Name: Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Scopri la sedimentazione all'equilibrio per studiare l'oligomerizzazione di proteine idrofobiche e la stabilità del pentamero in funzione del pH. Questo metodo biochimico rivela come la protonazione dell'istidina influenzi le interazioni proteiche.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione della National Research Foundation NRF-CRP4-2008-02 (J.T.) e dalla sovvenzione Tier 1 RG 51/13.

Questo protocollo si basa sulle seguenti risorse, che devono essere di cui per ulteriori dettagli e considerazioni particolari 3, 25-28. 1. Densità corrispondenza di micelle detergenti con 2 H 2 O Nota: La densità della soluzione tampone deve essere abbinato alla densità delle micelle detergenti. Agenti comuni densità-regolazione includono 2 H 2 O, H 2 18 O, 2 H 2 O 18, glicerolo e saccarosio 29. H 2 O 18 ha la stessa densità 2 H 2 O e può essere una scelta migliore se deuterazione di protoni scambiabili nella proteina non è desiderato. In questa procedura, la densità di 3- (N, N-dimethylmyristylammonio) -propanesulfonate (C14SB) detersivo in 50 mM Tris pH 7,3, NaCl 100 mM sarà abbinato con 2 H 2 O. Come un tentativo iniziale le seguenti concentrazioni di2 H 2 O sarà utilizzato: 10, 30, e 50% v / v. 1.1. Preparazione del campione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni di magazzino e filtro sterilizzare attraverso un filtro siringa da 0,2 micron: 50 mL Tris 500 mM pH 7,3 e 1 M NaCl (10X soluzione tampone); 1 ml 250 C14SB mm (soluzione detergente 50X). </li><li> Preparare 200 ml di soluzione campione mescolando 20 microlitri 10X tampone, 4 microlitri soluzione detergente 50X, 20 microlitri 2 H 2 O (99,9%), e 156 microlitri deionizzata H 2 O. Anche preparare 200 ml di soluzione di riferimento mescolando 20 microlitri tampone 10X, 20 microlitri 2 H 2 O (99,9%), e 160 microlitri deionizzata H 2 O. </li><li> Ripetere il punto 1.1.2 per le altre 2 H 2 O concentrazioni, cioè il 30% e il 50%, regolando gli importi 2 H 2 O e H 2 O in modo appropriato. </li></ol> 1.2. Assemblaggio di 6 canali AUC cellule e caricamento dei campioni nelle cellule. Nota: Ci sono due tipi di cellule AUC seconda del metodo di caricamento del campione. Le cellule senza riempimento esterno deve essere caricato prima della sigillatura della cella, mentre esterno-riempiono le celle possono essere caricati dopo che le cellule sono sigillati. Assemblaggio di una cella AUC esterna riempimento è stato descritto in precedenza 3. In questo protocollo, il montaggio di una cella di 6 canali AUC senza riempimento esterno è descritto. La differenza principale è che ha anelli vite su entrambi i lati che devono essere serrate separatamente e non ha bisogno di tappi di alloggiamento (Fig. 1). La differenza di fasi di montaggio sono evidenziati di seguito. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig1.jpg" /> Figura 1. vista di una cella di AUC 6 canali senza riempimento esterno Esploso. Questo dato è stato modificato dalla Beckman Coulter An-50 Ti e An-60 Ti Analytical Rotor, Celle, e l&#39;utente elev manuale. <ol><li> Preparare due finestre per ogni cella AUC con finestra zaffiro invece di finestra di quarzo (Fig. 2). Posizionare la guarnizione finestra nel supporto finestra. Piegare leggermente il rivestimento finestra e posizionarlo nel supporto finestra in modo che il gap si forma di fronte alla scanalatura titolare finestra. Posizionare la finestra di zaffiro all&#39;interno della fodera finestra, allineando il segno con la chiavetta porta finestra. Nota:. La finestra di quarzo è comprimibile e quindi produrrà rifrazione più luce ad alta velocità 28, 30 Pertanto per misure di interferenza sopra 30000 rpm, come in questo esperimento corrispondenza densità, sono utilizzati finestre zaffiro. Una finestra di zaffiro è più pesante finestra di quarzo e ha una &quot;X&quot; inciso su un lato. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig2.jpg" /> Figura 2. Esploso of l&#39;assemblea finestra. Questo dato è stato modificato dalla Beckman Coulter An-50 Ti e An-60 Ti Analytical Rotor, Celle, e manuale utente elev <ol><li> Posizionare la custodia cella con il numero di parte capovolta. Con le chiavette allineate con la chiave alloggi, far scorrere nel corpo cellule in primo luogo un centrotavola 6-settore con il lato smussato verso il basso, seguita da una assemblea finestra con la finestra rivolta verso il basso (Fig. 1, a sinistra). </li><li> Leggermente cappotto la rondella vite discussioni ring e ghiera con spinkote. Inserire una rondella anello vite sulla parte superiore del gruppo finestra. Installare l&#39;anello vite nell&#39;alloggiamento finestra con la scritta &quot;OUT&quot; rivolto verso l&#39;esterno. Serrare l&#39;anello di vite utilizzando lo strumento di allineamento delle cellule. </li><li> Utilizzando la chiave coppia, serrare la ghiera di soli 60 pollici-libbre. </li><li> Posizionare la cella con il numero di parte in posizione verticale e posizionato a 12-ore. Load 120 microlitri riferimento nelle righe di sinistra e di 110 campioni microlitri nelle righe giuste. Assicurarsi che ogni campione e il riferimento è abbinato correttamente. Nota: volume del campione esatta non è critica, ma il riferimento deve avere poco più volume di campione (5-10 microlitri) in modo che il menisco campione sarà distinti. </li><li> Far scorrere con attenzione nel gruppo alloggiamento della cella una finestra con la finestra rivolta verso il basso (Fig. 1, a destra). Fare attenzione a non disturbare la cellula eccessivamente e versare il contenuto. </li><li> Ripetere il passaggio 1.2. 3 e 1.2. 