Name: Metodologia sintetico per Asymmetric Ferrocene derivati sistemi bio-coniugati attraverso Solid Metodologia Resina a base di fase (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Scopri la sintesi di bioconiugati ferrocene-biotina asimmetrici su resina a fase solida per applicazioni di biochimica. Questo metodo semplifica la purifica e consente l'immobilizzazione efficace su superfici dorate.

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KG è stato sostenuto dalla concessione P-1760 RA Welch Foundation, TCU Andrews Istituto di Matematica e Scienze della formazione (per KG), TCU ricerca e creatività Activity Grant (al KG) e TCU SERC Grant (a JHS).

1. Sintesi di biotina-Fc-cisteina (1) <ol><li> Metodi in fase solida per la produzione di resina-legato 1. <ol><li> Inserire biotina resina caricata (250 mg, 0,145 mmol) in una siringa sinterizzato e gonfiare la resina elaborando dimetilformammide (5 ml) e agitando la siringa su un agitatore di laboratorio per 20 min. Espellere la soluzione e ripetere dimetilformammide gonfiore ancora una volta. </li><li> Rimuovere il gruppo protettore Fmoc aggiungendo 4-6 ml di 20% piperidina in dimetilformammide alla siringa seguita da 10-15 minuti di agitazione. Ripetere il processo deprotezione con un altro 4-6 ml di piperidina. Lavare la resina con una sequenza di 3x dimetilformammide, 3x dimetilformammide: metanolo (1: 1), metanolo 3x: diclorometano (1: 1), 3x diclorometano, ~ 5 ml. Fare un test alla ninidrina (+) su un piccolo campione (~ 10) delle perle di confermare deprotezione successo dalla presenza di blu dopo riscaldamento. </li><li> Mescolare una soluzione contenente acido 1&#39;-Fmoc-ammino-ferrocene-1-carbossilico(203,3 mg, 0,4350 mmoli), 1-idrossibenzotriazolo idrato (58,8 mg, 0,413 mmoli), diisopropil carbodiimide (0,0673 ml, 0,435 mmoli), diisopropil etil ammina (0,0757 ml, 0,435 mmoli), e una miscela 4: 1 di diclorometano e dimetilformammide. Disegna questo nella siringa sinterizzato e scuotere delicatamente su un agitatore di laboratorio per 6 ore. Poi espellere la soluzione dalla siringa e lavare come descritto in precedenza. </li><li> Eseguire il test alla ninidrina (-) come descritto sopra per confermare accoppiamento. Il test ninidrina può ancora essere utile nel confermare accoppiamento nonostante il colore arancio del tallone derivato dal fissaggio del ferro contenente frazione. </li><li> Quindi rimuovere il gruppo Fmoc mediante l&#39;aggiunta di 20% piperidina in dimetilformammide e lavati come descritto sopra. Il test ninidrina (+) deve essere utilizzato per confermare la rimozione Fmoc. </li><li> Preparare una soluzione composta di Fmoc-Cys (Trt) -OH (254,8 mg, 0,4350 mmol), 1-idrossibenzotriazolo idrato (58,8 mg, 0,4125 mmol), diisopropil carbodiimide (0,0673 ml, 0,4350mmol), diisopropil etil ammina (0,0757 ml, 0,4350 mmoli), e una miscela 4: 1 di diclorometano e dimetilformammide. Aggiungi questo cocktail accoppiamento cisteina siringa sinterizzato e scuotere delicatamente per 6 ore. Lavare utilizzando il protocollo descritto in precedenza. </li><li> Conferma accoppiamento utilizzando il test alla ninidrina (-), seguita dalla rimozione del componente Fmoc con il 20% di piperidina e lavaggio. Verifica terminale libero ammina utilizzando il test alla ninidrina (+). </li></ol></li><li> Cleavage di 1 dalla resina. <ol><li> Fare una soluzione di TFA (9.45 ml), acqua (0,25 ml), 1,2-etanditiolo (0,25 ml), e triisopropyl silano (0,1 ml), aggiungere alla siringa e agitare delicatamente per 4 ore. </li><li> Raccogliere la risultante soluzione rosso-marrone in un tubo Eppendorf e si evapora il TFA lentamente utilizzando una corrente d&#39;aria. </li><li> Aggiungere fredda etere dietilico (~ 15 ml) al tubo Eppendorf precipitare 1, che costituirà agitazione. Isolare il prodotto tramite centrifugazione (1 g, 5 min). Tcicli gallina ripetute di lavaggi etere etilico (~ 60 ml totale) e centrifugare per ottenere 1 come rosso / marrone solido. </li></ol></li></ol> 2. Caratterizzazione e analisi di 1 <ol><li> Verificare che l&#39;identità corrisponde la connettività e la composizione mostrata in figura 2 con 1 H (16 scansioni) e 13 C NMR (512 scansioni) in metanolo deuterato (300 microlitri) e analisi ESI-MS. Aspettatevi i seguenti risultati: Spettro 1 H NMR (CD 3 OD) δ / ppm: 1,407-1,684 (m, 6H), 2.245 (t, 2H), 2,665-3,150 (m, 12H), 4,015 (t, 1H), 4.104 (d, 2H ), 4.274 (q, 1H), 4.426 (d, 2H), 4.479 (q, 1H), 4.595 (t, 1H) e 13 C NMR spettro (CD 3 OD) δ / ppm: 24,644 (CH 2), 25,472 (CH 2), 28,051 (CH 2), 28.300 (CH 2), 35,474 (CH 2), 38.698 (CH 2), 39,241 (CH 2), 39,717 (CH 2), 55,340 / 55,538 (Cp-ring), 60,286 (CH), 61,964 (CH), 62,521 / 62,821 (Cp-ring), 66,038 / 66,170 (Cp-ring), 69,153 / 69,328 (Cp-ring), 71,468 / 71,593 (Cp-ring), 76,466 (CH), 171,770 (C = O), 175,361 (C = O). ESI-MS (m / z): Trovato: 639.00 [1 + Na] +, teorica: 639,1 [1 + Na] + e HR-MS (m / z): Trovato: 617,2049 [1 + H] +, teorica: 617.1622 [1 + H] +. </li><li> Eseguire HPLC, analisi elementale conferma la composizione isolata 1. Eseguire i cromatogrammi HPLC utilizzando una colonna a fase inversa C8 100% MeOH ad una velocità di flusso di 0,5 ml / min. Nota: i tempi di ritenzione HPLC sono stati: 3,198-4,674 min. </li></ol> 3. L&#39;immobilizzazione di 1 su una superficie d&#39;oro <ol><li> Cut polimero sostenuto scivoli d&#39;oro in quadrati di ~ 0,25 in 2. </li><li> Riempire un bicchiere da 50 ml con una soluzione di acqua deionizzata di 1 (~ 1 mM). </li><li> Aggiungere la diapositiva oro al bicchiere e coprire con un vetro da orologio. Tuttoow il vetrino di incubare O / N a RT senza agitazione. </li><li> Rimuovere il vetrino oro dalla soluzione e lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Ottenere la scansione di immagini di microscopia elettronica usando un microscopio elettronico a scansione (o equivalente) per osservare immobilizzato 1. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La sintesi di derivati ​​asimmetrici ferrocene è impegnativo in soluzione. Ad esempio, i tentativi di produrre 1 in soluzione comportato basse rese di prodotto desiderato (meno del 20%). Analogamente, utilizzando reazioni 1&#39;-ammino-ferrocene acido carbossilico (sans Fmoc) e resina biotina legata determinato prodotto insolubile coerente con il prodotto polimerizzato riportato da Baristic et al. e prodotto minima. 47 Questo è ulteriormente complicato dal ferrocene e suoi d...

