Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l'analisi di linfociti infiltranti

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di omogeneizzare rapidamente frammenti di tessuto umano in una singola sospensione cellulare senza digestione enzimatica per l'analisi qualitativa e quantitativa e l'isolamento di specifiche sottopopolazioni di linfociti. Ciò si ottiene utilizzando prima un bisturi sterile per tagliare i frammenti di tessuto in piccoli pezzi. Successivamente, l'impasto tissutale viene trasferito in un tubo meccanico dissociato dove i frammenti vengono ulteriormente omogeneizzati in una sospensione a singola cellula.

Le cellule vengono quindi raccolte mediante centrifugazione per l'analisi a valle. In definitiva, la citometria a flusso può essere utilizzata per analizzare i linfociti infiltranti, sottopopolazioni asiatiche. Il mio laboratorio ha sviluppato questa tecnica perché stavamo cercando un modo per visualizzare i linfociti infiltranti il tumore senza influenzare drasticamente il loro stato nativo.

Volevamo qualcosa che ci permettesse di isolare rapidamente le cellule e analizzarle come se fossero in chirurgia. Questa tecnica è stata utilizzata su più di 300 tumori al seno e tessuti normali nel nostro laboratorio, ed è facile da usare e può essere utilizzata quotidianamente. Può essere utilizzato per esaminare i marcatori prognostici, la risposta al trattamento e l'esito clinico a lungo termine.

A dimostrare questa tecnica oggi sarà John Nicola Loic. Un tecnico del mio laboratorio Inizia pesando il campione di tessuto e poi misurando la lunghezza, la larghezza e l'altezza del tessuto. Quindi trasferire il frammento di tessuto in una piccola capsula di Petri contenente un millilitro del terreno di cellule ematopoietiche privo di siero appropriato e chimicamente definito e utilizzare un bisturi sterile per tagliare i campioni in piccoli pezzi da uno a due millimetri quadrati.

Quindi, trasferire il contenuto del piatto in un tubo C di dissociazione meccanica e sciacquare il piatto e il bisturi con due millilitri di terreno. Aggiungere il lavaggio al tubo C e quindi eseguire il programma di dissociazione meccanica a 0,01 due volte di seguito per omogeneizzare delicatamente i frammenti di tessuto in una sospensione a singola cellula. Dopo il secondo ciclo, decantare l'omogeneizzato attraverso un colino cellulare da 40 micrometri in una provetta conica da 50 millilitri.

Quindi usa lo stesso parassita della pipetta dal lavaggio della capsula di Petri per trasferire il liquido rimasto nel tubo C nel filtro cellulare. Quindi, utilizzare una micropipetta da un millilitro per trasferire il liquido filtrato in una provetta conica da 15 millilitri e sciacquare la provetta C con altri tre millilitri di terreno. Trasferire questo lavaggio attraverso il colino cellulare nella provetta da 50 millilitri.

Quindi spostare delicatamente il tessuto non omogeneizzato attorno al colino con una punta pulita da un millilitro per spremere la massima quantità di liquido residuo intrappolato nel tessuto nel tubo da 50 millilitri. Ora, posiziona il filtro cellulare capovolto sopra la provetta C originale e risciacqua il colino con altri tre millilitri di terreno in modo che il tessuto non omogeneizzato ricada nella provetta C. Omogeneizzare nuovamente il tessuto per altri due cicli come appena dimostrato, quindi versare questo secondo omogenato attraverso il filtro cellulare.

Ancora una volta, sciacquare il tubo C con altri tre millilitri di terreno. Quindi filtrare il surnatante attraverso il colino e spremere il liquido residuo dal tessuto come appena dimostrato. A questo punto, un volume di circa 2,5 millilitri di sospensione a cellula singola dovrebbe essere presente nella provetta da 15 millilitri e circa nove millilitri dovrebbero essere osservati nella provetta da 50 millilitri.

Per separare il surnatante tissutale dalla prima centrifuga delle cellule, entrambe le provette di omogenato per 15 minuti a 600 Gs e temperatura ambiente, decantare il surnatante dalla provetta da 15 millilitri in una provetta da 1,5 millilitri, posizionandolo a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante dalla provetta da 50 millilitri. Quindi picchiettare delicatamente ogni tubo su una superficie dura per rompere ciascuno dei pellet cellulari. Risospendere il pellet di cellule sciolte nel tubo da 50 millilitri con 500 microlitri di terreno e trasferire le cellule nel tubo da 15 millilitri per risospendere il secondo pellet.

Quindi sciacquare la provetta da 50 millilitri con altri 500 microlitri di terreno e trasferire il lavaggio nella provetta da 15 millilitri per il massimo recupero cellulare. Dopo aver contato il numero di cellule vitali mediante trian blue exclusion pellet la sospensione cellulare. Infine, centrifugare il surnatante tissutale riservato.

Quindi trasferire con cura il surnatante in almeno una provetta pulita senza toccare o disturbare il pellet e conservarlo a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius per future analisi a valle. In questi grafici, vengono mostrati dot plot rappresentativi di citometria a flusso di omogeneizzati di cellule tumorali dissociate, seguiti da marcatura con anticorpi specifici contro leucociti e marcatori di cellule epiteliali. Questo protocollo non altera in modo significativo la vitalità delle cellule CD 45 positive.

Tuttavia, c'è una notevole perdita di cellule EPAM positive vitali. Nonostante ciò, i sottogruppi EPAM positivi e CD 45 positivi possono essere segregati sulla base delle loro dimensioni e struttura in grandi cellule tumorali epiteliali, piccole cellule epiteliali o grandi e piccole cellule CD 45 positive. Qui sono mostrati i dot plot rappresentativi della citometria a flusso dei principali sottogruppi infiltranti il tumore con i linfociti controllati sulla vitalità delle cellule CD 45 positive.

Infine, l'espressione delle citochine o le immunoglobuline totali presenti nel surnatante del cancro al seno possono essere confrontate con il surnatante del tessuto mammario normale rivelando, come dimostrato in questo esperimento rappresentativo, aumenti in entrambi i tipi di proteine associate al tessuto tumorale Mentre il partecipante è la procedura, è importante ricordare di lavorare rapidamente e pulire e di recuperare la massima quantità di materiale in ogni fase della procedura per ottenere un numero sufficiente di cellule per la tua analisi degli endpoint.