4, stringendo il secondo anello vite a 120 pollici-libbre. Invertire la cella e serrare il primo anello della vite a 120 pollici-libbre. </li><li> Caricare le cellule nel rotore, installare il rotore nella centrifuga e installare il monocromatore secondo le istruzioni del produttore 28. Nota: Dettagli su questo step si possono trovare anche in questo riferimento 3. </li></ol> 1.3. Impostazione misura interferenze <ol><li> Avviare il software di interfaccia utente per lo strumento AUC ed eseguire l&#39;installazione e la calibrazione laser radiale per ogni cella a 3000 rpm, secondo le istruzioni del produttore, che saranno brevemente riassunti nel passaggio seguente. </li><li> 1.3.1.1 Dopo vuoto sufficiente è stato raggiunto (&lt;100 micron), eseguire il centrifugare a 3000 rpm. Visualizzare in anteprima il modello di interferenza nel software di interfaccia utente e regolare i parametri del laser per ottenere il massimo contrasto. </li><li> Creare un nuovo file creato (File | Nuovo File) specificando &quot;Equilibrio&quot; e &quot;interferenze&quot; di misura. Impostare un metodo di sedimentazione di equilibrio (tasto &quot;Method&quot;) per l&#39;esecuzione a 45000 rpm oppure quella più alta prevista per i campioni di proteine, se superiore, con la temperatura corsa a 20 ° C e raccogliere 1 scansione ogni 15 minuti. Monitor equilibrio progressi aprendo i file di dati in HeteroAnalysis e selezionando la funzione &quot;Match&quot;, dopo almeno 12 ore (circa durante la notte, Fig. 3). Nota: una funzione simile è disponibile in SEDFIT (Opzioni | Caricamento Opzioni | Prova approccio alla Equilibrium) anche. </li></ol><img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig3.jpg" /> Figura 3. Risultato funzione HeteroAnalysis Match. La funzione match può essere utilizzata per monitorare i progressi equilibrio confrontando RMSD tra le scansioni successive e l&#39;ultima scansione. Questo esempio mostra raggiungimento dell&#39;equilibrio dopo 8 ore come indicato dai valori RMSD asintotica all&#39;asse X. 1.4. Analisi dei dati <ol><li> Per ciascuna serie di campioni, tracciare la pendenza del profilo di distribuzione radiale contro la concentrazione di H 2 O 2. Nota: La distribuzione sarà molto superficiale esponenziale che apapprocci linearità. Asse X intercetta corrisponde alla concentrazione di H 2 O 2 corrispondente. </li><li> Per precisare, eseguire l&#39;esperimento in più repliche. In alternativa, ripetere l&#39;esperimento con una gamma più ristretta di 2 H 2 O concentrazione. </li></ol> 2. sedimentazione equilibrio SH in micelle C14SB 2.1. Parametri della corsa <ol><li> Calcolare la densità e la viscosità del buffer, la proteina volume specifico parziale e velocità di centrifugazione utilizzando SEDNTERP. Per calcolare la densità e la viscosità del buffer, selezionare Calcola sezione &quot;Buffer Select&quot; e inserire i componenti tampone di conseguenza, tra cui il D 2 O concentrazione. </li><li> 2.1.1.1 Per calcolare proteina volume specifico parziale, selezionare Calcola sezione &quot;V-bar&quot; e inserire la sequenza aminoacidica della proteina. Specificare la dimensione oligomerica più alto previsto in &quot;Crea un oligomero da questo monomero: N =&quot;campo, in questo caso N = 5. Calcolare la velocità inserendo valori nel campo RPM nella finestra principale fino σ ≈ 1; questa è una regola per garantire una buona forma esponenziale del profilo di distribuzione radiale 25. Nota: I valori calcolati per questo esperimento è la seguente: ρ = 1,03839 g / ml, η = 1,0267 CP = 0,7569 ml / g, ω 1 = 16000 rpm. </li><li> Calcolare velocità successivi da seguire per garantire sufficiente differenza tra il profilo di distribuzione ad una velocità e il successivo 25. Nota: questo può essere fatto anche dalla funzione &quot;Stimare rotore equilibrio velocità funzione&quot; in SEDFIT, che tiene conto della colonna soluzione (volume di riempimento). </li></ol> 2.2. Preparazione dei campioni <ol><li> Preparare 1 ml di soluzione di riferimento con 5 C14SB mM e il 32,3% 2 H 2 O, come determinato da esperimento corrispondenza densità (sezione 1), mescolando 100 microlitri di buffer 10X solution (fase 1.1.1), 20 microlitri soluzione 50X detergente (fase 1.1.1), 323 microlitri 2 H 2 O (99,9%) e 527 microlitri deionizzata H 2 O. </li><li> Sciogliere liofilizzato, peptidi SH-HPLC purificato (espressione e purificazione descritto in precedenza 31) in opportuno solvente come metanolo o 50% v / v acetonitrile acquoso. Misurare A280 dei peptidi disciolti in un microlitro scala UV spettrofotometro / Vis e aliquota per tre campioni per dare 280 A, 12mm = 0,3, 0,5, e 0,8 (A 280, 10mm = 0,25, 0,417 e 0,67) ogni volta diluito per 130 ml. Lyophilize i campioni durante la notte e risospendere in 130 ml soluzione di riferimento (punto 2.2.1) per dare le soluzioni campione. Nota: proteina SH può essere rilevato da UV / Vis assorbanza a 280 nm perché contiene Trp e Tyr residui. Proteine ​​senza residui aromatici possono essere rilevati da loro tagging con un cromoforo adeguato, utilizzando un mutante Trp contenente, o utilizzando interferiscemisure SNO invece di assorbanza. </li><li> Seguire i passaggi nella sezione 1.2 per assemblare una cella AUC 6 canali con finestre di quarzo. Caricare il campione di concentrazione più alta (A 280, 12mm = 0.8) nel canale più vicino al centro del rotore e disponibilità campione concentrazione (A 280, 12mm = 0,3) più lontana dal centro del rotore. </li></ol> 2.3. Impostazione misure di assorbanza <ol><li> Creare un nuovo file creato (File | Nuovo File) specificando &quot;Equilibrium&quot; e valutazione &quot;assorbanza&quot;. Specifica 280 nm come lunghezza d&#39;onda del rivelatore. </li><li> Eseguire la calibrazione radiale a 3000 rpm controllando &quot;calibratura Radial prima prima scansione&quot; in Opzioni di scansione, specificando la raccolta di dati a bassa risoluzione, ad esempio, con passo radiale = 0,01 centimetri, Repliche = 3 (bassa risoluzione, veloce), e l&#39;esecuzione di una scansione singola . Dopo la scansione, deselezionare l&#39;opzione. </li><li> Impostare un metodo di sedimentazione di equilibrio (&quot;Methotasto &quot;) d per girare alla prima velocità calcolata al punto 2.1.3, a 20 ° C, e raccogliere 1 scansione ogni 30 minuti. In &quot;Detail&quot; reciproche cellule, specificare la raccolta di dati a bassa risoluzione come al punto 2.3.2. Monitorare i progressi equilibrio aprendo i file di dati in HeteroAnalysis e selezionando la funzione &quot;Match&quot;, dopo almeno 18 ore (circa durante la notte, Fig. 4). Nota: raggiungimento dell&#39;equilibrio può richiedere tempo sostanzialmente più lunga per la prima velocità, mentre le velocità successive avranno meno tempo. </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig4.jpg" /> Figura 4. I risultati di funzione HeteroAnalysis Match. La prima e la seconda velocità (in alto a sinistra e destra) sembrano aver raggiunto l&#39;equilibrio, ma è meglio aspettare qualche ora in più per essere sicuri. In confronto, il terzo e il quarto le velocità (in basso a sinistra ea destra) hanno chiaramente raggiunto l&#39;equilibrioin un tempo più breve. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52404/52404fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Una volta che l&#39;equilibrio è stato raggiunto, raccogliere una singola scansione ad alta risoluzione, ad esempio con passo radiale = 0,001 centimetri, Repliche = 10 (alta risoluzione, lento). </li><li> Dopo la scansione è completata, ripetere il punto 2.3.3 e 2.3.4 per la velocità successiva. </li><li> Facoltativamente, quando il tempo necessario per raggiungere l&#39;equilibrio per ogni velocità è noto (calcolata o per esperienza), impostare il metodo di scansione di sedimentazione di equilibrio a tutte le velocità calcolate nel passo 2.1.3 e per raccogliere 1 scansione dopo il tempo di equilibrio per ogni velocità. In questo caso, specificare raccolta di dati ad alta risoluzione in &quot;dettaglio&quot; reciproche cellule. </li></ol> 2.4. L&#39;analisi dei dati in SEDFIT e SEDPHAT Nota: Per ulteriori dettagli e considerazioni in lettore di analisi dei dati si riferisce to il seguente sito web: www.analyticalultracentrifugation.com. <ol><li> Aperte le scansioni ad alta risoluzione in SEDFIT (Dati | dati carico sedimentazione di equilibrio) e dividere i dati in 3 canali (queste corrispondono a diverse concentrazioni per ogni campione; Opzioni | Caricamento Opzioni | Salva 6 canali di dati grezzi in 3 sottoinsiemi). </li><li> Riaprire i file di dati che appartengono allo stesso campione e la stessa concentrazione, ma diverse velocità in SEDFIT. Regolare il menisco (linea rossa verticale), fondo cella (verticale linea blu) e limiti di montaggio (linee verdi verticali), ed esportare i dati per l&#39;utilizzo in SEDPHAT (Dati | Esportazione dati per SEDPHAT). Ingresso i parametri calcolati nel passaggio 2.1.1, così come il tipo di rotore e tipo fulcro come richiesto. Ripetere questa operazione per ogni campione e la concentrazione. </li><li> Aprire tutti i dati dallo stesso campione (tutti concentrazioni e velocità) in SEDPHAT e compilare parametri dell&#39;esperimento; un esempio è mostrato in Fig. 5. Nota: quando viene aggiunto D 2 O nel buffer, Deut<html> razione di protoni scambiabili potrebbe alterare significativamente il peso molecolare della proteina, in particolare per le proteine ​​solubili in acqua. Le proteine ​​di membrana, in particolare quelle di piccole dimensioni come la proteina SH, sono meno colpiti perché le regioni di membrana-embedded sono protetti dallo scambio. Per correggere questo, inserire il &quot;buffer D frazione molecolare&quot;. Nota: A questo punto si consiglia di salvare il set di dati modificato separatamente selezionando menu Dati | copiare tutti i dati e salvare come nuova configurazione. </li><li> Selezionare un modello e compilare parametri globali per quel modello. Nota: Ad esempio, il modello &quot;monomero-n-Mer Self-associazione&quot; ei suoi parametri sono mostrati in Fig. 6. </li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52404/52404fig5.jpg" /> Figura 5. Un esempio su come compilare parametri sperimentali. files / ftp_upload / 52404 / 52404fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6. Un esempio di come compilare parametri globali per il modello monomero-n-Mer Self-Association. <ol><li> Eseguire un globale Fit selezionando il menu Fit | globale Fit e attendere che converge in forma. Annotare (o prendere uno screenshot) i risultati di montaggio, in particolare la riduzione del chi-quadrato globale e log K a valori. Estrarre altri dati, come i dati in forma e residui di montaggio dal menu Copia e display | display termodinamico informazioni. </li><li> Torna a parametri globali e verificare M (1) in base al peso molecolare monomero e ripetere il punto 2.4.5. Annotare il peso molecolare, arredata e globale ridotta chi-quadrato. </li><li> Ripetere il punto 2.4.3 a 2.4.6 per ogni modello da testare e confrontare la qualità adattamento di ogni modello confrontando il valore ridotto chi-quadro globale e residui di montaggio. Nota: I piccoli e casuali residui di montaggio indica generalmente una buona misura, e il modello che si adatta meglio sarebbehanno la più piccola ridotta chi-quadrato globale. Il peso molecolare monomero arredata e il suo valore chi-quadrato non dovrebbero differire in modo sostanziale da quello del (teorica) di peso molecolare fisso. </li><li> Calcola l&#39;intervallo di confidenza per il registro ottenuto Ka per valore selezionando prima Statistiche | Critical chi-quadrato per le proiezioni di superficie errore e inserendo l&#39;intervallo di confidenza desiderato. Poi, vai a Statistiche | Generare 1-dimensionale proiezione in superficie di errore e deselezionare il login Ka in dialogo parametri globali per ottenere i valori di chi-quadrato per log Ka. Nota: i lettori sono invitati a consultare le seguenti fonti (http://www.analyticalultracentrifugation.com/ sedphat / statistics.htm) per maggiori dettagli sul metodo 32 e illustrazione di questo metodo 33. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento fornisce un protocollo sperimentale per la preparazione e l&#39;analisi di oligomerizzazione di una piccola proteina di membrana in detergente utilizzando equilibrio sedimentazione campione. Il protocollo descritto è ugualmente valido -e simpler- per proteine ​​solubili, non è necessaria la fase corrispondente densità. Infatti, il sistema è costituito da una miscela di detergente e proteine. Per condurre studi sedimentazione, il detergente deve essere invisibile al campo gravitazionale modo che non cont...