I biosensori sono piccoli dispositivi che utilizzano la tecnologia di riconoscimento biomolecolare come piattaforma per l&#39;analisi selettiva e vengono utilizzati per la loro specificità, velocità e basso costo. Biosensori elettrochimici per la rilevazione di biomolecole sono all&#39;avanguardia di questo campo per la loro semplicità, economicità, ed alta sensibilità. 1,3 L&#39;anatomia generale di tali sensori è un elettrodo dotato di una molecola di riconoscimento specifico per il marcatore biologica di interesse . Il legame del biomarker dalla molecola di riconoscimento si traduce in una variazione locale del potenziale o corrente che può essere rilevato mediante misurazione semplice. Ad oggi la frazione riconoscimento può variare da enzimi, anticorpi 4-8, 9-12 cellule intere, recettori 13-16, 17-20 peptidi 21-23 e DNA 24 e sono in gran parte incentrati su grandi, molecole biologiche. 25-28 Research sforzi in questo campo si sono concentrati principalmente sulla immunosensori WHEre una immunoglobulina è immobilizzato con un nucleo attivo redox (come ferrocene) e utilizzato per rilevare un anticorpo di interesse. Questi studi sono stati esclusi dalle applicazioni cliniche a causa di una scarsa precisione e consumo di tempo derivanti dalle complicazioni derivanti dall&#39;uso di antigene / anticorpi. 1,3 crescente attenzione si è concentrata sulla rilevazione di piccole molecole (meno di 1 kg / mol) di biomedica , cibo e interesse ambientale, oltre alla sicurezza nazionale. 29 Gli esempi più noti di dispositivi di biosensori sono monitor glucosio auto-test, che hanno serigrafate elettrodi enzimi accoppiati ad un formato tascabile metri amperometrico. Questi sistemi tipicamente utilizzano un metodo coulometrico cui la quantità totale di carica generata dalla reazione di ossidazione del glucosio è misurata su un periodo di tempo. Dispositivi negoziabili devono essere portatile, robusto e tenuto in mano per fare uso facile per la popolazione in generale. Tags Redox quali ferrocene sono necessary di fornire il rilevamento elettrochimico di biomarcatori o piccole molecole in soluzione, come la maggior parte dei biomarcatori non sono intrinsecamente elettrochimicamente attivi. 30-38 Ferrocene è una molecola organometallica che è un gold standard per l&#39;elettrochimica, che lo rende una scelta eccellente per l&#39;integrazione in biosensori elettrochimici. Redox basata ferrocene-specie attive hanno già raccolto una notevole attenzione a causa delle loro piccole dimensioni, buona stabilità, l&#39;accesso sintetico comodo, facile modificazione chimica, relativa lipofilia, e la facilità di messa a punto redox. 3,30-42 Piccole molecole basate sul core ferrocene hanno stati ampiamente utilizzati come rivelatori di ioni metallici e piccole molecole. 32-38,43 sistemi di targeting specie più grandi come biomolecole hanno utilizzato l&#39;allegato di grandi anticorpi o immunoglobuline di derivati ​​del ferrocene che sono stati integrati su una superficie elettrochimica. 1,3,39 , 44 In ogni caso, il potenziale di intensi e correntety della coppia redox Fe III / Fe II è stato modificato su accoppiamento molecolare, producendo così una nuova maniglia spettroscopica che indica la presenza della molecola analita. Tale variazione è determinata dalla vasta sovrapposizione che si verifica tra il pi-sistema degli anelli ciclopentadienilici ed il ferro orbitali-d. Se il pi-sistema viene modificato, cioè, derivatizzato o reagito, allora l&#39;interazione orbitale, a sua volta, il cambiamento. Questo influenzerà il nucleo Fe e può essere osservata come un cambiamento nel potenziale della coppia Fe III / Fe II. 40,45,46 Queste proprietà rendono tale sistema attraente per l&#39;uso come agente quantificare in un immunodosaggio elettrochimica o biosensore. Per produrre sistemi ferrocene contenente specifici per portate biosensore è ottimale modificare un anello Cp con il bio-recettore specifico per una molecola bersaglio e utilizzare l&#39;altro anello Cp come tether molecolare per la lettura elettrochimica o elettrode (Figura 1). Sintesi di questi derivati ​​asimmetrici ferrocene è sfidato da reazioni laterali e la formazione di specie dimerica e polimeriche formate su intermolecular cross-linking. 47 Tuttavia, giunto chimica producendo un legame ammidico è la via più diretta per fornire semplici derivati ​​del ferrocene che coinvolgono componenti biologiche tali come peptidi e loro metaboliti. Pertanto, le tecniche in fase solida prima sviluppate nel 1950 da Merrifield per sintesi peptidica possono essere applicati a composti organometallici contenenti ferrocene. Attraverso l&#39;uso del ortogonalmente sostituito molecola di acido 1&#39;-Fmoc-ammino-ferrocene-1-carbossilico, un sistema ferrocene che può contenere una molecola recettore (biotina), lettura elettrochimica (ferrocene), e componente immobilizzare-linker (cisteina) presenta stato costruito e qui descritto. La sintesi di questo bio-coniugato è discusso così come prova per l&#39;immobilizzazione su una superficie d&#39;oro. Questo rappre lavorots la prima presentazione di un sistema composto da biotina, ferrocene ed un amminoacido per l&#39;immobilizzazione su una superficie d&#39;oro.

