. Il mio laboratorio ha sviluppato questa tecnica perché stavamo cercando un metodo che ci permettesse di ottenere immagini dei linfociti infiltranti il tumore senza alterarne in modo significativo lo stato nativo.Volevamo un metodo che ci permettesse di isolare rapidamente le cellule e analizzarle così come si presentavano durante l'intervento chirurgico. Questa tecnica è stata utilizzata su oltre 300 tumori mammari e tessuti normali nel nostro laboratorio ed è semplice da usare, adatta a essere impiegata su base quotidiana. Può essere utilizzata per esaminare marcatori prognostici, la risposta al trattamento e l'esito clinico a lungo termine.Dimostrer&agrave; questa tecnica oggi John Nicola Loic, un tecnico del mio laboratorio. Iniziare pesando il campione di tessuto, quindi misurare la lunghezza, la larghezza e l'altezza del tessuto. Trasferire quindi il frammento di tessuto in una piccola capsula di Petri contenente un millilitro di mezzo cellulare ematopoietico privo di siero, chimicamente definito e appropriato, e utilizzare un bisturi sterile per trinciare i campioni in piccoli pezzi di uno-due millimetri quadrati.Successivamente, trasferire il contenuto della piastra in una provetta C per la dissociazione meccanica e risciacquare la piastra e il bisturi con due millilitri di mezzo. Aggiungere il risciacquo alla provetta C, quindi eseguire due volte consecutivamente il programma di dissociazione meccanica 0.01 per omogeneizzare delicatamente i frammenti di tessuto in una sospensione di singole cellule. Al termine del secondo ciclo, versare l'omogenato attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri in una provetta conica da 50 millilitri.Quindi utilizzare la stessa pipetta per aspirare dal piatto di Petri e trasferire qualsiasi liquido rimanente nel tubo C nel filtro per cellule. Successivamente, utilizzare una micropipetta da un millilitro per trasferire il liquido filtrato in un tubo conico da 15 millilitri e risciacquare il tubo C con ulteriori tre millilitri di mezzo. Trasferire questo risciacquo attraverso il filtro per cellule nel tubo da 50 millilitri.Quindi, muovere delicatamente il tessuto non omogeneizzato all'interno del filtro usando una punta pulita da un millilitro, per spremere la massima quantità di liquido residuo intrappolato nel tessuto nel tubo da 50 millilitri. Ora, posizionare il filtro cellulare capovolto sopra il tubo C originale e risciacquare il filtro con altri tre millilitri di mezzo, in modo che il tessuto non omogeneizzato ricada nel tubo C. Omogeneizzare nuovamente il tessuto per altri due cicli come appena dimostrato, quindi versare questo secondo omogeneato attraverso il filtro cellulare.Risciacquare nuovamente il tubo C con altri tre millilitri di mezzo. Quindi filtrare il soprannatante attraverso il setaccio ed estrarre il liquido residuo dal tessuto come appena dimostrato. A questo punto, dovrebbe essere presente un volume di circa 2,5 millilitri di sospensione di cellule singole nel tubo da 15 millilitri e circa nove millilitri nel tubo da 50 millilitri.Per separare il sopranatante tissutale dalle cellule, centrifugare innanzitutto entrambi i tubi di omogeneato per 15 minuti a 600 G e temperatura ambiente, decantare il sopranatante dal tubo da 15 millilitri in un tubo da 1,5 millilitri, posizionarlo a quattro gradi Celsius e scartare il sopranatante dal tubo da 50 millilitri. Quindi battere delicatamente ciascun tubo su una superficie dura per disperdere i pellet cellulari. Risospendere il pellet cellulare sciolto nel tubo da 50 millilitri con 500 microlitri di mezzo e trasferire le cellule nel tubo da 15 millilitri per risospendere il secondo pellet.Quindi risciacquare il tubo da 50 millilitri con altri 500 microlitri di mezzo e trasferire il lavaggio nel tubo da 15 millilitri per un recupero cellulare massimo. Dopo aver contato il numero di cellule vitali mediante esclusione del blu di trian, centrifugare la sospensione cellulare. Infine, centrifugare il sopranatante del tessuto conservato.Quindi trasferire con attenzione il sopranatante in almeno una provetta pulita senza toccare o disturbare il pellet e conservarlo a meno 80 gradi Celsius per analisi downstream future. In questi grafici, sono mostrati grafici a dispersione rappresentativi di citometria a flusso di omogeneizzati cellulari tumorali dissociati, seguiti da marcatura con anticorpi specifici contro marcatori di leucociti e cellule epiteliali, come dimostrato. Questo protocollo non altera significativamente la vitalità delle cellule positive per CD45.Tuttavia, si verifica una notevole perdita di cellule EPAM positive vitali. Nonostante ciò, i sottoinsiemi vitali positivi per EPAM e positivi per CD45 possono essere separati in base alle loro dimensioni e struttura in grandi cellule tumorali epiteliali, piccole cellule epiteliali o cellule CD45 positive di grandi e piccole dimensioni. Qui vengono mostrati grafici rappresentativi di citometria a flusso a dispersione dei principali sottoinsiemi infiltranti tumorali, con i linfociti selezionati in base alla vitalità delle cellule positive per CD45.Infine, l'espressione delle citochine o gli immunoglobulini totali presenti nel supernatante del cancro al seno possono essere confrontati con il supernatante del tessuto mammario normale, rivelando, come dimostrato in questo esperimento rappresentativo, un aumento di entrambi i tipi di proteine associate al tessuto tumorale. Sebbene la procedura sia semplice, è importante ricordare di lavorare rapidamente e in modo accurato, e di recuperare la quantità massima di materiale a ogni passaggio della procedura per ottenere un numero sufficiente di cellule per l'analisi finale.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

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