Ultracentrifugazione analitica 1-5 è uno dei metodi più importanti per studiare le interazioni di macromolecole in condizioni fisiologiche, essendo accessibile sia interazioni deboli e forti. Il metodo è privo di etichetta e utilizza assorbimento della luce o interferenze, e anche sistemi ottici fluorescenza può essere utilizzata per accedere intervalli di concentrazione di diversi ordini di grandezza 6. Questo metodo è particolarmente utile in quanto la maggior parte dei processi biochimici dipendono interazioni reversibili. La stechiometria e la forza di tali interazioni devono essere caratterizzate quantitativamente comprendere processi biologici, e un certo numero di metodi esistono per questo scopo 7, 8. Tuttavia, interazioni transienti sono difficili da studiare 9. La scelta di un metodo per caratterizzare le interazioni macromolecolari dipende dalla sua natura statica o dinamica. Nel primo caso, Sedim<html> velocità entazione (SV) viene utilizzato, dove la velocità di trasporto radiale viene misurato e complessi sono frazionata sulla base delle differenze di massa galleggiante e forma. Al contrario, le associazioni dinamiche che sono reversibili sulla scala temporale dell&#39;esperimento non possono essere separati fisicamente. In questo caso, auto o etero-interazioni conducono a interazioni non-covalenti sono in un equilibrio che dipende dalla concentrazione totale di proteine. Queste interazioni dinamiche possono essere studiati sia equilibrio di sedimentazione (SE) e la velocità di sedimentazione (SV) 10. Tuttavia, il primo metodo è semplice da eseguire e viene descritto qui. In SE, centrifugazione viene eseguita ad una velocità sufficientemente bassa in modo da raggiungere un equilibrio tra diffusione e sedimentazione. A questo punto, il profilo di equilibrio di un segnale ottico (UV-VIS) in funzione della distanza radiale, può essere analizzato usando modelli termodinamici pre-impostato per associazioni 11. ve_content &quot;&gt; Nel presente documento, uno studio sedimentazione equilibrio è presentato di auto-associazione di una proteina di membrana virale che forma canali ionici. A causa della sua idrofobicità, l&#39;esperimento viene eseguito in presenza di detergente, e in questo caso la densità di solvente deve essere abbinato a quello del detergente. Tuttavia, il protocollo descritto sarebbe identica nel caso di una proteina solubile in acqua, salvo che nessuna corrispondenza densità solvente sarebbe necessaria. La proteina utilizzata è codificato nel virus sinciziale respiratorio umano (HRSV), un pneumovirus avvolto nel famiglia Paramyxoviridae che causa malattie respiratorie del tratto inferiore nei bambini, anziani e delle popolazioni di tutto il mondo 12 immunocompromessi. Fino a 64 milioni di casi segnalati di infezione HRSV e 160.000 decessi si verificano ogni anno. Il genoma HRSV trascrive 11 proteine, comprese le tre proteine ​​di membrana F, G, e piccola idrofoba (SH). Proteina SH è coinvoltanella patogenesi dell&#39;infezione RSV. RSV manca il gene SH (RSVΔSH) è vitale, ha causato la formazione di sincizi e crebbe così come la wild-type (WT) virus 13-16. Tuttavia, virus RSVΔSH replicato 10 volte meno efficiente rispetto al WT nel tratto respiratorio superiore 15, 16. Inoltre, il virus è stato attenuato in RSVΔSH nel topo vivo e modelli scimpanzé 13, 17. La proteina SH è un (RSV sottogruppo A) 64 o 65 (RSV sottogruppo B) aminoacidi lungo tipo II proteina integrale di membrana che si accumula prevalentemente alle membrane del vano 18 Golgi. Proteina SH ha un unico previsto a-elica transmembrana (TM) di dominio 19, che è altamente conservata 20,21. I domini extramembrane C- e N-terminale sono orientati lumenally / extracellulare e cytoplasmically rispettivamente. Entrambi dominio TM sintetico (residui 18-43) E lunghezza piena SH proteine ​​hanno dimostrato di formare homopentamers in una varietà di detergenti. La forma homopentameric è responsabile per l&#39;attività del canale in doppi strati lipidici planari 22,23. Il corretto orientamento dei monomeri TM nel doppio strato lipidico è stato determinato in primo luogo con specifico sito dicroismo infrarossi 23, che ha mostrato la sua-22 per essere in un lumenal, vicino a inter-elica, orientamento. Lo stesso orientamento dominio TM è stato confermato da studi NMR che ricostruibili la pentamerica a-elica fascio della proteina intera lunghezza in dodecylphosphocholine (DPC) micelle 22. In questo modello di &#39;micelle&#39;, un singolo a- dominio TM elicoidale era affiancato N-terminale da un a-elica, e C-terminale da un esteso b-tornante. I due residui protonatable di proteine ​​SH, His-22 e His-51, si trovano nel dominio TM (lumenally orientato), e sulla punta del extramembrane C-terminale β forcella (lontano dal poro canale), rispettivamente. In un enviro bicellarnment, tuttavia, il TM α-elica si estende fino a His-51, ed entrambi i suoi residui sono accessibili al lume del canale 24. La struttura del canale adotta un imbuto architettura 22, dove la strozzatura (Ser-Cys-29 a 45) 22 è allineato con catene laterali idrofobiche (Ile-32, Ile-36, Ile-Leu-40 e 44), e Ile-36 definisce il punto più stretto nel lume del canale. His-22 si trova presso la più grande apertura di questo imbuto, che His-51 è sulla punta della piccola apertura. Nel presente documento, centrifugazione analitica in una modalità sedimentazione equilibrio è stato usato per determinare se la sua protonazione influisce sulla stabilità della proteina pentamero SH. In questo caso, la proteina SH è stato solubilizzato in detersivo C14-betaina, che è stato utilizzato in precedenza per dimostrare che le forme della proteina SH oligomeri pentamerica 22.