<table><tbody><tr><td>Biotina Novatag Resina</td><td>NovaBiochem</td><td>8550510001</td><td></td></tr><tr><td>TORVIQ 10 ml Luer Lock Siringa fritta</td><td>Fisher</td><td>NC9299151</td><td></td></tr><tr><td>piperidina</td><td>Acros</td><td>P/3520 / PB05</td><td></td></tr><tr><td>test ninidrina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017-1ea</td><td></td></tr><tr><td>1'-Fmoc-ammino-ferrocene-1-acido carbossilico</td><td>Omm Scientific Ordine</td><td>speciale</td><td></td></tr><tr><td>N,N&prime; -Diisopropilcarbodiimmide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D125407-5G</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Novabiochem</td><td>8520080025</td><td></td></tr><tr><td>acido trifluoroacetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5408</td><td></td></tr><tr><td>1,2-etanedithiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2930</td><td></td></tr><tr><td>triisopropyl silano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233781</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes (20 ml)</td><td>Qualsiasi fonte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Qualsiasi fonte</td><td></td><td>Essiccare con setacci molecolari prima dell'uso e conservare in un flacone da 100 ml per un facile utilizzo</td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Qualsiasi fonte</td><td></td><td>Asciugare con setacci molecolari prima dell'uso e conservare in un flacone da 100 ml per un facile utilizzo</td></tr><tr><td>Dimetilformammide</td><td>Qualsiasi fonte</td><td></td><td>asciugare con setacci molecolari prima dell'uso & Conservare in un flacone da 100 ml per un facile utilizzo</td></tr><tr><td>Centrifugare</td><td>qualsiasi fonte</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metodologia sintetico per asymmetric ferrocene derivati ​​sistemi bio-coniugati attraverso solid metodologia resina a base di fase

