Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare la dimensione dell'oligo formato da un piccolo polipeptide idrofobico nel detergente solfalano C 14 e la stabilità di questo olier quando il pH viene modificato. Ciò si ottiene innanzitutto determinando quale concentrazione di ossido di deuterio corrisponde alla densità delle celle detergenti my, e quindi neutralizza la loro galleggiabilità. Come seconda fase, una serie di esperimenti di equilibrio di sedimentazione per piccoli campioni di proteine idrofobiche solubilizzati.

Nel C 14 il detergente sulfalano viene utilizzato con la determinata concentrazione di ossido detergente. Successivamente, il primo e il secondo passaggio vengono ripetuti a un pH diverso per confrontare il profilo di sedimentazione della proteina a questi vari valori di pH. I risultati mostreranno sia la dimensione oligomerica della piccola proteina idrofobica in questo detergente sia l'effetto del pH sulla stabilità di questo oligo nel detersivo C 14 sulf beane.

La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché ci sono diversi passaggi coinvolti come l'assemblaggio e il caricamento della corrispondenza della densità delle celle e il raggiungimento delle condizioni di equilibrio, e questo può facilmente sopraffare e confondere gli utenti per la prima volta. Qualsiasi piccolo errore in questi passaggi può potenzialmente far perdere diversi giorni di tempo sperimentale. La procedura sarà dimostrata da suria, uno studente di dottorato nel mio laboratorio.

Per prima cosa, prepara 10 tamponi e 50 detergenti. Le soluzioni madre e il filtro sterilizzano ciascuno attraverso un filtro a siringa da 0,2 micrometri in un einor da 1,5 millilitri dalle 10 soluzioni tampone e 50 soluzioni madre detergenti. Preparare 200 microlitri di tre soluzioni campione separate contenenti il 10%30% e il 50% di ossido di deuterio in volume.

Per assemblare una cella di ultramodernizzazione analitica a sei canali senza riempimento esterno, posizionare la guarnizione della finestra nel supporto della finestra, piegare leggermente il rivestimento della finestra e posizionarla nel supporto della finestra in modo che la fessura si formi di fronte al supporto della finestra. La chiavetta posiziona quindi una finestra in zaffiro all'interno del rivestimento della finestra, allineando il segno con il supporto della finestra. Sede della chiavetta per vendere l'alloggio con un numero di parte capovolto con le sedi della chiavetta in linea con la chiave dell'alloggiamento.

Far scorrere un centrotavola a sei settori con il lato smussato rivolto verso il basso nell'alloggiamento della cella, seguito da un gruppo finestra con una finestra rivolta verso il basso, quindi rivestire leggermente le filettature dell'anello della vite e la rondella dell'anello della vite con lubrificante a spin coat. Posizionare una rondella ad anello a vite sopra il gruppo finestra. Installare l'anello a vite nell'alloggiamento della finestra con la parola rivolta verso l'esterno, serrare a mano l'anello a vite utilizzando lo strumento di allineamento delle celle.

Quindi serrare l'anello a vite a soli 60 pollici per libbra utilizzando la chiave dinamometrica. Successivamente, posizionare una cella con il numero di parte in posizione verticale e posizionarla alle ore 12. Caricare 120 microlitri di soluzione di riferimento nelle file di sinistra e 110 microlitri di soluzione campione nelle file di destra.

Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, assicurarsi che ogni campione e riferimento sia accoppiato correttamente e accuratamente. Far scorrere un gruppo finestra con la finestra rivolta verso il basso nell'alloggiamento della cella, facendo attenzione a non disturbare eccessivamente la cella in quanto ciò potrebbe rovesciarne il contenuto. Ripetere i passaggi precedenti, serrando il secondo anello a vite a 120 pollici libbre.

Quindi invertire la cella e serrare nuovamente il primo anello a vite a 120 pollici per libbra. Caricare le celle nel rotore. Installare il rotore nella centrifuga e installare il monocromatico secondo le istruzioni del produttore.