<table><tbody><tr><td>3-(N,N-dimetilmiristiliammonio)propansulfonato</td><td>Sigma</td><td>T0807</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio 99,8%</td><td>Cambridge Isotope</td><td>DLM-4-99.8</td><td></td></tr><tr><td>An-50 Ti Rotore, analitico, 8 posti</td><td>Beckman Coulter</td><td>363782</td><td></td></tr><tr><td>An-60 Ti Rotor, analitico, 4 posti</td><td>Beckman Coulter</td><td>361964</td><td></td></tr><tr><td>Alloggiamento cella</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>334784</tr><tr><td>Centrotavola a sei canali da 12 mm, epon</td><td>Beckman Coulter</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>Portafinestra</td><td>Beckman Coulter</td><td>305037</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione finestra</td><td>Beckman Coulter</td><td>327021</td><td></td></tr><tr><td>Rivestimento finestra</td><td>Beckman Coulter</td><td>362329</td><td></td></tr><tr><td>Finestra zaffiro</td><td>Beckman Coulter</td><td>307177</td><td></td></tr><tr><td>Finestra in quarzo</td><td>Beckman Coulter</td><td>301730</td><td></td></tr><tr><td>Rondella ad anello a vite</td><td>Beckman Coulter</td><td>362328</td><td></td></tr><tr><td>Anello a vite</td><td>Beckman Coulter</td><td>301922</td><td></td></tr><tr><td>Spinkote</td><td>Beckman Coulter</td><td>306812</td><td></td></tr><tr><td>Gruppo supporto di coppia</td><td>Beckman Coulter</td><td>361318</td><td></td></tr><tr><td>Contrappeso</td><td>Beckman Coulter</td><td>360219</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di allineamento cellulare</td><td>Beckman Coulter</td><td>362340</td><td></td></tr><tr><td>SEDNTERP</td><td></td><td></td><td>http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page</td></tr><tr><td>HeteroAnalysis&nbsp;</td><td></td><td></td><td>http://www.biotech.uconn.edu/auf/?i=aufftp</td></tr><tr><td>SEDFIT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedfit.htm</td></tr><tr><td>SEDPHAT</td><td></td><td></td><td>http://www.analyticalultracentrifugation .com/sedphat/default.htm</td></tr></tbody></table>