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

La diagnosi precoce è la chiave per il successo del trattamento della maggior parte delle malattie, ed è particolarmente importante per la diagnosi e il trattamento di molti tipi di cancro. Le tecniche più comuni utilizzate sono Imaging modalità, come la risonanza magnetica (MRI), tomografia ad emissione di Topografia (PET), e computerizzata Topografia (CT) e sono ottimali per la comprensione della struttura fisica della malattia, ma possono essere eseguite solo una volta ogni quattro sei settimane a causa dell&#39;uso di agenti di imaging e costo complessivo. Con questo in mente, lo sviluppo di &quot;point of care&quot; tecniche, come biosensori, che valutano lo stadio della malattia e / o l&#39;efficacia del trattamento in studio del medico e lo fanno in modo tempestivo, avrebbe rivoluzionato protocolli di trattamento. 1 come un mezzo per esplorare biosensori ferrocene base per la rilevazione di molecole biologicamente rilevanti 2, sono stati sviluppati metodi per produrre bio-coniugati ferrocene-biotina qui descritti. Questa relazione si concentrerà su un sistema biotina-ferrocene-cisteina che può essere immobilizzato su una superficie d&#39;oro.

La forma legata resina 1 è indicata in figura 2. L&#39;attacco covalente del componente ferrocene dà luogo ad una tinta arancione alle perle di resina che è persistente con lavaggio in continuo e indicativa di un ferro immobilizzato contenente complessa rispetto a assorbimento di ferro dal componente PEG del tallone resina. La forma priva di resina 1 è identico a colori per le perle di resina. Dopo la rimozione del composto dalla resina perline, la purezza e resa (68%) ...

La sintesi di specie asimmetriche di ferrocene è impegnativa utilizzando tecniche di soluzione. Questo rapporto si concentra sui metodi effettuati per produrre un bioconiugato ferrocene-biotina utilizzando reazioni facili e pulite realizzate tramite sintesi in fase solida. È dimostrato che l'incorporazione di una porzione tiolata conferisce la capacità di immobilizzazione sulle superfici d'oro.

Metodologia sintetico per Asymmetric Ferrocene derivati ​​sistemi bio-coniugati attraverso Solid Metodologia Resina a base di fase