Dopo aver raggiunto un vuoto sufficiente, far funzionare la centrifuga a 3000 giri/min. Visualizza in anteprima il modello di interferenza nel software dell'interfaccia utente e regola i parametri del laser per ottenere il massimo contrasto. Quindi, creare un nuovo file di configurazione, specificando la misurazione dell'equilibrio e dell'interferenza.

Impostare un metodo di equilibrio di sedimentazione per funzionare a 45.000 giri al minuto o alla velocità massima prevista per i campioni di proteine con una temperatura di esecuzione di 20 gradi Celsius Dopo averne raccolto uno, eseguire la scansione ogni 15 minuti per almeno 12 ore. Monitora l'andamento dell'equilibrio aprendo i file di dati nell'analisi etero e selezionando la funzione di corrispondenza. A questo punto, assemblare una cella di ultracentrifugazione analitica a sei canali con finestre al quarzo nello stesso modo di prima.

Utilizzando le punte di caricamento in gel, caricare il campione di proteina idrofobica di piccole dimensioni a più alta concentrazione precedentemente preparato nel canale più vicino al centro del rotore e il campione a concentrazione più bassa più lontano dal centro del rotore. Per impostare la misurazione dell'assorbanza, creare un nuovo file di configurazione specificando la misurazione dell'equilibrio e dell'assorbanza. Specificare 280 nanometri come lunghezza d'onda del rivelatore.

Successivamente, eseguire una calibrazione radiale a 3000 giri/min controllando la calibrazione radiale prima della prima scansione e le opzioni di scansione. Specifica della raccolta dei dati a bassa risoluzione ed esecuzione di una singola scansione. Al termine della scansione, deseleziona l'opzione.

Imposta un metodo di equilibrio di sedimentazione per funzionare alla prima velocità precedentemente calcolata a 20 gradi Celsius e raccogli una scansione ogni 30 minuti nel dettaglio di ciascuna cella. Specificare la raccolta dei dati a bassa risoluzione dopo almeno 18 ore. Monitora l'andamento dell'equilibrio aprendo i file di dati nell'analisi etero e selezionando la funzione di corrispondenza una volta raggiunto l'equilibrio.

Raccogli una singola scansione ad alta risoluzione al termine della scansione. Ripetere i passaggi precedenti per la velocità successiva quando è noto il tempo necessario per raggiungere l'equilibrio per ciascuna velocità. Impostare il metodo di equilibrio di sedimentazione Scansione per includere tutte le velocità precedentemente calcolate e per raccogliere una scansione dopo il tempo di equilibrio per ciascuna velocità.

In questo caso, specificare la raccolta di dati ad alta risoluzione nel dettaglio di ciascuna cellula: la distribuzione radiale delle cellule C 14 sultan detergent my e 50 molari di fosfato di sodio. Il pH 7,3 forma un esponenziale molto superficiale che potrebbe essere adattato a un modello lineare. La pendenza di questo profilo dipende dalla concentrazione di ossido di deuterio e la concentrazione che ha prodotto una pendenza zero è risultata essere del 32,3%Lo stesso esperimento è stato ripetuto per pH 5,5 e pH tre per ottenere concentrazioni di ossido di deuterio corrispondenti rispettivamente del 30,3% e del 41%.

A pH 7,3, si è scoperto che la piccola proteina idrofobica e il detergente formano pentameri con logaritmo apparente della costante di affinità di 21,05. La costante di associazione non è cambiata a pH 5,5, ma è stata significativamente ridotta a pH tre. Ciò è coerente con i rapporti precedenti che mostravano una diminuzione della conduttanza a pH più basso con una farmacocinetica di circa 4,5.

Una volta padroneggiato l'assemblaggio della cella di equilibrio, il caricamento e l'impostazione dell'esperimento possono essere eseguiti in un'ora se eseguiti correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti essere in grado di avere una buona comprensione di come preparare un esperimento di equilibrio di sedimentazione in modo da poter determinare la dimensione olimatica della tua proteina di membrana e anche per confrontare la stabilità e le loro diverse condizioni sperimentali.