sedimentazione equilibrio di una membrana piccolo oligomer-forming proteine: effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Ultracentrifugazione analitica (AUC) può essere usato per studiare le interazioni reversibili tra macromolecole su una vasta gamma di forze di interazione e in condizioni fisiologiche. Questo rende AUC un metodo di scelta per valutare quantitativamente stechiometria e termodinamica di omo- ed etero-associazione che sono transitori e reversibili in processi biochimici. Nella modalità di sedimentazione equilibrio (SE), un equilibrio tra diffusione e sedimentazione fornisce un profilo in funzione della distanza radiale che dipende da un modello di associazione specifico. Qui, un protocollo dettagliato SE è descritto per determinare le dimensioni e monomero-monomero associazione energia di una piccola proteina di membrana oligomero utilizzando un&#39;ultracentrifuga analitica. AUC-ES è privo di etichetta, basata solo su principi fisici, e può essere utilizzato su entrambe le proteine ​​solubili e di membrana acqua. Un esempio è mostrato di quest&#39;ultimo, la piccola idrofoba (SH) proteina del virus sinciziale respiratorio umano (HRSV), Un polipeptide di 65 aminoacidi con un singolo transmembrana (TM) dominio α-elica che forma canali ionici pentamerica. Dati strutturali a base di NMR mostra che la proteina SH ha due protonatable suoi residui nel suo dominio transmembrana che sono orientate ad affrontare il lume del canale. Esperimenti SE sono stati progettati per determinare come pH influenza costante di associazione e la dimensione oligomerica di proteine ​​SH. Mentre la forma pentamerica stata conservata in tutti i casi, la costante associazione è stata ridotta a pH basso. Questi dati sono in accordo con una simile dipendenza pH osservato per l&#39;attività del canale SH, in linea con un orientamento lumenal dei due suoi residui in proteine ​​SH. Quest&#39;ultima può verificare la repulsione elettrostatica e ridotto la stabilità oligomeri a basso pH. In sintesi, questo metodo è applicabile quando informazioni quantitative sottili proteina-proteina associazione cambiamenti nelle condizioni fisiologiche devono essere misurate.