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è produrre coniugati asimmetrici di ferne, biotina e bio che possono essere immobilizzati su una superficie d'oro. Questo risultato si ottiene sintetizzando il coniugato di ferne-biotina-bio su una resina in fase solida. Come secondo passaggio, il coniugato viene rimosso dalla resina, consentendo l'isolamento e la caratterizzazione del composto.Successivamente, il bioconiugato viene incubato con una superficie d'oro per consentire l'adesione dei talati all'oro. I risultati mostrano che un bioconiugato ferne può essere prodotto con buona resa e purezza, e successivamente immobilizzato su una superficie d'oro. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i metodi basati su soluzione, è che la purificazione è semplice e diretta.Oltre ad evitare i sottoprodotti generati con metodi basati su soluzioni, abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo riflettendo sull'efficienza e praticabilità dei sensori di glucosio utilizzati per monitorare i pazienti diabetici. A illustrare questa procedura sarà Sean Rodich del mio laboratorio e Paulina Gonzalez, rispettivamente studentessa universitaria e studentessa laureata del mio laboratorio. Per prima cosa, aggiungere 250 milligrammi di resina caricata con biotina in una siringa dotata di filtro.Gonfiare la resina aspirando cinque millilitri di dimetilformammide e agitando la siringa su un agitatore da laboratorio per 20 minuti. Al termine, espellere la soluzione e ripetere il gonfiaggio con dimetilformammide. Successivamente, rimuovere il gruppo protettivo FOC aggiungendo quattro-sei millilitri di papina al 20% in dimetilformammide alla siringa, seguiti da 10-15 minuti di agitazione. Dopo aver ripetuto il processo di deprotezione, lavare la resina tre volte con una sequenza di dimetilformammide, dimetilformammide e metanolo in rapporto uno a uno, metanolo e diclorometano in rapporto uno a uno e diclorometano.Dopo aver espulso la soluzione, eseguire un test hyn su un piccolo campione delle perle per confermare la protezione profonda avvenuta con successo, verificando la comparsa del colore blu al riscaldamento. Successivamente, preparare una soluzione contenente un FM amino farin prime, un acido carbossilico, idrato di HOBT, DIC di, etilammina isopropilica e una miscela quattro a uno di metilene cloruro e dimetilformammide. Aspirare questa soluzione nella siringa fritta e agitare delicatamente su un agitatore da laboratorio per sei ore.Dopo aver lavato la resina, eseguire il test dell'idrante come descritto in precedenza per confermare che il legame sia avvenuto. Successivamente, rimuovere il gruppo FM o mediante l'aggiunta di 20%ine in dimetilformammide alla resina nella siringa dopo aver agitato e lavato nello stesso modo di prima. Preparare una soluzione composta da fmm cyst trit till O-H-O-B-T idrato, DIC di, etilammina isopropilica e una miscela quattro a uno di metilene cloruro e dimetilformammide.Aggiungere questo cocktail di accoppiamento della cisteina alla siringa fritta e agitare delicatamente per sei ore. Dopo aver confermato l'accoppiamento mediante il test HYN, rimuovere il componente F MOC con il 20%ine. Una volta completato il lavaggio, verificare l'ammina terminale libera utilizzando il test dell'hydrant.A questo punto, preparare una soluzione di acido tricloroacetico, acqua, uno, due, et etanolo e triisopropilcicloesano. Quindi aggiungere la soluzione alla siringa. Dopo aver agitato per quattro ore, raccogliere la soluzione risultante di colore rosso-bruno in un tubo einor ed evaporare lentamente l'acido tricloroacetico utilizzando un flusso d'aria.Aggiungere circa 15 millilitri di etere dietilico freddo al tubo Eppendorf per precipitare il prodotto, che si formerà con un'agitazione delicata. Isolare il prodotto mediante centrifugazione. Ripetere quindi cicli di lavaggi con etere dietilico e centrifugazione.Per ottenere il biotinbioconugato di ferne come solido rosso bruno. Confermare l'identità del biotinbioconugato di ferne mediante spettroscopia NMR a protone e al carbonio e analisi E-S-I-M-S. Eseguire analisi HPLC e analisi elementare per confermare la composizione del composto isolato.Dopo aver completamente caratterizzato il prodotto, tagliare le fette d'oro con supporto polimerico in quadrati di circa 0,25 pollici quadrati. Successivamente, riempire un becher da 50 millilitri con una soluzione acquosa disionizzata uno millimolare del bioconiugato ferne-biotina. Aggiungere una delle lamelle d'oro al becher e coprire con un vetrino da orologio.Lasciare la lametta in incubazione durante la notte a temperatura ambiente senza agitazione. Al termine dell'incubazione, rimuovere la lametta d'oro dalla soluzione e lavarla con acqua deionizzata. Una volta che la lametta è asciutta, acquisire immagini di microscopia elettronica a scansione utilizzando un microscopio elettronico a scansione per osservare il bioconiugato di ferne biotin immobilizzato.La forma legata alla resina del coniugato bio-biotina ferne uno è mostrata qui. L'attacco covalente del componente ferne conferisce alle perle di resina una tinta arancione, indicativa di un complesso immobilizzato contenente ferro, piuttosto che di un'assorbimento del ferro da parte del componente PEG della perla di resina. Dopo la rimozione del composto dalle perle di resina, la purezza e la resa risultanti sono molto superiori rispetto alla tipica metodologia in soluzione.Una volta padroneggiato, questo intervento può essere eseguito in tre giorni, se effettuato correttamente. Non dimenticare che lavorare con acido cloridrico e F e con la dieta può essere estremamente pericoloso; è sempre necessario adottare precauzioni come l'uso di dispositivi di protezione individuale ed eseguire l'operazione all'interno della cappa chimica quando si svolge questa procedura.

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