Il profilo radiale distribuzione di C14SB micelle detergenti in Tris 50 mM, NaCl 100 mM pH 7.3 forma un esponenziali molto superficiale che può essere montato su un modello lineare (Figura 7A). La pendenza di questa distribuzione è inversamente correlato alla concentrazione di D 2 O (Figura 7B). Il punto in cui la pendenza è zero, vale a dire, l&#39;abbinamento D 2 O concentrazione, è risultato essere 32,3%. Vedi Figura...

L'equilibrio di sedimentazione (SE) può essere utilizzato per studiare le interazioni proteina-proteina in un ambiente fisiologico. Questo manoscritto descrive l'uso di questa tecnica per determinare l'effetto del pH sulla stabilità di un omo-pentamero formato dalla piccola proteina idrofobica (SH) codificata dal virus respiratorio sinciziale umano (hRSV).

Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è determinare le dimensioni dell'oligomero formato da un piccolo polipeptide idrofobico nel detergente C 14 sulfalane e la stabilità di questo oligomero quando il pH viene modificato. Questo viene ottenuto innanzitutto determinando quale concentrazione di ossido di deuterio corrisponde alla densità delle micelle di detergente, neutralizzandone così la galleggiabilità. Come secondo passo, viene eseguita una serie di esperimenti di equilibrio di sedimentazione sui campioni del piccolo proteina idrofobica solubilizzata.Nel detergente C 14 sulfalano, si esegue la corsa con la concentrazione determinata di detergente ossidato. Successivamente, si ripetono il primo e il secondo passaggio a un pH diverso, al fine di confrontare il profilo di sedimentazione della proteina a questi diversi valori di pH. I risultati mostreranno sia la dimensione oligomerica della piccola proteina idrofobica in questo detergente sia l'effetto del pH sulla stabilità di questo oligomero nel detergente C 14 sulfalano.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché comprende diversi passaggi, come l'assemblaggio, il caricamento delle cellule, il bilanciamento della densità cellulare e il raggiungimento delle condizioni di equilibrio, che possono facilmente sopraffare e confondere gli utenti alle prime armi. Ogni piccolo errore in questi passaggi potrebbe potenzialmente far sprecare diversi giorni di tempo sperimentale. La procedura verrà dimostrata da Suria, una studentessa di dottorato del mio laboratorio.Preparare innanzitutto un buffer 10x e un detergente 50x. Preparare le soluzioni stock e sterilizzarle mediante filtrazione attraverso un filtro da siringa da 0,2 micrometri in un einor da 1,5 millilitri partendo dalle soluzioni stock di buffer 10x e detergente 50x. Preparare 200 microlitri di tre soluzioni campione separate contenenti rispettivamente il 10%, il 30% e il 50% di ossido di deuterio in volume.Per assemblare una cella analitica a sei canali per ultracentrifugazione senza riempimento esterno, inserire la guarnizione della finestra nel supporto della finestra, piegare leggermente il rivestimento della finestra e posizionarlo nel supporto in modo che l'interstizio si formi opposto rispetto al supporto della finestra. Dopodiché, posizionare una finestra in zaffiro all'interno del rivestimento della finestra, allineando il segno con il supporto della finestra. Posizionare quindi il corpo dell'alloggiamento, con il numero di pezzo rivolto verso il basso, in modo che le scanalature siano allineate con quelle del corpo.Fare scivolare un elemento centrale a sei settori con il lato smussato verso il basso all'interno dell'alloggiamento della cella, seguito da un insieme finestra con la finestra rivolta verso il basso. Successivamente, applicare leggermente sulle filettature dell'anello a vite e sulla rondella dell'anello a vite un lubrificante per rivestimento rotante. Posizionare una rondella dell'anello a vite sopra l'insieme finestra. Installare l'anello a vite nell'alloggiamento della finestra con la scritta "out" rivolta verso l'esterno, quindi stringere a mano l'anello a vite utilizzando l'apposito strumento di allineamento della cella.Quindi serrare l'anello a vite solo a 60 inch pounds utilizzando la chiave dinamometrica. Successivamente, posizionare una cella con il numero di serie in posizione verticale alle ore 12. Caricare 120 microlitri di soluzione di riferimento nelle file di sinistra e 110 microlitri di soluzione campione nelle file di destra.Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, assicurarsi che ogni campione e riferimento siano correttamente abbinati con attenzione. Inserire un'unità finestra con la finestra rivolta verso il basso nell'alloggiamento della cella, avendo cura di non disturbare eccessivamente la cella poiché ciò potrebbe far fuoriuscire il contenuto. Ripetere i passaggi precedenti, serrando il secondo anello a vite a 120 inch pound.Quindi capovolgere la cella e riavvitare l'anello della prima vite a 120 inch pound. Caricare le celle nel rotore. Installare il rotore nella centrifuga e installare il monocromatore secondo le istruzioni del produttore.Dopo aver raggiunto un vuoto sufficiente, far girare la centrifuga a 3000 giri al minuto. Anticipare il modello di interferenza nel software dell'interfaccia utente e regolare i parametri del laser per ottenere il contrasto più elevato. Successivamente, creare un nuovo file di configurazione, specificando la misurazione di equilibrio e di interferenza.Impostare un metodo di equilibrio di sedimentazione da eseguire a 45.000 giri al minuto o alla velocità massima prevista per i campioni proteici, con una temperatura di esecuzione di 20 gradi Celsius. Dopo averne acquisito uno, eseguire una scansione ogni 15 minuti per almeno 12 ore. Monitorare l'andamento verso l'equilibrio aprendo i file di dati nell'analisi eterogenea e selezionando la funzione di sovrapposizione. A questo punto, assemblare una cella per ultracentrifugazione analitica a sei canali con finestre in quarzo, nello stesso modo descritto in precedenza.Utilizzando punte per caricamento su gel, caricare il campione di proteina idrofobica piccola precedentemente preparato con la concentrazione più elevata nel canale più vicino al centro del rotore, e il campione con concentrazione più bassa nel canale più lontano dal centro del rotore. Per configurare la misurazione dell'assorbanza, creare un nuovo file di impostazione specificando l'equilibrio e la misurazione dell'assorbanza. Impostare 280 nanometri come lunghezza d'onda del rivelatore.In seguito, eseguire una calibrazione radiale a 3000 giri/min verificando la calibrazione radiale prima della prima scansione e le opzioni di scansione. Impostare la raccolta dati a bassa risoluzione ed eseguire una singola scansione. Al termine della scansione, deselezionare l'opzione.Impostare un metodo di equilibrio di sedimentazione da eseguire alla prima velocità precedentemente calcolata a 20 gradi Celsius, raccogliendo una scansione ogni 30 minuti per ogni dettaglio della cella. Specificare la raccolta dati a bassa risoluzione dopo almeno 18 ore. Monitorare l'andamento dell'equilibrio aprendo i file di dati nell'analisi eterogenea e selezionando la funzione di sovrapposizione una volta raggiunto l'equilibrio.Acquisire una singola scansione ad alta risoluzione al termine della scansione. Ripetere i passaggi precedenti per la velocità successiva quando è noto il tempo necessario per raggiungere l'equilibrio per ciascuna velocità. Impostare il metodo di equilibrio di sedimentazione Scansione in modo da includere tutte le velocità calcolate in precedenza e da acquisire una scansione dopo il tempo di equilibratura per ciascuna velocità.In questo caso, specificare la raccolta di dati ad alta risoluzione in ogni dettaglio cellulare della distribuzione radiale del detergente C 14 sultan nelle mie cellule e del tampone fosfato di sodio 50 molare. A pH 7,3 si forma un'esponenziale molto lieve che può essere adattata a un modello lineare. L'inclinazione di questo profilo dipende dalla concentrazione di ossido di deuterio e la concentrazione che produce un'inclinazione nulla è risultata essere del 32,3%. Lo stesso esperimento è stato ripetuto a pH 5,5 e pH 3 per ottenere concentrazioni corrispondenti di ossido di deuterio rispettivamente del 30,3% e del 41%.A pH 7,3, si è osservato che la piccola proteina idrofobica e il detergente formano pentameri con un logaritmo apparente della costante di affinità pari a 21,05. La costante di associazione non è cambiata a pH 5,5, ma è risultata significativamente ridotta a pH 3. Questo è in accordo con studi precedenti che mostrano una diminuzione della conduttanza a pH più bassi, con un pK di circa 4,5.Una volta acquisita padronanza nell'assemblaggio delle celle a equilibrio, il caricamento e l'allestimento dell'esperimento possono essere completati in un'ora, se eseguiti correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe essere in grado di comprendere bene come preparare un esperimento di equilibrio di sedimentazione, in modo da determinare la dimensione oligomerica della propria proteina di membrana e confrontare la stabilità in diverse condizioni sperimentali.

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Questo articolo dettagli video la procedura sperimentale per ottenere l'energia libera di Gibbs di ripiegamento delle proteine ​​della membrana da triptofano fluorescenza.

Termodinamica di Folding delle proteine ​​di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza

Una procedura efficace per valutare la propensione oligomerizzazione del single-pass domini transmembrana (TMD) è descritta. Proteine ​​chimeriche costituito dalla TMD fusa ToxR sono espressi in un ceppo di E. coli giornalista. TMD indotta oligomerizzazione cause dimerizzazione di ToxR, l'attivazione della trascrizione e la produzione della proteina reporter-galattosidasi.

Transmembrana Oligomerizzazione Propensione dominio determinato dal saggio ToxR

Proteine ​​conformazione e la dinamica sono la chiave per comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle proteine. Scambio idrogeno accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione è un metodo versatile per studiare le dinamiche conformazionali di proteine ​​e caratterizzazione della proteina-ligando e proteina-proteina interazioni, comprese le interfacce di contatto ed effetti allosterici.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

Canali per il trasporto di molecole d'acqua in enzimi influenzano sito solvatazione attiva e catalisi. Qui vi presentiamo un protocollo per la progettazione di questi motivi catalitici aggiuntivi sulla base di modelli al computer in silico e sperimentazione. Ciò permetterà di migliorare la nostra comprensione della influenza delle dinamiche del solvente sulla catalisi enzimatica.

Svelare entropico velocità di accelerazione indotta da solventi Dynamics a membrana Enzimi

Molte proteine svolgono la loro funzione quando sono attaccate alle superfici della membrana. Il legame di proteine estrinseche sulle membrane dei nanodischi può essere indirettamente ripreso mediante microscopia elettronica a trasmissione. Mostriamo che il caratteristico impilamento (rouleau) dei nanodischi indotto dal fosfotungstato di sodio con colorazione negativa è impedito dal legame della proteina estrinseca.

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Questo protocollo viene illustrato come ottenere un modello a bassa risoluzione ab-initio e dettagli strutturali di una proteina di membrana detergente-solubilizzato in soluzione mediante scattering di neutroni piccolo angolo con contrasto-corrispondenza del detergente.

Contrasto-Matching detergente in esperimenti di Scattering di neutroni Small-Angle per Ab Initio modellazione e analisi strutturale di proteine di membrana

Un protocollo è presentato per testare rapidamente la stabilità termica delle proteine in una varietà di condizioni attraverso analisi termica spostamento e nano differenziale a scansione fluorimetria. Sistemi di polmonatura, sali e additivi, insieme che comprende tre schermate di stabilità unica, sono analizzati con le proteine per identificare buffer adatto per studi strutturali e funzionali.

Come stabilizzare proteina: stabilità schermi per Thermal Shift saggi e Nano differenziale a scansione fluorimetria nel progetto Virus-X

Questo protocollo è stato sviluppato per studiare la transizione dimero-dodecamero di TmPep1050, un'amminopeptidasi M42, a livello strutturale. È una pipeline semplice che parte dalla purificazione delle proteine all'elaborazione dei dati a raggi X. La cristallogenesi, l'indicizzazione del set di dati e la sostituzione molecolare sono state enfatizzate attraverso un caso di studio, variante TmPep1050H60A H307A.

Cristallografia a raggi X per studiare la transizione di stato oligomerica della termotoga maritima M42 Aminopeptidasi TmPep1050

Questo protocollo descrive la formazione di doppi strati lipidici supportati e l'aggiunta di filamenti citoscheletrici e proteine motorie per studiare la dinamica delle reti citoscheletriche ricostituite e legate alla membrana utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Ricostituzione di cortecce di actina minima legate alla membrana su doppi strati lipidici supportati

È stato dimostrato che molte proteine intrinsecamente disordinate partecipano alla formazione di condensati biomolecolari altamente dinamici, un comportamento importante per numerosi processi cellulari. Qui, presentiamo un metodo basato sull'imaging a singola molecola per quantificare le dinamiche con cui le proteine interagiscono tra loro nei condensati biomolecolari nelle cellule vive.

Misura a singola molecola delle dinamiche di interazione proteica all'interno di condensati biomolecolari

Scopri la sedimentazione all'equilibrio per studiare l'oligomerizzazione di proteine idrofobiche e la stabilità del pentamero in funzione del pH. Questo metodo biochimico rivela come la protonazione dell'istidina influenzi le interazioni proteiche.

Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità (Video) | JoVE Journal

Sedimentazione equilibrio di una membrana Piccolo Oligomer-forming Proteine: Effetto di istidina protonazione su pentamerica stabilità

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